許占宏,房麗華,李淑艷,董 冉

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 麻醉科,黑龍江 哈爾濱150010；2.哈爾濱市兒童醫(yī)院)

右美托咪定(DEX)是目前被較廣應(yīng)用于圍手術(shù)期以及重癥監(jiān)護(hù)室的高選擇性的α2腎上腺素能受體激動藥[1]，在圍手術(shù)期及重癥監(jiān)護(hù)室患者使用時能產(chǎn)生近似自然睡眠的穩(wěn)定、鎮(zhèn)靜作用[2]，有利于維持患者血流動力學(xué)上的穩(wěn)定，具有保護(hù)患者的心、肝、腦等器官的功能特性[3,4]，同時還具有一定的利尿、抗焦慮的作用，并且其對于呼吸的抑制作用也很輕微[5-7]。鈣是人體中的主要常量元素之一， Ca2+做為第二信使會參與到細(xì)胞活動的調(diào)節(jié)中。胞內(nèi)游離的鈣離子濃度的變化，對于維持細(xì)胞質(zhì)膜以及細(xì)胞器膜兩側(cè)的跨膜Ca2+梯度差、以及實(shí)現(xiàn)信息跨膜傳導(dǎo)具有重要調(diào)節(jié)的作用[8-12]。目前關(guān)于右美托咪定誘導(dǎo)的肌細(xì)胞鈣濃度雙相增加與能量代謝之間的相關(guān)性研究較少，本實(shí)驗(yàn)將通過研究探討右美托咪定的作用對肌細(xì)胞鈣濃度增加與能量代謝之間關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

實(shí)驗(yàn)中選取出生5天后的雄性Wistar大鼠做為研究對象，實(shí)驗(yàn)大鼠采購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號是：SCXX (鄂)2004-2007。共分為2大組：對照組以及右美托咪定處理組(低劑量0.1 μmol/L、高劑量1 μmol/L)。

1.2 方法

1.2.1肌細(xì)胞培養(yǎng)過程 將出生5天后的雄性Wister大鼠殺掉，先采用70%濃度的酒精進(jìn)行浸泡30 min消毒，無菌紙擦干，于大鼠的肩關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)處進(jìn)行解剖，用磷酸鹽緩沖液沖洗數(shù)次后，剪掉大鼠的脂肪去除骨骼，剪碎成1 mm×1 mm×1 mm碎塊備用，用0.1%的胰蛋白酶將組織多次消化得到單個的細(xì)胞懸浮液，離心分離后得到沉淀，用含20%小牛血清的DMEM懸浮分散大鼠細(xì)胞，培養(yǎng)接種于25 ml容量的培養(yǎng)瓶中，放在37℃的二氧化碳的孵箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每日更換培養(yǎng)液[13]。實(shí)驗(yàn)開始前可用無血清的DMEM培養(yǎng)24 h，使得細(xì)胞周期同步。其中對照組按正常培養(yǎng)肌細(xì)胞流程進(jìn)行培養(yǎng)，不做任何其他處理；而右美托咪定組添加低劑量組(0.1 μmol/L)和高劑量組(1 μmol/L)濃度的DEX處理，其余不變。

1.2.2熒光蛋白鈣指示劑測定肌細(xì)胞中鈣離子含量 采用fura-2熒光鈣離子指示劑測定肌細(xì)胞中鈣離子的含量，測定原理為當(dāng)肌細(xì)胞結(jié)合鈣離子后，熒光的最大激發(fā)波長會從363 nm(末結(jié)合鈣離子)變成335 nm(鈣離子飽和)，同時發(fā)射熒光的最大波長大約在510 nm左右，未發(fā)生變化。探針會在340 nm和380 nm波長光處被激發(fā)，通過使用與兩種激發(fā)對應(yīng)的熒光強(qiáng)度的比率，來計(jì)算大鼠肌細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度[14]。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)fura-2負(fù)載后，利用F4500熒光分光光度計(jì)進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測定，激發(fā)波長為340 nm，發(fā)射波長為510 nm。

1.2.3肌細(xì)胞中線粒體琥珀酸脫氫酶(MSDH)的測定 肌細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶會形成將外源性噻唑藍(lán)還原成藍(lán)紫色的結(jié)晶物的現(xiàn)象，從而產(chǎn)生沉淀，然而死細(xì)胞無法完成此還原的過程[15]。實(shí)驗(yàn)中將肌細(xì)胞采用二甲亞砜溶液溶解，于570 nm處酶標(biāo)儀測定其吸光度(A)值，從而反映出線粒體的功能。

1.2.4肌細(xì)胞線粒體膜電位的測定 將處理后的肌細(xì)胞去掉其上清液，加入提前配置好的緩沖液 (氯化鈉122 mmol/L，碳酸氫鈉25 mmol/L，硫酸鎂1.2 mmol/L，磷酸氫二鈉0.4 mmol/L，氯化鈉1.4 mmol/L，4-羥乙基哌嗪乙磺酸10 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L)，37℃條件下預(yù)溫孵30 min，然后換成含有20 μmol/L Rh123的緩沖液在溫孵120 min，用冰冷的緩沖液沖洗3次后，即終止孵育。1420Victor多標(biāo)記免疫分析儀，激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為535 nm處測熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度來表示肌細(xì)胞中線粒體膜電位的變化[16]。

1.2.5肌細(xì)胞中ATP，ADP，AMP含量變化的測定 將培養(yǎng)處理后的肌細(xì)胞培養(yǎng)液中加入0.1 mol/L的高氯酸1 ml，于4℃，15 000 g離心10 min， 取 上清液用0．5 mol/L碳酸鈉溶液中和調(diào)整pH至6.5-7，再重復(fù)離心1次，取離心后的上清液做高效液相色譜分析[17]。

1.2.6肌細(xì)胞細(xì)胞凋亡測定 每組取6個孔板，0.125%胰酶消化并收集細(xì)胞。根據(jù)膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸酯/碘化丙啶雙標(biāo)試劑盒說明，用雙蒸水1∶4比例稀釋結(jié)合緩沖液，PBS洗滌細(xì)胞后，以稀釋的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞的密度為2×105/mL。取細(xì)胞懸液195 μl，加入AnnexinV-FITC5 μl和PI 10 μl混合均勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，使用流式細(xì)胞儀檢測[18]。

1.2.7肌細(xì)胞Ca2+-ATPase，Na+-K+-ATPase酶活性的測定 采用孔雀綠比色法[19]測定大鼠肌細(xì)胞中Ca2+-ATPase，Na+-K+-ATPase酶的活性。

1.2.8Western Blot檢測大鼠Caspse3表達(dá) 制備不同處理組大鼠蛋白樣品，-80℃低溫處儲存，待SDS-PAGE電泳凝膠制備完成后上樣電泳分離，跑膠結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，免疫反應(yīng)后進(jìn)行顯影、定影圖像分析。

1.2.9PCR技術(shù)檢測大鼠線粒體周圍能量基因的表達(dá)情況 將生產(chǎn)5天后的不同處理組的(每組15只)大鼠取血，提取其RNA做PCR檢測，取2 μg的mRNA使用superscript II和Random Primer Hexamers(Invitrogen)反轉(zhuǎn)錄合成并純化cDNA。在PCR Array 的96孔板中各加入20 ng的cDNA，后設(shè)置循環(huán)數(shù)進(jìn)行PCR，通過計(jì)算得到每個孔板中的Ct數(shù)及每組基因的表達(dá)的差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析

2 結(jié)果

2.1 肌細(xì)胞中鈣離子含量變化

從表1可知，與對照組鈣濃度241.4 nmol/L相比，右美托咪定處理組促使大鼠肌細(xì)胞中鈣離子含量均增加，鈣濃度分別增加了39.0 nmol/L、61.1 nmol/L，其中右美托咪定含量越高，促使肌細(xì)胞中鈣濃度雙向增加的越多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 不同處理?xiàng)l件下肌細(xì)胞鈣離子含量

注：a與對照組比較，P<0.05；b與低劑量組相比較，P<0.05。

2.2 肌細(xì)胞中線粒體琥珀酸脫氫酶(MSDH)活性比較

由表2可知，右美托咪定誘導(dǎo)濃度越高，線粒體中琥珀酸脫氫酶酶活性增加越多，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 不同處理?xiàng)l件下線粒體琥珀酸脫氫酶活性比較

注：a與對照組比較，P<0.05；b與低劑量組相比較，P<0.05。

2.3 肌細(xì)胞線粒體膜電位的變化

由表3可知，在右美托咪定的作用下，肌細(xì)胞線粒體膜電位較對照組增加，且右美托咪定誘導(dǎo)濃度越高，肌細(xì)胞中的線粒體膜電位增加越多，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 不同處理?xiàng)l件下肌細(xì)胞線粒體膜電位

注：a與對照組比較，P<0.05；b與低劑量組相比較，P<0.05。

2.4 肌細(xì)胞中ATP，ADP，AMP含量變化的測定

由表4可知，當(dāng)使用右美托咪定作用于大鼠的肌細(xì)胞后，大鼠肌細(xì)胞中的ATP、ADP以及AMP均出現(xiàn)增長，且高濃度的右美托咪定使得大鼠肌細(xì)胞ATP、ADP以及AMP增加更顯著，數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 不同處理?xiàng)l件下肌細(xì)胞中ATP、ADP、AMP含量

注：a與對照組比較，P<0.05；b與低劑量組相比較，P<0.05。

2.5 肌細(xì)胞細(xì)胞凋亡率變化

表5可知，不同處理?xiàng)l件下肌細(xì)胞細(xì)胞凋亡率變化情況。其中對照組細(xì)胞凋亡率正常情況下為4.58%，當(dāng)使用右美托咪定作用于肌細(xì)胞后，其細(xì)胞凋亡率明顯下降，低劑量組右美托咪定肌細(xì)胞較對照組細(xì)胞凋亡率下降了1.33%，高劑量右美托咪定肌細(xì)胞較對照組細(xì)胞凋亡率下降了2.46%，呈顯著變化，數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表5 不同處理?xiàng)l件下肌細(xì)胞細(xì)胞凋亡率

注：a與對照組比較，P<0.05；b與低劑量組相比較，P<0.05。

2.6 肌細(xì)胞中Ca2+-ATPase，Na+-K+-ATPase酶活性的測定

由表6可知，當(dāng)使用右美托咪定誘導(dǎo)作用于肌細(xì)胞后其Ca2+-ATPase和Na+-K+-ATPase的酶活性均增加，且右美托咪定濃度越高，肌細(xì)胞的酶活性增加越高，肌細(xì)胞能量代謝相對較高，數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表6 不同處理?xiàng)l件下肌細(xì)胞中Ca2+-ATPase，Na+-K+-ATPase酶活性

注：a與對照組比較，P<0.05；b與低劑量組相比較，P<0.05。

2.7 Western Blot檢測大鼠Caspse3表達(dá)

從圖1可看出，各處理組Caspse3目標(biāo)條帶與β-action參比條帶的灰度值，并通過軟件測定計(jì)算得到與對照組相比，右美托咪定處理組大鼠Caspse3蛋白表達(dá)基因均明顯下降。與對照組的Caspse3灰度值84.5%比，低劑量右美托咪定Caspse3灰度值為64.8%，高劑量右美托咪定Caspse3灰度值為23.4%，故右美托若定處理后細(xì)胞凋亡中Caspse3基因表達(dá)降低。

1：對照組 2：低劑量DEX組 3：高劑量DEX組

2.8 PCR技術(shù)檢測大鼠線粒體周圍能量基因的表達(dá)情況

由圖2 可知在不同右美托咪定處理后，大鼠右美托咪定組與對照組處理前后基因表達(dá)情況，Ndufa1、Ndufab1、Ndufb2、Ndufs8、Sdha基因代碼為線粒體產(chǎn)能的相關(guān)基因，可知在右美托咪定誘導(dǎo)處理后大鼠的Fold值均升高，且高劑量組Fold值高于低劑量組。

圖2 不同處理情況下大鼠線粒體周圍能量基因的表達(dá)

3 討論

研究表明，右美托咪定對多種器官具有保護(hù)作用[20]。人體大腦缺血會導(dǎo)致腦組織細(xì)胞受損，神經(jīng)元壞死凋亡，然而研究表明右美托咪定可促進(jìn)抗凋亡基因的表達(dá)，抑制促凋亡基因的表達(dá)，從而減少神經(jīng)元的凋亡，同時會降低兒茶酚胺的釋放；在肺功能上，右美托咪定會產(chǎn)生抑制炎性反應(yīng)抗氧化應(yīng)激，活化AKt信號通路；對于心臟功能影響中，右美托咪定具有較好的保護(hù)作用。右美托咪定可直接作用于心肌細(xì)胞，降低心肌缺血再灌注導(dǎo)致去甲腎上腺素的釋放，同時減輕凋亡和炎癥反應(yīng)等等[21]。

右美托咪定對于大腦、心臟、肝臟、腎功能、腸黏膜等均具有一定的保護(hù)作用，尤其在圍手術(shù)期對心臟的保護(hù)作用上[22]。Ca2+在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的過程需要Ca2+-Mg2+-ATP酶的磷酸化和ATP水解供能，同時將連接的2個Ca2+釋放到胞漿，引起肌細(xì)胞代謝變化。已有研究表明[12]，右美托咪定可抑制鈣離子通道的開放，同時會激活外向型的鉀離子通道的開放，降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，并會改變?nèi)梭w內(nèi)神經(jīng)元線粒體膜電位的變化，然而目前關(guān)于右美托咪定對于肌細(xì)胞鈣濃度增加與能量代謝之間關(guān)系的研究較少。右美托若定對膿毒癥患者外周線粒體能量代謝的研究中發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者會由于炎癥反應(yīng)使得人體線粒體功能受損，線粒體產(chǎn)能基因受阻導(dǎo)致能量代謝減少，而當(dāng)在早期使用右美托咪定時，線粒體產(chǎn)能基因表達(dá)增強(qiáng)，從而使機(jī)體的代謝水平較未使用患者增加[23,24]。在本文的研究中發(fā)現(xiàn)右美托咪定促使肌細(xì)胞鈣濃度雙相增加，且右美托咪定誘導(dǎo)劑量越高，肌細(xì)胞中測定的鈣離子含量越高，而鈣離子參與到細(xì)胞活動的調(diào)節(jié)中，且在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的過程需要Ca2+-Mg2+-ATP酶的磷酸化和ATP水解供能，同時將連接的2個Ca2+釋放到胞漿，引起肌細(xì)胞代謝變化。本研究顯示，右美托咪定處理組促使大鼠肌細(xì)胞中鈣離子含量均增加，鈣濃度分別增加了39.0 nmol/L、61.1 nmol/L；線粒體中琥珀酸脫氫酶明顯增加，在低劑量組達(dá)到(1.36±0.12)、高劑量組達(dá)到(1.68±0.17)；線粒體膜電位變化顯著增加，線粒體周圍能量基因的表達(dá)也升高，ATP、ADP、AMP以及Ca2+-ATPase，Na+-K+-ATPase酶的活性也均有所增加，使得肌細(xì)胞中能量代謝增加，細(xì)胞凋亡率下降，細(xì)胞凋亡中Caspse3基因表達(dá)也降低。

綜上所述，右美托咪定誘導(dǎo)使肌細(xì)胞鈣濃度雙相增加，促使線粒體中琥珀酸脫氫酶，線粒體膜電位變化以及ATP、ADP、AMP以及Ca2+-ATPase，Na+-K+-ATPase酶的活性增加，細(xì)胞凋亡率下降等變化，共同促使肌細(xì)胞三羧酸循環(huán)加快，細(xì)胞產(chǎn)能增加，能量代謝增強(qiáng)，機(jī)體代謝水平增強(qiáng)。