姚洋，尤雙，劉芝瑾，張翔宇，侯曉旭，郭濤，倪偉，胡圣偉

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003)

家兔具有繁殖周期短、易進行超數(shù)排卵、與人類生理結(jié)構(gòu)相似等特點。目前，轉(zhuǎn)基因家兔已經(jīng)廣泛用于人類疾病模型的研究[1]，包括脂類代謝和動脈硬化，以及眼科和整形外科等幾個領(lǐng)域[2]。轉(zhuǎn)基因家兔也被用于生產(chǎn)稀有藥用蛋白[3]，相關(guān)藥物已經(jīng)在美國和歐盟批準上市。但是，目前轉(zhuǎn)基因家兔的外源基因都為隨機整合，導(dǎo)致外源基因表達存在不穩(wěn)定和表達量低等問題，這在一定程度上限制了轉(zhuǎn)基因家兔在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，研究家兔外源基因定點整合技術(shù)及友好位點，對定點整合轉(zhuǎn)基因兔的制備具有重要意義。

使用工程化核酸酶的靶向基因組編輯已經(jīng)成為多數(shù)生物學(xué)研究使用的主流方法[4]。目前已用于基因功能的研究，提供用于生物和醫(yī)學(xué)研究的轉(zhuǎn)基因動物模型并改善畜牧業(yè)中動物的特定性狀。定期間隔短回文重復(fù)序列(CRISPRs)和Cas蛋白是跨細菌和古細菌的廣泛系統(tǒng)，其導(dǎo)致對外來核酸的干擾[5]。該系統(tǒng)由20nt的指導(dǎo)序列(sgRNA)和Cas9核酸酶組成，利用非同源末端連接(NHEJ)來誘導(dǎo)靶標突變。將sgRNA和Cas9 mRNA同時注射受精卵[6]，已成為基因靶向動物模型的重要工具。

傳統(tǒng)上，通過將基因序列或轉(zhuǎn)基因以隨機方式整合到基因組中來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物，其中轉(zhuǎn)基因可以插入基因組中的任何位置[7]。轉(zhuǎn)基因的隨機整合經(jīng)常導(dǎo)致不穩(wěn)定的表型，基因沉默和不可預(yù)測的基因表達，并且在一些情況下，該過程是誘變的。對于位點特異性基因插入，過去使用同源重組(HR)和體細胞核移植(SCNT)以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物[8]。

由于HR效率低，費力且耗時，這種方法效率低，所以急需一種高效的方法解決這種問題，基因定點整合技術(shù)利用同源重組和基因編輯為解決這種問題提供了優(yōu)良的方法。2014年，賴良學(xué)的研究團隊成功獲得了世界上首個Rosa26定點基因敲入豬的模型。2015年，Zambrowicz等人結(jié)合同源重組和基因編輯技術(shù)，得到了基因敲入兔[9]。

友好位點是表達比較活躍的靶位點，其具有高整合效率，穩(wěn)定表達和高插入基因表達的優(yōu)勢。Hipp11(H11)位點由HIPPENMEYER[10]最早發(fā)現(xiàn)，隨后在基因敲入小鼠[11]和人類干細胞[12]中進行了驗證。在小鼠基因組中，H11位點處于Eif4enif1和Drg1基因中間。然而在兔子中H11位點開發(fā)卻沒有報道。本研究通過比對小鼠H11位點，在家兔基因組中開發(fā)出兔的相應(yīng)H11位點。并且利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)基因定點整合方法將GFP基因整合到家兔H11位點上。

通過對CRISPR / Cas9系統(tǒng)在兔中的定點整合進行鑒定，可以很好的解決隨機整合帶來的外源基因表達的不均一等問題，使插入的外源基因能夠高效率的表達；同時，使外源基因定點整合的效率極大的提高，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因兔的成本大大降低，這為未來制備轉(zhuǎn)基因兔搭建了一個安全、高效的平臺。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

Trizol試劑、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液均購于美國賽默飛世爾科技公司；DL10000DNA marker、DL2000DNA marker、DL1000DNA marker(寶生物工程公司)；限制性內(nèi)切酶BglⅡ、AseI、NheI、AflⅡ和BbsⅠ，Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver．5．0購于北京Takara公司；胰蛋白酶、氯化鈉、酵母提取物、瓊脂粉，瓊脂糖均購自索萊寶公司。

Lonza4D-Nucleofector電轉(zhuǎn)儀(Lonza，公司，德國)、冰箱(海爾，中國)，低溫離心機、倒置熒光顯微鏡系統(tǒng)(Nikon，德國)、移液器(Eppendorf 公司，德國)，超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，中國)，二氧化碳細胞培養(yǎng)箱，瓊脂糖凝膠核酸電泳儀(北京六一生物科技有限公司，中國)；超低溫冰箱(三洋公司，日本)，生化培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司，中國)，恒溫水浴鍋(上海精密儀器儀表有限公司，中國)，生物安全柜(BAKER公司，美國)，立式壓力蒸汽高壓滅菌器(上海博訊公司，中國)，凝膠成像系統(tǒng)(伯樂公司，美國)。

1.2 序列比對

以EIF4ENIF1或Drg1基因為標識，在NCBI 網(wǎng)站查找小鼠、人和豬的 H11 位點及其周邊序列，并預(yù)測兔的 H11 位點的位置和周邊序列，與豬的序列利用 DNAMAN進行比對分析。

1.3 CRISPR/Cas9敲除載體的構(gòu)建

利用CRISPR/Cas9在線設(shè)計工具(http://tools.genomeenging.org)根據(jù)預(yù)測的H11位點和周邊序列，以DNA正義鏈(反義鏈)的序列GGN18NGG(GGN17NGG)為靶位點設(shè)計兩條sgRNA，引物見表1。取100 μmol/L的sgRNA上游和下游引物各10ul，放置于95 ℃水浴5 min后，關(guān)閉水浴鍋，在水浴中冷卻至室溫，退火，獲得帶有粘性末端的雙鏈CRISPR/Cas9。

同時利用BbsⅠ線性化 PX330載體。線性化的 PX330載體經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測，膠回收后，線性化的PX330載體和退火的sgRNA用T4連接酶連接過夜，經(jīng)轉(zhuǎn)化后，挑取單克隆送睿博興科公司測序。

表1 sgRNA序列設(shè)計Tab.1 SgRNA sequence design

1.4 同源打靶載體的構(gòu)建

pIRES2-ZsGreen1-Puro(本文縮寫為pIRZP)載體已由本實驗室構(gòu)建保存。試驗依據(jù)兔H11位點兩側(cè)的左右同源臂序列(圖1)分別設(shè)計合成左右同源臂的引物，在H11位點左右同源臂引物的5′端分別添加AseI(ATTAAT)和AflⅡ(TTAAG)酶切位點。利用H11-3′Arm-F和H11-3′Arm-R引物通過PCR擴增、酶切、連接，將右同源臂克隆至pIRZP載體中，經(jīng)測序驗證，得到pIRZP-H11-3′Arm載體。PCR反應(yīng)體系如下：上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2 × Es Taq Master Mix25 μL，家兔基因組2 μL模板，ddH2O 21 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，50 s，共35 個循環(huán)；最后 72 ℃，5 min；4 ℃保存。

用上述PCR的方法利用H11-5′Arm-R和H11-5′Arm-F引物將H11位點左同源臂克隆至pIRZP-H11-3′Arm載體上，送睿博興科公司公司測序，引物見表2。

1.5 嘌呤霉素篩選兔胚胎成纖維細胞濃度確定

我們將接種于12孔板的兔胚胎成纖維細胞培養(yǎng)24 h后，換用不同濃度的嘌呤霉素細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)[13]。每孔做3個生物學(xué)重復(fù)，隔 1 d 觀察細胞的生長情況。

至3 d 后，取細胞全部死亡的板孔所對應(yīng)的最小濃度作為最佳篩選濃度。

1.6 電轉(zhuǎn)染

待6孔板4個孔中的細胞長至70%～80%后，收集細胞，計數(shù)。

按照 Lonza Nucleofector的操作說明，各取2×105～1×106個細胞，分別添加如表3的體系之后和 100 μL電轉(zhuǎn)液混合。選擇EH-100程序進行電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)結(jié)束，快速取出電轉(zhuǎn)杯并靜置10 min。把電轉(zhuǎn)的細胞轉(zhuǎn)入至溫育的含有15% FBS培養(yǎng)基的6孔板中，并于37 ℃，5.0%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5～6 h后換液。轉(zhuǎn)染24 h后，換最佳篩選濃度的嘌呤霉素培養(yǎng)液對細胞進行篩選。間隔2～3 d，換一次嘌呤霉素培養(yǎng)液，直至長出大而漂亮的克隆島。

表3 電轉(zhuǎn)體系Tab.3 Electric transfer system

1.7 打靶細胞的檢測

我們將敲除載體與同源打靶載體共轉(zhuǎn)染細胞24 h后，利用Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver． 5． 0(Takara)提取2種細胞的基因組DNA，之后通過PCR技術(shù)檢測打靶細胞的GFP基因和Puro基因，PCR反應(yīng)體系如下：上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，2 × Es Taq Master Mix10 μL，細胞基因組1 μL模板，ddH2O 8 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，57 ℃，30 s，72 ℃，40 s，共 35 個循環(huán)；最后 72 ℃，5 min；4 ℃保存。與此同時用5’arm-cmv-F、5′arm-cmv-R和GFP-3′arm-F1、GFP-3’arm-R1引物對打靶細胞DNA進行PCR驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬與小鼠與人的 H11 位點周圍環(huán)境序列比對

將豬與小鼠和人的 H11 位點序列進行比對，從比對結(jié)果中看出人、小鼠與豬中Eif4enif1基因和Drg1 基因距離相近且相鄰(圖2)。并且H11 位點都處于Eif4enif1和Drg1之中，所以我們預(yù)測家兔的H11位點也處于Eif4enif1和Drg1之間，隨后從Genebank 調(diào)出Eif4enif1 和Drg1之間的序列，運用DNAMAN軟件對其進行序列的比對，發(fā)現(xiàn)人，小鼠和家兔之間的同源性約為 49.67%(圖3)，紅色方框標記H11位點的區(qū)域。

A—小鼠；B—人；C—豬；D—兔圖2 H11位點在小鼠、人、豬和兔中的位置Fig.2 Mapping of H11 locus in mice,human,pig and rabbit

圖3 小鼠、人、和兔子的H11序列比對Fig.3 Alignment of H11 locus between mice,human and rabbit

2.2 CRISPR/Cas9敲除載體的構(gòu)建

PX330載體經(jīng)BbsⅠ酶切后，結(jié)果顯示與對照相比酶切完全，條帶單一(圖4)。構(gòu)建的CRISPR/Cas9敲除載體經(jīng)過測序驗證，結(jié)果如圖所示sgRNA成功連入PX330載體中(圖5)，H11-g RNA1和H11-g RNA2敲除載體構(gòu)建成功。為了檢測構(gòu)建的CRISPR/Cas9敲除載體是否有活性，將上述H11-g RNA1和H11-g RNA2載體轉(zhuǎn)染兔胚胎成纖維細胞。3 d后收集細胞并提取細胞基因組，經(jīng)T7E1酶切，結(jié)果如圖6顯示H11-g RNA1和H11-g RNA2敲除載體具有生物學(xué)活性且效率有2%～10%。

對照：PX330質(zhì)粒對照；1-8：BbsⅠ酶切產(chǎn)物；M：10000的marker圖4 PX330酶切Fig.4 Digestion of PX330

圖5 敲除載體的測序結(jié)果Fig.5 Knocking out the sequencing results of the vector

M1：DL1000；1-3：對照，gRNA1，gRNA2；M2：DL500圖6 敲除載體T7E1酶切驗證Fig.6 knockout vector T7E1 digestion validation

2.3 同源打靶載體的構(gòu)建

將構(gòu)建的pIRZP-H11-3’Arm載體用BglⅡ限制酶對其右同源臂的方向進行酶切驗證，經(jīng)電泳分析發(fā)現(xiàn)在3號約1658 bp處可以看見清晰的條帶，說明3號右同源臂的方向正確(圖7)。若右同源臂的方向不正確，則會得到2219 bp大小的片段。進一步對3號質(zhì)粒測序驗證，結(jié)果顯示H11的右同源臂成功連接到pIRZP載體上。之后對構(gòu)建的pIRZP-H11載體用PCR驗證其左同源臂的方向，若方向正確如圖8 A,以H11-5’-F，Puro-R進行PCR就可以擴增出1987 bp片段，而以H11-5’-F，Green-R PCR后可以擴增出3323 bp的片段。若方向錯誤則不會擴增出條帶。測序結(jié)果顯示H11的左同源臂連接到pIRZP-H11-3’Arm載體上(圖8B)。成功構(gòu)建pIRZP-H11同源打靶載體如圖9 A，9B所示。進一步酶切驗證pIRZP-H11載體，因為pIRZP-H11載體上有3個AflⅡ酶切位點，2個BglⅡ酶切位點，所以用AflⅡ酶切則會出現(xiàn)3532 bp，3132 bp，717 bp三條清晰的條帶，其中717 bp為右同源臂的的大小如圖9C第3道。而用NheⅠ和BglⅡ酶切 pIRZP-H11載體會出現(xiàn)5117 bp，1658 bp，606 bp3個條帶，其中606 bp為Puro基因的大小如圖9C第4道。用AseI酶切pIRZP-H11載體出現(xiàn)6621 bp和793 bp2個條帶，其中793 bp為左同源臂的大小。以上結(jié)果進一步證明我們構(gòu)建的pIRZP-H11載體是正確的。

A—酶切驗證方向(M：DL2000);B—3號質(zhì)粒測序結(jié)果圖7 pIRZP-H11 -3’Arm載體驗證Fig.7 pIRZP-H11-3'Arm vector validation

A—PCR驗證方向(M1:DL2000；M2：DL10000；1、2：Puro引物；3、4：Green引物；1、3為同一個樣品；2、4為同一個樣品)；B—8號質(zhì)粒測序結(jié)果圖8 pIRZP-H11載體驗證Fig.8 pIRZP-H11 vector validation

C(M1：DL10000；1-4：對照，Ase I酶切，BglⅡ和NheⅠ酶切，AflⅡ酶切；M2：DL1000)圖9 pIRZP-H11載體圖和pIRZP-H11載體酶切Fig.9 pIRZP-H11vector and Digestion of pIRZP-H11 vector

2.4 嘌呤霉素最佳濃度篩選結(jié)果

經(jīng)過不同濃度嘌呤霉素的篩選，最終我們確定了在兔胚胎成纖維細胞中，嘌呤霉素的最佳篩選濃度為2 μg/mL。在該濃度下，兔胚胎成纖維細胞經(jīng)過3天的篩選就已全部死亡。

2.5 GFP表達及藥物篩選單克隆群

將敲除載體和打靶載體共轉(zhuǎn)染兔胚胎成纖維細胞24 h后，在40X倍鏡下觀察到共轉(zhuǎn)染后兔胚胎成纖維細胞形態(tài)良好，而熒光表達量和細胞數(shù)量均比較少。我們還發(fā)現(xiàn)H11-gRNA1+ pIRZP-H11共轉(zhuǎn)染兔胚胎成纖維其熒光表達量和細胞狀態(tài)高于H11-gRNA2+pIRZP-H11，在此基礎(chǔ)上進行后續(xù)嘌呤霉素抗性篩選研究。當(dāng)兔胚胎成纖維細胞共轉(zhuǎn)染H11-gRNA+ pIRZP-H11質(zhì)粒經(jīng)過嘌呤霉素篩選到25 d時，在顯微鏡下可以觀察到如(圖10)所示的大的具有綠色熒光以及Puro抗性的單克隆群。分別在共轉(zhuǎn)染H11-gRNA1+ pIRZP -H11和H11-gRNA2+ pIRZP-H11質(zhì)粒的兔胚胎成纖維細胞中找出9個和8個相對大的克隆群(圖11)。

A—H11-gRNA1+ pIRZP-H11；B—H11-gRNA2+ pIRZP-H11圖10 共轉(zhuǎn)染兔胚胎成纖維細胞24 h熒光圖(40×)Fig.10 Co-transfected rabbit embryonic fibroblasts for 24 hours(40×)

A—H11-gRNA1+ pIRZP-H11;B—H11-gRNA2+ pIRZP-H11圖11 兔胚胎成纖維細胞藥殺25 d 單克隆熒光圖(40×)Fig.11 Rabbit embryonic fibroblasts were killed by 25 days(40×)

2.6 打靶細胞的檢測

提取共轉(zhuǎn)染后兔胚胎成纖維細胞的基因組，通過PCR檢測后如圖12A，可以看到Puro基因和GFP基因清晰單一的條帶且大小與我們預(yù)期的相同，這說明共轉(zhuǎn)染的兔胚胎成纖維細胞基因組中已存在Puro和GFP基因，進一步用5’arm-cmv-F，5’arm-cmv-R和GFP-3’arm-F1，GFP-3’arm-R1兩對引物對打靶細胞基因組定點整合做PCR鑒定，如圖出現(xiàn)預(yù)期大小的單一條帶(圖12B)以上結(jié)果證明這兩個基因已經(jīng)成功整合至兔胚胎成纖維細胞基因組中。

A—M：DL1000；1、2：共轉(zhuǎn)染H11-gRNA1+ pIRZP-H11質(zhì)粒細胞的Puro和ZsGreen1；3、4：共轉(zhuǎn)染H11-gRNA2+pIRZP-H11質(zhì)粒細胞的Puro和ZsGreen1；B—M：DL2000；1、3：共轉(zhuǎn)染H11-gRNA1+pIRZP-H11質(zhì)粒細胞左、右同源臂的junction；2、4：共轉(zhuǎn)染H11-gRNA2+pIRZP-H11質(zhì)粒細胞左、右同源臂的junction圖12 打靶細胞的PCR檢測和junction PCR檢測Fig.12 PCR detection of target cells and detection of the transfected cells

3 討論

1985年，Hammer等人研究出世界上首例轉(zhuǎn)基因兔[14]。此后，在全世界內(nèi)，具有不同研究目的的轉(zhuǎn)基因兔模型相繼被生產(chǎn)出來，例如淋巴細胞白血病腫瘤和乳頭狀瘤[15]，獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)[16]和藥用蛋白反應(yīng)器的研究。然而，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因兔模型是由外源基因通過原核顯微注射被隨機插入到兔基因組中產(chǎn)生的。在這過程中存在一些問題，因為外源基因插入到兔基因組內(nèi)的隨機位點上，所以轉(zhuǎn)基因會受到位置效應(yīng)[15-16]，例如：轉(zhuǎn)基因可能會通過插入進而誘變和破壞兔本身基因的功能，因此，科研人員為了篩選足夠多的轉(zhuǎn)基因的表達系統(tǒng)并且獲得可重復(fù)的結(jié)果，他們一般運用多條線進行篩選[17]。

為了建立有效的基因敲入系統(tǒng)，本試驗首先研究了3種基因組編輯方法：鋅指核酸酶(ZFNs)[18]，轉(zhuǎn)錄激活因子類似效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)[19]和RNA 指導(dǎo)的 CRISPR/Cas核酸酶系統(tǒng)。研究顯示Cas9 與 ZFN 和TALEN 相比，有一些潛在優(yōu)勢，包括制作簡單，低成本，高效性和促進多重基因組編輯的能力。JIN[20]等人的數(shù)據(jù)顯示，與CRISPR / Cas9n或TALEN相比，CRISPR / Cas9在豬H11基因座上靶向和切割DNA的效率更高，具有高達50%～60%的靶向效率。本試驗建立的基因敲入系統(tǒng)將GFP和Puro基因高效的整合進入兔的H11基因座上，再一次證明了CRISPR / Cas9基因編輯技術(shù)的優(yōu)越性。

本試驗首次證明了CRISPR / Cas9可以有效地用于產(chǎn)生兔模型。在本試驗中，通過將CRISPR / Cas9、同源定向重組(HDR)和兔子H11位點結(jié)合構(gòu)建成一套系統(tǒng)，在兔中實現(xiàn)精確的，位點特異性的基因整合及表達,這是一種新的策略。使用CRISPR / Cas9，可以實現(xiàn)高達較高的基因整合效率，報告基因GFP和Puro已存在于兔的基因組中。相比于隨即整合方法，本試驗的方法有許多優(yōu)勢，如：去除了位置效應(yīng)，有比較穩(wěn)定的單拷貝插入以及高整合效率[21]。用傳統(tǒng)HR 的目標轉(zhuǎn)基因通過藥物篩選的效率低于 6%，由于其許多元件和大片段，傳統(tǒng)HR 基因靶向載體的構(gòu)建，在技術(shù)上有挑戰(zhàn)性且耗時[38-39]。

H11 位點，位于Eif4enif1基因 與Drg1 基因中間，而這兩個基因在不同種屬的位置有所差異，在小鼠、人、豬中分別位于第11 號、22 號、14 號染色體，而在兔中位于第21號染色體，該位點不含有任何啟動子[22]，在具有轉(zhuǎn)錄活性的H11位點插入外源基因，可以實現(xiàn)通過啟動子例如CMV驅(qū)動的基因表達[20]。在以后的克隆過程中，將該敲入系統(tǒng)用于兔胚胎成纖維細胞中，可以在短時間內(nèi)獲得具體的任何所感興趣的基因插入的轉(zhuǎn)基因兔。此外，本試驗的敲入系統(tǒng)有效的敲入 1.2 Kb 片段，有研究稱可插入 4.2 Kb，甚至高達9.4 Kb的大片段[20]，由此可見使用CRISPR / Cas9系統(tǒng)，片段的大小對基因插入的效率似乎沒有明顯的影響。CRISPR / Cas9介導(dǎo)的同源定向重組基因編輯可以成為精確和高效的獲得轉(zhuǎn)基因兔的有效手段，相信在未來，該敲入系統(tǒng)能夠在大型物種轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)中發(fā)揮一定的作用。

4 結(jié)論

試驗運用CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)獲得敲除載體。針對H11位點，試驗利用基因的HDR構(gòu)建了同源重組載體，在兔胚胎成纖維細胞系中建立了一個實驗平臺，該平臺運用HDR機制進行了基因的靶向敲入。通過該平臺獲得了較高重組效率的兔胚胎成纖維細胞，這為以后試驗打下堅實的基礎(chǔ)。結(jié)合熒光和藥物篩選以及分子生物學(xué)手段，成功的在兔基因組中檢測我們期望的外源基因，說明外源基因已整合到基因組中，且HDR機制的定點整合是可行的，為后續(xù)試驗奠定基礎(chǔ)。