姜慧宇,魏 娜

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 第一手術(shù)室,吉林 長(zhǎng)春130021)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SAU )有較強(qiáng)致病性，具有分布廣、傳播途徑多樣的特點(diǎn)。近年來(lái)由于廣譜抗菌藥物的亂用及濫用，SAU耐藥性不斷增強(qiáng)，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)成為多重耐藥醫(yī)院感染最常見(jiàn)的革蘭陽(yáng)性菌，是醫(yī)院感染重點(diǎn)監(jiān)測(cè)對(duì)象[1]。金葡菌感染可以引發(fā)多種疾病，包括皮膚和軟組織感染(SSTI)、肺炎、心內(nèi)膜炎、菌血癥和敗血癥[2]。該病原體還可引起反芻動(dòng)物(牛、綿羊、山羊等)、家禽和豬的大規(guī)模感染[3]。為了對(duì)哈爾濱市動(dòng)物源性金黃色葡萄球菌的耐藥情況做一個(gè)大體性調(diào)查，以便后續(xù)的耐藥機(jī)制、傳播規(guī)律及與人型菌株的關(guān)系研究，在哈爾濱部分地區(qū)的養(yǎng)殖場(chǎng)分離鑒定了部分金黃色葡萄球菌，并測(cè)定了這些菌株對(duì)臨床常用抗菌藥物的敏感性。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及處理所有樣本于 2017年 6 月至 8月采集于南崗區(qū)1個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)(養(yǎng)雞場(chǎng)1)、1 個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)(養(yǎng)豬場(chǎng)1)，香坊區(qū) 2個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)(養(yǎng)雞場(chǎng) 2，養(yǎng)雞場(chǎng)3)、1個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)(養(yǎng)豬場(chǎng)2)和1 個(gè)養(yǎng)牛場(chǎng)(養(yǎng)牛場(chǎng) 1)，五常市1個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)(養(yǎng)雞場(chǎng) 4)和1個(gè)養(yǎng)牛場(chǎng)(養(yǎng)牛場(chǎng)2)， 賓縣1個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)(養(yǎng)豬場(chǎng)3)。對(duì)動(dòng)物糞便樣本進(jìn)行采集，用無(wú)菌棉簽取 0.3 g 左右的糞便盛于1.5 ml滅菌離心管；所有采集的樣本均置于車載冰箱中，12 h之內(nèi)進(jìn)行處理。在每個(gè)裝有樣本的離心管中加入1 ml無(wú)菌生理鹽水震蕩后靜置2 h以釋放細(xì)菌，再次震蕩混勻后吸取 0.2 ml液體于 Mueller-Hinton 高鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h。每個(gè)平板挑取 1-3個(gè)淺黃色或黃色的疑似金黃色葡萄球菌菌落劃線于 NB固體平板，37 ℃培養(yǎng)12 h后進(jìn)行革蘭染色觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2 PCR檢測(cè)根據(jù)王豪舉[4]等學(xué)者的文獻(xiàn)，合成特異性引物，上游引物為F：5′-A G GGAT GGC TATC AGTAATGTTTC- 3′，下游引物為R：5′-CATCAGCATAAATATACGCTAAGCCAC-3′。PCR 反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix 10 μl，F(xiàn)(10 μmol/L)0.5 μl，R(10 μmol/L)0.5 μl，模板 0.5 μl，ddH2O 8.5 μl，總反應(yīng)體系20 μl。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 20 s，58 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 30 s，共30 個(gè)循環(huán)；最后 72 ℃延伸 6 min。反應(yīng)結(jié)束后取 5 μl反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.3 藥敏試驗(yàn)分離的菌株對(duì)22種抗菌藥物的敏感性用紙片法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定結(jié)果參照《動(dòng)物源細(xì)菌抗菌藥物敏感性試驗(yàn)紙片法與稀釋法執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(2013版)》、《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)；第二十三版資料增刊》進(jìn)行判定，具體操作方法參照張倩[5]與楊延成[6]等學(xué)者的方法。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離結(jié)果將平板上疑似為金黃色葡萄球菌的菌落經(jīng) PCR 擴(kuò)增后，最終共鑒定出17株金黃色葡萄球菌(圖 1)，包括 10株雞源菌株(泳道 1-10)、6株豬源菌株(泳道 12-17)，1株牛源菌株(泳道 18)。在南崗區(qū)共分離5株金黃色葡萄球菌，其中養(yǎng)雞場(chǎng)1 分離雞源菌株 3 株， 記為1-3 號(hào)菌， 養(yǎng)豬場(chǎng)1分 離豬源菌株 2株，記為4，5號(hào)菌； 香 坊 區(qū)共分離7株金黃色葡萄球菌，其中養(yǎng)雞場(chǎng)2分離雞源菌株1株，記為6號(hào)菌，養(yǎng)雞場(chǎng)3分離雞源菌株2株，分別記為7號(hào)及8號(hào)菌；養(yǎng)豬場(chǎng)2分離豬源菌株3株，記為9-11號(hào)菌；養(yǎng)牛場(chǎng)1分離牛源菌株1株，記為12號(hào)菌。在五常市共分離4株金黃色葡萄球菌，均來(lái)自養(yǎng)雞場(chǎng)4，記為13-16號(hào)菌。在賓縣養(yǎng)豬場(chǎng)3分離一株豬源菌株，記為17號(hào)菌(表1)。

圖1 17株臨床分離株的PC R 鑒定結(jié)果

表1 金黃色葡萄球菌樣品采集及菌株分離

2.2 耐藥性分析17株臨床分離株動(dòng)物源性金黃色葡萄球菌的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2和表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所分離的17株金黃色葡萄球菌中14株對(duì)青霉素G耐藥，耐藥率為76%；對(duì)慶大霉素及頭孢拉定耐藥的菌株均為 10株 ，耐藥率均為59%；對(duì)阿莫西林、鏈霉素及紅霉素耐藥的菌株均有8株，耐藥率均為47%；對(duì)大觀霉素、阿米卡星、思諾沙星、乳酸環(huán)丙沙星及磺胺異惡唑等五種抗菌藥物耐藥的菌株均為7株，耐藥率為41%；對(duì)氨芐西林、卡那霉素、氧氟沙星、復(fù)方新諾明、呋喃唑酮、四環(huán)素及強(qiáng)力霉素等7種藥物耐藥的菌株數(shù)均為6株，耐藥率為35%；對(duì)諾氟沙星、林可霉素和萬(wàn)古霉素耐藥的菌株數(shù)均為5株，耐藥率為29%；對(duì)氯霉素耐藥的菌株數(shù)最少，僅為4株，耐藥率為24%。分離自南崗區(qū)的3株雞源菌株對(duì)青霉素G和頭孢拉定耐藥；2株豬源菌株對(duì)頭孢拉定和鏈霉素耐藥。

分離自香坊區(qū)的3株雞源菌株對(duì)青霉素G耐藥，且對(duì)復(fù)方新諾明表現(xiàn)敏感；3株豬源菌株對(duì)頭孢拉定耐藥，且對(duì)氧氟沙星和林可霉素較為敏感；一株牛源菌株對(duì)9種藥物耐藥。分離自五常市的4株雞源菌株對(duì)慶大霉素、復(fù)方新諾明及林可霉素的耐藥率高達(dá)75%。分離自賓縣的1株豬源菌株對(duì)22中常用藥中的10種耐藥。

所有菌株的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，β-內(nèi)酰胺類的抑菌效果較差，細(xì)菌在該類藥物中產(chǎn)生的耐藥性較高；氨基糖苷類藥物的抑菌效果較β-內(nèi)酰胺類藥物略顯優(yōu)勢(shì)，17株菌株中對(duì)該類藥物耐藥的數(shù)量較前者少；氯霉素類藥物(本實(shí)驗(yàn)特指氯霉素)的抑菌效果最好，菌耐藥率為24%，17株菌中僅四株對(duì)該藥顯示耐藥性。不同動(dòng)物來(lái)源的菌株對(duì)藥物的耐藥性并未顯示出明顯偏好性，但雞源菌株的耐藥性明顯高于豬源和牛源的菌株，牛源菌株的耐藥性普遍較前兩者低。多重耐藥菌株的耐藥特性從5種到13種不等，分別為5種、8-13種。多重耐藥多集中在9種-11種。8種、12種及13種均只有1株菌，5種和 9種各有2株菌，11種有3株菌，10種均有6株菌。10種及以上的菌株數(shù)占所有分離菌株數(shù)的65%。

表2 17株臨床分離株的抑菌圈直徑及藥物敏感性結(jié)果

A無(wú)NCCLS 標(biāo)準(zhǔn)，敏感度判定參照頭孢唑啉;B無(wú)NCCLS 標(biāo)準(zhǔn)，敏感度判定參照阿米卡星;C無(wú)NCCLS 標(biāo)準(zhǔn)，敏感度判定參照氧氟沙星;D無(wú)NCCLS 標(biāo)準(zhǔn)，敏感度判定參照呋喃妥因;E無(wú)NCCLS 標(biāo)準(zhǔn)，敏感度判定參照阿奇霉素。

3 討論

某些抗生素類藥物在國(guó)家已經(jīng)禁止使用的情況下，某些分離菌仍顯示較高抗性，與養(yǎng)殖場(chǎng)的飼料及環(huán)境不無(wú)關(guān)系[7]。分離菌株對(duì)青霉素G的抗性較其他藥物明顯強(qiáng)，可能與養(yǎng)殖場(chǎng)日常感染的常用藥有關(guān)。不同動(dòng)物源性菌株對(duì)藥物的敏感性亦存在一定差異，如豬源菌株對(duì)頭孢拉定的耐藥率高于雞源菌株，這可能是由于頭孢拉定作為養(yǎng)豬場(chǎng)預(yù)防用藥有關(guān)。由于牛源細(xì)菌分離獲得菌株數(shù)較少，在此不作討論。

金黃色葡萄球菌是人類臨床上重要的病原菌之一，是導(dǎo)致血液感染、心內(nèi)膜炎等的元兇之一，由金黃色葡萄球菌引起的致病率和死亡率有連年增高的趨勢(shì)，金黃色葡萄球菌作為一種致病菌正嚴(yán)重威脅著人類的健康發(fā)展[8]。在臨床上，金黃色葡萄球菌的耐藥現(xiàn)象正日益加劇，以對(duì)甲氧西林耐藥為代表的金黃色葡萄球菌(MRSA)，為控制金黃色葡萄球菌性疾病的流行、傳播和臨床治療帶來(lái)了極大挑戰(zhàn)，MARA也被稱為“超級(jí)細(xì)菌”[9]。金黃色葡萄球菌致病的主要機(jī)制是釋放毒素，可引起機(jī)體出現(xiàn)非特異性炎癥反應(yīng)，并引起嚴(yán)重的敗血癥，最終導(dǎo)致死亡。目前金黃色葡萄球菌研究較多的毒力因子有：血漿凝固酶、Pantone-Valentine(PVL)殺白細(xì)胞素、中毒性休克素I(TSST-I)、金黃色葡萄球菌腸毒素(SE)等[10]。

表3 分離菌株對(duì)抗生素的耐藥情況

本實(shí)驗(yàn)涉及哈爾濱及周邊地區(qū)，范圍較廣，共采集550份樣本，分離并檢定獲得104株細(xì)菌，經(jīng)進(jìn)一步測(cè)序及BlastN比對(duì)，共確定17株金黃色葡萄球菌， 分離率為3.1%，樣本的總分離率較高，但由于距離原因，某些樣本處理不夠及時(shí)，也造成分離菌株數(shù)量的一定誤差。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)分離獲得的細(xì)菌耐藥性進(jìn)行初步討論，針對(duì)細(xì)菌的耐藥機(jī)制并未進(jìn)行深入討論，下一步將會(huì)針對(duì)不同來(lái)源的細(xì)菌耐藥性原因做進(jìn)一步研究討論，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。