黃勤清， 黃曉梅

福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院，福建 福州350119

在微生物農(nóng)藥中，蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是目前應用廣泛的微生物殺蟲劑之一，可以產(chǎn)生殺蟲蛋白晶體(insecticidal crystal proteins， ICPs)(黃勤清，2008； Huang et al.，2018)。Bt 對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等多種昆蟲有毒殺活性，害蟲不易產(chǎn)生抗性，成本低，便于工業(yè)化生產(chǎn)，不污染環(huán)境(張巧鈴等，2015)。

Bt 分布廣泛，可分離自昆蟲、土壤、植物和水環(huán)境等(徐卓吟等，2016)。 近年來，對許多國家大量生境進行調查發(fā)現(xiàn)，雖然Bt 最初發(fā)現(xiàn)于染病地中海粉螟Ephestia kuehniella Zeller，但Bt 的存在和昆蟲沒有必然聯(lián)系，這種細菌依然大量存在于一些沒有昆蟲的環(huán)境中(張靈玲等，2008)。 Bt 對蚊蟲也有較好的防治效果(Ben-Dov，2014)。 研究學者已經(jīng)分離出了大量的Bt 菌株，但新菌株的篩選仍在繼續(xù)。 這是因為雖然害蟲對Bt 高度敏感，但現(xiàn)有Bt 菌株仍然無法防治其他大量害蟲。 因此，繼續(xù)分離新的高效特效Bt 菌株十分必要(黃勤清等，2006； 魏華等，2018；Sun ＆ Yu，2000)。 武夷山是國家保護區(qū)，有寶貴的微生物菌種資源。 因此，本研究從武夷山等福建省多個地區(qū)采集土壤樣品，從中分離純化得到71 株Bt 新菌株，并研究其對致倦庫蚊Culex quinquefasciatus Say 的殺蟲效果，以期進一步豐富Bt 菌種資源，為高效殺蚊微生物制劑的研發(fā)奠定良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 分離培養(yǎng)基 培養(yǎng)基BPA：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，乙酸鈉34 g，加ddH2O 至1000 mL，pH 值7.2～7.4。 培養(yǎng)基BP：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，瓊脂18 g，NaCl 5 g，加水至1000 mL，pH 值7.0 ～7.2。1/2 LB 培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母粉2.5 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，加水至1000 mL，pH 值7.0～7.2。

1.1.2 實驗藥劑 2 g·mol-1NaAc；100 mg·mL-1青霉素鈉鹽；復紅染色劑(100 mL)： 堿性品紅(0.1 g)+95%酒精(10 mL)+3%苯酚水溶液(90 mL)。

1.1.3 土壤樣品 從福建省武夷山自然保護區(qū)、建陽、建甌、浦城等地區(qū)采集土壤樣品分離與純化Bt。

1.1.4 供試昆蟲 以4 齡致倦庫蚊進行生物測定，試蟲由福建農(nóng)林大學生物農(nóng)藥研究中心提供。

1.1.5 實驗主要儀器 DYC-28C 型電泳槽、HHW21-600 型電熱恒溫水浴鍋、HQ-45A 恒溫搖床和BACKMAN 離心機。

1.2 方法

1.2.1 土壤樣品采集 采集地表5 cm 以下的土壤進行菌株分離，將土樣放入干凈的自封袋，帶回實驗室開展菌株分離等工作。

1.2.2 Bt 菌株分離和鏡檢 稱取0.1 g 土壤放入BPA 培養(yǎng)基中，并加入100 mg·mL-1青霉素鈉鹽80 μL，2 g·mol-1NaAc 325 μL，置于搖床上(溫度33.2 ℃；轉數(shù)130 r·min-1)培養(yǎng)42 h 后取下，取200 μL 菌液裝入離心管于75～80 ℃水浴中熱處理10～15 min， 稍微靜置后冰浴5 min，吸0.2 mL 于BP 平板上，均勻涂布，倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。 挑選5 個類似于Bt 的菌落(干燥、不透明、乳白色、均一或邊緣有缺刻)接種到BP 斜面上，30 ℃培養(yǎng)72 h。 用復紅染色劑染色進行鏡檢。

1.2.3 Bt 菌株殺蚊生物測定 用0.85%的NaCl 將培養(yǎng)2 d 的Bt 菌株稀釋至D600nm為0.1。 取1 mL 加入50 mL 蒸餾水中，放入45 只致倦庫蚊4 齡幼蟲，放置于25 ℃恒溫箱48 h 后，記錄致倦庫蚊Ⅳ齡幼蟲的死亡數(shù)。 重復3 次，用無菌水做對照。

1.2.4 高效殺蚊Bt 菌株部分殺蟲基因檢測 以高效殺蚊菌株的總DNA 為模板，利用通用引物分別PCR 擴增部分cry 基因和幾丁質酶基因等殺蟲基因。 其中，cry5、cry6、cry8 和cry11 基因的引物cry5F/cry5R、cry6F/cry6R、cry8F/cry8R 和cry11F/cry11R 參考黃天培(2006)的實驗設計；cry1、cry7、cry9 基因的引物K5un2/K3un2 和K5un3/K3un3，cry1I 基因的引物S5uni/S3uni，cry2 基因的引物S5un2/S3un2，cry4、cry10 基因的引物S5un4/S3un4參考前人文獻(宋福平等，1998；Kuo ＆ Chak，1996；Song et al.，2003)；幾丁質酶基因的引物參考Bt WB7 的序列(GenBank 登錄號AY074882)設計Chi-F(5′-GGAATTCATGGCTATGAGGTCTC-3′)和Chi-R(5′-CCCAAGCTT CTAGTTTTCGCTAATG-3′) ( 駱蘭，2008)。

1.2.5 高效殺蚊Bt 菌株殺蟲晶體蛋白檢測 參考張靈玲等(2008)的方法分離殺蟲晶體蛋白，利用SDS-PAGE 進行檢測。

2 結果與分析

2.1 Bt 新菌株資源的采集與鑒定

從武夷山自然保護區(qū)等福建省內各地采集的125 份土壤樣品中分離Bt。 Bt 芽胞為橢圓形，殺蟲晶體蛋白以菱形為主(圖1)。 具有上述特征的菌株初步鑒定為Bt。 共純化得到71 株Bt 新菌株。由此可見，Bt 普遍存在于土壤中，福建省具有豐富的Bt 菌種資源。

圖1 Bt QQ66(A)和QQ92 形態(tài)(B)Fig.1 Morphology of Bt QQ66 (A)and QQ92(B)

2.2 Bt 菌株殺蚊生物測定

生物測定結果表明，共有4 個Bt 新菌株對致倦庫蚊有效，死亡率均達50%以上，其中菌株QQ66和QQ92 殺蟲效果最好，校正死亡率均達到100%，而QQ13 和QQ42 的殺蟲效果相對較差，分別是64.4%和57.8%(表1)。

2.3 高效殺蚊Bt 菌株QQ66 和QQ92 部分殺蟲基因檢測

殺蟲基因PCR 產(chǎn)物電泳檢測結果表明，QQ66和QQ92 菌株均有約2 ku 大小的幾丁質酶基因(圖2)，沒有檢測到cry1、cry1I、cry2、cry4、cry5、cry6、cry7、cry8、cry9、 cry10 和cry11 基因。

表1 對致倦庫蚊4 齡幼蟲有效Bt 菌株的生物測定Table 1 Bioassay of Bt isolates effective against 4th instar larvae of C. quinquefasciatus(n=45 in all tests)

圖2 Bt 菌株QQ66 和QQ92 幾丁質酶基因PCR 產(chǎn)物電泳Fig.2 Electrophoresis of PCR products of chitinase genes from Bt QQ66 and QQ92

2.4 高效殺蚊Bt 菌株QQ66 和QQ92 殺蟲晶體蛋白檢測

對QQ66 和QQ92 菌株進行SDS-PAGE 檢測，發(fā)現(xiàn)QQ66 和QQ92 菌株在75～100 ku 處各有一條殺蟲晶體蛋白條帶(圖3)。

3 討論

近年來，隨著可持續(xù)發(fā)展觀的深入人心，保護環(huán)境、提高環(huán)境質量成為全人類的共識。 在生物農(nóng)藥中，研究最深入、使用最廣泛的首推Bt(姚榮英，2009； Dai et al.，2016)。

要開發(fā)出高效的微生物殺蚊劑，關鍵是要有自己的優(yōu)良生產(chǎn)菌種。 尋找高效菌株對我國生物殺蟲劑的生產(chǎn)有著十分重要的意義(Huang et al.，2018)，研究人員也不斷地在尋找從不同材料上分離Bt 的新方法。 本研究以武夷山自然保護區(qū)為主要采集區(qū)，采集到的125 份土壤樣品中分離出Bt 71 株。 結果表明，Bt 普遍存在于土壤中。

圖3 Bt 菌株QQ66 和QQ92 殺蟲晶體蛋白SDS-PAGE 分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of ICPs from Bt QQ66 and QQ92

由于雙翅目的蚊蟲傳播著各種疾病，使得全世界半數(shù)以上的人口受到其傳播的疾病的威脅。 每年數(shù)億人受蚊媒疾病的折磨，其中有幾百萬人被奪去生命，因此，它是人類生存和健康的大敵(Zhang et al.，2017)。 本研究以致倦庫蚊4 齡幼蟲作為雙翅目靶標害蟲進行生物毒力測定，得到4 株毒性較高的菌株，其中QQ66 和QQ92 菌株均具有較高的殺蟲活性。

QQ66 和QQ92 菌株均有幾丁質酶基因，沒有檢測到cry1、cry1I、cry2、cry4、cry5、cry6、cry7、cry8、cry9、cry10 和cry11 基因，在75～100 ku 處各有一條殺蟲晶體蛋白條帶。 這說明QQ66 和QQ92 菌株可能含有較新的殺蚊cry 基因(黃天培，2006； 宋福平等，1998；Kuo ＆ Chak，1996； Song et al.，2003)。

今后，將對得到的2 株具有高殺蟲毒力的Bt菌株進一步研究，如有效基因的克隆、鑒定及表達等，以篩選和構建出具有生態(tài)、經(jīng)濟和社會效益的高效工程菌。