丁光貴，王小艷，萬(wàn) 軍，丁培堃，黃同海

(1.深圳市人民醫(yī)院 胸外科,廣東 深圳518020;2.深圳市蛇口人民醫(yī)院社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心,廣東 深圳518020)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率死亡率均位居惡性腫瘤第一位[1,2]。研究表明，可通過(guò)檢測(cè)肺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)進(jìn)行早期診斷[3]。本研究選取了一種基于微流控平臺(tái)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分選儀器，通過(guò)對(duì)分選出的CTC通過(guò)免疫化學(xué)染色計(jì)數(shù)，與常規(guī)腫瘤標(biāo)記物進(jìn)行對(duì)比，探討CTC檢測(cè)用于NSCLC早期診斷的可行性。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

觀察對(duì)象為2017年01年至2019年01月期間在深圳市人民醫(yī)院確診為NSCLC的65例癌癥患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：年齡18-80周歲，性別不限；病理診斷為NSCLC患者，所有患者均接受肺部CT掃描，腹部B超，全身骨ECT，頭顱MRI及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查以明確分期及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；既往無(wú)腫瘤病史；入院前未接受抗腫瘤的相關(guān)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床檢驗(yàn)判定小細(xì)胞肺癌或其他惡性腫瘤；合并其他腫瘤患者。本研究已經(jīng)過(guò)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者對(duì)研究知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2 材料和儀器

NCI-H1975 (非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，活細(xì)胞熒光染料Celltracker CMFDA(貨號(hào)：C7025)、細(xì)胞核染料Hoechst33342(貨號(hào)：H1399)、磁力架(貨號(hào)：A31543)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；低速大容量離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠；垂直混合儀和微型水平脫色搖床購(gòu)自江蘇海門(mén)其林貝爾公司；微型臺(tái)式真空泵購(gòu)自上海斯曼峰醫(yī)療器械公司；熒光顯微鏡及單細(xì)胞挑取系統(tǒng)購(gòu)自?shī)W林巴斯(深圳)工業(yè)有限公司，ClearCell○RFX1循環(huán)腫瘤細(xì)胞活性分離系統(tǒng)購(gòu)自新加坡的Clearbridge生物醫(yī)學(xué)公司，CTC鑒定染色過(guò)程的細(xì)胞固定液、透化液、封閉液、抗體稀釋液、抗體混合液(含偶聯(lián)過(guò)氧化氫酶pan-CK-抗體和偶聯(lián)堿性磷酸酶CD45)、酶顯色底物等配套試劑由深圳華大生命科學(xué)研究院提供支持。

采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物NSE(貨號(hào)：CPO11070)、CEA(貨號(hào)：CPO11050)、Cyfra21-1(貨號(hào)：CPO11040)由深圳市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科采用上海透景生命科技股份有限公司相關(guān)試劑盒檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) NCI-H1975細(xì)胞用含有10%熱滅火胎牛血清100 IU/ml青鏈霉素的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)的細(xì)胞用DPBS 磷酸緩沖液洗滌2次后用0.25%胰蛋白酶消化傳代或收獲細(xì)胞。

1.3.2細(xì)胞摻入與細(xì)胞回收率統(tǒng)計(jì) NCI-H1975細(xì)胞培養(yǎng)至融合度約為80%后用胰酶進(jìn)行消化，加入Celltracker CMFDA染色工作液，于細(xì)胞正常生長(zhǎng)條件下孵育30 min。換用新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)30 min，將細(xì)胞用PBS漂洗后，在熒光顯微鏡下使用單細(xì)胞挑取系統(tǒng)挑取準(zhǔn)確數(shù)量的細(xì)胞，按照5CTC/3 ml、25CTC/3 ml、50CTC/3 ml摻入全血中，每組設(shè)3個(gè)組內(nèi)平行。

分別按照CTC定量檢測(cè)試劑盒及ClearCell○RFX1循環(huán)腫瘤細(xì)胞活性分離系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行CTC分離操作，得到的細(xì)胞懸液置于96孔板中，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。按以下公式進(jìn)行回收率計(jì)算：CTC回收率=觀測(cè)CTC數(shù)量/摻入CTC總數(shù)×100%。

1.3.3CTC的定量檢測(cè) 每位受試者采5 ml血液樣本，用含肝素鈉的BD Vacutainer管收集后保存于4℃冰箱，并且在采集后6 h內(nèi)進(jìn)行處理。CTC的定量檢測(cè)按照ClearCell○RFX1循環(huán)腫瘤細(xì)胞活性分離系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。CTC分離后，按照邁新生物雙重免疫化學(xué)染色標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行染色鑒定，在熒光顯微鏡明場(chǎng)下進(jìn)行觀察并計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTC分離回收效率

通過(guò)CTC分離回收效率公式計(jì)算標(biāo)記并染色的NCI-H1975細(xì)胞回收效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過(guò)循環(huán)腫瘤細(xì)胞滲入實(shí)驗(yàn)，NCI-H1975細(xì)胞的回收率為(83.3-86.3)%，平均值為(85.0±1.5)%(表1)。

表1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞回收情況

2.2 細(xì)胞形態(tài)鑒定

為確定經(jīng)免疫化學(xué)染色鑒定后的腫瘤細(xì)胞形態(tài)特征，我們先對(duì)NCI-H1975肺癌細(xì)胞系、正常人外周血單核細(xì)胞PBMC進(jìn)行了染色鑒定，染色后腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)典型的紅色，PBMC染色后呈現(xiàn)典型的藍(lán)黑色，形態(tài)特征見(jiàn)下圖1。

圖1 NCI-H1975和PBMC細(xì)胞染色后40倍顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)圖

2.3 納入病人臨床信息

本研究共納入65例NSCLC患者的相關(guān)信息，其中男性患者38(58.5%)例，女性患者27(41.5%)例?；颊叩钠骄挲g為58.6(25-79)歲，Ⅰ期患者17(26.2%)例，Ⅱ期患者16(24.6%)例，Ⅲ期患者14(21.5%)例，Ⅳ期患者18(27.7%)例。

2.4 微流控平臺(tái)與常規(guī)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

為了評(píng)估CTC檢測(cè)在NSCLC術(shù)前輔助診斷的價(jià)值，我們對(duì)65例NSCLC患者的臨床全血樣本進(jìn)行了檢測(cè)，并與臨床常規(guī)腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行對(duì)比分析。在65例NSCLC樣本中，大部分有CTC檢出，但在早期檢出的CTC數(shù)量較少。I期中8例沒(méi)有檢出，有6例只有1個(gè)CTC檢出；Ⅱ期中有6例只有1個(gè)CTC檢出，6例有2個(gè)CTC檢出；Ⅲ期和Ⅳ檢出的CTC數(shù)目相對(duì)較多。與化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)常規(guī)腫瘤標(biāo)記物(NSE/CEA/Cyfra21-1)作為早期診斷的結(jié)果相比，在65例腫瘤患者樣本中，傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)記物的檢出為34例，檢出率52.3%，CTC檢測(cè)的檢出為57例，檢出率為87.7%，兩者相比P<0.01；中晚期(Ⅲ-Ⅳ期)的CTC檢出數(shù)量與早期(Ⅰ-Ⅱ期)相比，P<0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2和圖2)。

表2 微流控平臺(tái)與常規(guī)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果匯總

圖2 不同TNM分期患者樣本CTCs檢出細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)圖，CTCs(Ⅲ-Ⅳ)顯著高于CTCs(Ⅰ-Ⅱ)，P<0.01

3 討論

研究表明，循環(huán)腫瘤細(xì)胞與多種惡性腫瘤的臨床病理分期及預(yù)后密切相關(guān)，其在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中的作用也日益受到關(guān)注[4]。由于外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞水平極低 ，這使得富集分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞挑戰(zhàn)巨大。 目前，包括基于細(xì)胞物理學(xué)特性的方法、基于磁性親和選擇的分選方法和基于微流體的生物學(xué)的分選方法在內(nèi)，各種循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)發(fā)展迅速，但大多處于研發(fā)階段，從技術(shù)平臺(tái)和臨床應(yīng)用角度仍有巨大發(fā)展空間。微流控技術(shù)是近些年在循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)領(lǐng)域新興的重要技術(shù)平臺(tái)，其利用不同方法的捕獲效率基本在70%以上[5,6]。本研究選取了一種具有高效、不依賴(lài)腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)志物特點(diǎn)的基于微流控平臺(tái)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分選儀器，其原理是基于尺寸大小不同的細(xì)胞在微流控芯片中表現(xiàn)出力學(xué)特征的不同，從而通過(guò)慣性遷移達(dá)到分離的效果[7，8]。從摻入腫瘤細(xì)胞的健康人血樣模擬腫瘤患者血樣的試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，微流控平臺(tái)具有較高的循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲效率(85.0±1.5)%，優(yōu)于一些研究報(bào)道的腫瘤細(xì)胞捕獲效率[9]。例如：應(yīng)用納米多孔碳酸酯膜的親和性分選法對(duì)于PC-3細(xì)胞混于白細(xì)胞的捕獲效率為70%[10]。采用金電極、PDMS微管道的雙相電泳分選法對(duì)混于血液的MCF-7細(xì)胞的捕獲效率為75%左右[11]。值得一提的是，該試驗(yàn)是在血液量較少的情況下完成(5 ml)，而利用密度梯度離心法分類(lèi)CTCs需要15-30 ml的血量，陽(yáng)性富集法的Cellsearch系統(tǒng)需要7.5 ml的血量[12]。這提示該方法在血液數(shù)量不多的情況也能檢測(cè)，比一些CTCs檢測(cè)具有優(yōu)勢(shì)。

NSCLC近年來(lái)發(fā)病率不斷增高，目前在全球范圍內(nèi)NSCLC的發(fā)病率和死亡率居于首位。我國(guó)雖然包括手術(shù)治療、藥物治療、放射治療等在內(nèi)的各種治療手段已經(jīng)取得巨大進(jìn)步，但預(yù)后不良率較高且5年生存率與發(fā)達(dá)國(guó)家相比仍有巨大差距，腫瘤導(dǎo)致患者死亡的主要原因是由腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)引起的，而循環(huán)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)在惡性腫瘤患者外周血中是發(fā)生轉(zhuǎn)移的必要條件[13，14]。本研究進(jìn)一步通過(guò)對(duì)NSCLC患者術(shù)前血樣進(jìn)行了CTC檢測(cè)，并與臨床常用的腫瘤標(biāo)記物(/NSE/CEA/Cyfra21-1)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示，晚期(Ⅲ-Ⅳ期)腫瘤患者CTC檢出數(shù)量顯著高于早期患者(Ⅰ-Ⅱ)，而CTC陽(yáng)性檢出率和常規(guī)腫瘤標(biāo)記物檢出率相比具有顯著的升高。本研究的不足之處在于沒(méi)有進(jìn)行一定樣本數(shù)量的健康人群基線研究，入組的樣本數(shù)量有限。雖然微流控平臺(tái)還處于發(fā)展的早期階段，但其在臨床診斷分析上已顯示出敏感度高、需要樣本量少、效率高等優(yōu)勢(shì)。隨著技術(shù)的不斷完善，微流控技術(shù)有望在CTC檢測(cè)研究中發(fā)揮更重要的作用。