房小燕，姚兆群，陳美秀，曹小蕾，趙思峰

(新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點實驗室/石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子 832003)

菟絲子是旋花科(Convolvulaceae)菟絲子屬(Cuscuta)植物的總稱，是一年生寄生纏繞草本植物，其無根、無葉或葉片退化為小的鱗片，沒有葉綠素，通過吸器從寄主莖上吸收生長所需的水分和養(yǎng)分。除了在高緯度高海拔地區(qū)難以存活外，菟絲子在美洲、非洲、地中海地區(qū)、東南亞、太平洋諸島等熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛分布，菟絲子屬有200多個種，其中Cuscutacampestris、Cuscutareflexa、Cuscutamonogyna等幾個種給農(nóng)作物、果樹、花卉等造成的損失較為嚴(yán)重[1-2]。據(jù)《中國植物志》[3]報道，我國南北方均有菟絲子分布，在我國分布的有8種，另有3種僅有記載，沒有標(biāo)本。新疆是報道菟絲子種類最多的一個區(qū)域，已報道的種類達(dá)到8種以上[4-5]，這些報道的鑒定依據(jù)完全依賴于其纏繞的寄主和莖、花、碩果、種子等形態(tài)學(xué)特征，因寄主及生長環(huán)境的不同，菟絲子形態(tài)學(xué)特征變化較大，僅依靠形態(tài)學(xué)特征并不能得出準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果[6]。目前，菟絲子的鑒定方法有常規(guī)的形態(tài)學(xué)特征鑒定、化學(xué)分類標(biāo)記法、色譜法、細(xì)胞學(xué)鑒定等[7]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，現(xiàn)代分子生物學(xué)手段應(yīng)用于植物系統(tǒng)分類與品種鑒定的研究也越來越多，已有許多研究者[8-11]基于ITS、rps2、rbcL、trnL-F序列分析來鑒定區(qū)分菟絲子種類。菟絲子近幾年在新疆的傳播速度非?？?，造成的危害也日益嚴(yán)重，給甜菜、制干辣椒、甜葉菊、綠化林木、花卉均已造成嚴(yán)重影響。因菟絲子屬所有種類都是我國進(jìn)境檢疫對象[12]，新疆已報道的菟絲子種類在全國最多，對農(nóng)產(chǎn)品調(diào)運帶來較大麻煩，盡快明確新疆地區(qū)菟絲子的種類和分布有助于為檢疫部門提供參考依據(jù)。本研究從南北疆的農(nóng)田、綠化林帶、荒漠等區(qū)域采集不同寄主上的菟絲子的莖、花和種子，對其采用形態(tài)特征及ITS、rbcL、trnL-F序列分析將其鑒定到種，明確新疆菟絲子的種類，從而為檢疫部門確定檢疫對象和科學(xué)防除方案提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

從2017年7—10月份分別從巴音郭楞蒙古自治州、昌吉回族自治州、塔城地區(qū)、阿勒泰地區(qū)、石河子市周邊農(nóng)作物、田間雜草、綠化林木、果樹、花卉等25種不同寄主上采集菟絲子的莖、花和種子，裝入樣品袋中帶回實驗室進(jìn)行鑒定，樣品具體信息見表2。

1.2 鑒定方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將采集來60份菟絲子樣品直接目測并置于體式顯微鏡下，觀察莖的顏色和粗細(xì)，花的花序類型、花萼、花冠、雌蕊、雄蕊，種子的形狀、種皮顏色、質(zhì)感、種臍形狀、暈輪形狀等形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定[11,13-17]。

1.2.2 分子生物學(xué)鑒定

(1)菟絲子樣品DNA的提取。從60份菟絲子種子樣品中各取20粒，用75%乙醇處理30 s，10%次氯酸鈉處理5 min，蒸餾水沖洗3次。采用改進(jìn)的CTAB法提取樣品植物的DNA[18]。

(2)ITS、rbcL、trnL-F序列的PCR擴增。PCR反應(yīng)體系：2×PCR TaqMix (北京全式金生物)12.5 μL、10 μmol/L 上下游引物各1 μL(表1)、基因組DNA 0.5 μL、ddH2O 10 μL至終體積為25 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s (引物ITS5和ITS4；引物C和F)/55 ℃退火30 s (引物rbcL-f和rbcL-r)，72 ℃延伸40 s，30次循環(huán)；最后72 ℃延伸 10 min。反應(yīng)完成后，在1.2%～1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應(yīng)產(chǎn)物。

表1 PCR引物詳細(xì)信息Tab.1 PCR primer information

(3)ITS、rbcL、trnL-F序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。將不同引物的PCR反應(yīng)產(chǎn)物委托北京六合華大基因公司進(jìn)行測序。利用NCBI中BLAST和Clustal W軟件進(jìn)行同源性比較。選取不同地區(qū)不同寄主的菟絲子樣品25份，將測定獲得的ITS、rbcL、trnL-F序列在GenBank中用BLASTn程序分別下載同源序列。使用MEGA 6軟件，對序列進(jìn)行比對(alignment)，采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過自舉(bootstrap)對系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行檢驗，1000次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

通過形態(tài)學(xué)初步觀察，采集到的60份菟絲子樣品依據(jù)莖的顏色、粗細(xì)，花的顏色和大小，以及種子的顏色和大小等各類特征，將其大致先分為2類：序號1—23的菟絲子樣品的莖藤顏色大體為淡黃色至橘黃色，莖細(xì)絲狀，直徑為0.2～0.6 mm(圖1 A)；序號24—60的菟絲子，莖藤顏色大體為微紅色并有紫色瘤狀突起，莖較粗，直徑為1.2～2.8 mm(圖1B)。

A—田野菟絲子；B—單柱菟絲子。圖1 菟絲子莖形態(tài)特征Fig.1 stem morphologic characteristic of Cuscuta

序號1—23的菟絲子蒴果扁球形，不開裂。種子卵圓形，紅褐色至黃褐色，較小，長1.1～1.9 mm，寬0.8～1.1 mm，背面圓拱(圖2A)。種臍較短，橢圓形(圖3A)；序號24—60的菟絲子蒴果卵圓形或球形，周裂。種子橢圓形，灰白色至棕褐色，較大，長2.6～3.4 mm，寬2.0～2.7 mm。背面平或微凹(圖2B)。種臍較長，線形(圖3B)。

序號1—23的菟絲子的花白色，花長2～4 mm，具腺體，有花梗，聚集成頭狀的團傘花序。花萼包藏花冠筒，花萼5片，裂片卵形或近圓形，或?qū)挻笥陂L?；ü诹哑瑢捜菭?，銳尖。雄蕊短于裂片，花藥橢圓形，花絲比花藥長或與之等長。鱗片卵形，邊緣流蘇狀。子房球形。通?；ㄖ?，纖細(xì)，約等長于子房，柱頭頭狀(圖4 A)；序號24—60的菟絲子的花玫紅色或幾白色，花長3～4.5 mm，花無梗或具短梗，花序松散穗狀或穗狀圓錐花序?；ㄝ喟鼗ü谕玻ㄝ?片，裂片近半圓形，重迭，有紫色龍骨狀突起。

A—田野菟絲子；B—單柱菟絲子。圖2 菟絲子種子形態(tài)特征Fig.2 Seeds morphologic characteristic of Cuscuta

花冠裂片卵圓形，頂端鈍，裂片裂至圓筒的一半。鱗片齒狀，基部相連，并貼生在花冠上，頂端平截?；ㄋ師o柄，著生在花冠的喉部。子房球形?；ㄖ?，短，近與柱頭直徑等長，柱頭頭狀，中央有淺裂縫(圖4B)。

A—田野菟絲子；B—單柱菟絲子。圖3 菟絲子種子種臍形態(tài)特征Fig.3 Umbilici morphologic characteristic of Cuscuta

根據(jù)以上幾個形態(tài)特征將序號1—23菟絲子樣品鑒定為田野菟絲子，序號24—60樣品鑒定為單柱菟絲子。

2.2 分子鑒定結(jié)果

經(jīng)ITS、rbcL、trnl-F 3個序列擴增后測序結(jié)果顯示于下表2中，采集到的菟絲子樣品序號1—23經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)其ITS、rbcL、trnl-F序列均與GenBank數(shù)據(jù)庫內(nèi)已登錄的田野菟絲子的相應(yīng)序列同源性高達(dá)99%，序號24—60與經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)其ITS、rbcL、trnl-F序列均與GenBank數(shù)據(jù)庫內(nèi)已登錄的單柱菟絲子的相應(yīng)序列同源性高達(dá)99%，測序后將測序結(jié)果提交到GenBank，獲得ITS序列登錄號為MH 392340—392399，trnL-F序列登錄號為MH 392400—392459，rbcL序列已提交，還未獲得登錄號。

用MEGA 6軟件對所選取的25個菟絲子樣品的ITS，rbcL和trnL-F序列分別與從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的同源序列進(jìn)行比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5、圖6、圖7)。結(jié)果顯示，ITS序列、rbcL序列、trnL-F序列測定產(chǎn)物2、4、5、6、8、9、10、13、15、16、17、18、19、21、23分別與已登錄的相對應(yīng)的序列C.campestris(KT 430863)、C.campestris(EU 330268)、C.campestris(KU 761502)序列相似率達(dá)99%；11、20、28、30、33、42、47、50、52、59與已登錄的相對應(yīng)的序列C.monogyna(AY 554405)、C.monogyna(KJ 436686)、C.monogyna(KX 168400)序列相似率達(dá)99%；ITS，rbcL和trnL-F序列分析結(jié)果表明，序號1—23為C.campestris，24—60為C.monogyna，所以本研究采集到的菟絲子樣品經(jīng)分子鑒定主要分為田野菟絲子和單柱菟絲子2種，與形態(tài)鑒定結(jié)果一致。

圖5 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on alignment of ITS sequences data of Cuscuta samples

圖6 基于rbcL序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on alignment of rbcL sequences data of Cuscuta samples

圖7 基于trnL-F序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree based on alignment of trnL-F sequences data of Cuscuta samples

序號編號寄主采集地點采集日期分子鑒定ITSrbcLtrnL種名1K1鈴鐺刺庫爾勒22團3連2017-8-14田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris2K2加工番茄庫爾勒22團3連2017-8-14田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris3K3甜菜庫爾勒22團15連2017-8-14田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris4K4辣椒庫爾勒21團8連2017-8-15田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris5K5甜葉菊庫爾勒21團良繁連2017-8-15田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris6K6甜菜庫爾勒25團2連2017-8-16田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris7K7加工番茄庫爾勒25團農(nóng)技推廣站2017-8-16田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris8K8拉拉藤庫爾勒市市區(qū)2017-8-16田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris9K9矮牽?？{斯景區(qū)2017-8-16田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris10H1粉苞苣哈密市伊吾縣2017-8-17田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris11J1苦豆子第六師軍戶農(nóng)場2017-8-17單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna12T1蒼耳塔城163團4連2017-8-24田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris13T2蔥塔城163團4連2017-8-24田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris

表2續(xù)

序號編號寄主采集地點采集日期分子鑒定ITSrbcLtrnL種名14T3甜菜塔城163團4連2017-8-24田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris15T4田旋花塔城163團4連2017-8-24田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris16T5荊芥塔城163團4連2017-8-24田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris17T6小蓬草塔城163團4連2017-8-24田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris18T7苜蓿塔城168團4連2017-8-25田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris19T8蒼耳塔城市阿西爾鄉(xiāng)2017-8-25田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris20T9榆樹塔城阿西爾鄉(xiāng)2017-8-25單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna21A1小茴香阿勒泰188團9連2017-8-26田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris22E1榆樹額敏縣霍吉爾特鄉(xiāng)2017-8-26單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna23E2蒼耳額敏縣霍吉爾特鄉(xiāng)2017-8-26田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris24SHZ1苦豆子石河子市火車站2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna25SHZ2榆樹石河子市火車站2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna26SHZ3白蒿石河子市火車站2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna27SHZ4蕓香石河子市火車站2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna28SHZ5天仙子石河子市火車站2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna29SHZ6苦豆子石河子市農(nóng)墾科學(xué)院內(nèi)2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna30SHZ7鈴鐺刺石河子市農(nóng)墾科學(xué)院內(nèi)2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna31SHZ8榆樹石河子市農(nóng)墾科學(xué)院內(nèi)2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna32SHZ9蒼耳石河子市農(nóng)墾科學(xué)院內(nèi)2017-10-15田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.monogyna33SHZ10蘆葦石河子農(nóng)墾科學(xué)院內(nèi)2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna34SHZ11榆樹石河子市農(nóng)墾科學(xué)院內(nèi)2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna35SHZ12鈴鐺刺石河子市軍墾第一連2017-10-15田野菟絲子田野菟絲子田野菟絲子C.campestris36SHZ13蘋果樹石河子市軍墾第一連2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna37SHZ14苦豆子石河子市軍墾第一連2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna38SHZ15小蓬草石河子市軍墾第一連2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna39SHZ16榆樹石河子市143團2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna40SW1榆樹沙灣西樹窩子村2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna41SW2苦豆子沙灣縣西樹窩子村2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna42SW3白蒿沙灣縣西樹窩子村2017-10-15單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna43H1榆樹呼圖壁縣大豐鎮(zhèn)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna44H2苦豆子呼圖壁縣大豐鎮(zhèn)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna45H3榆樹呼圖壁縣五工臺鎮(zhèn)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna46H4苦豆子呼圖壁縣五工臺鎮(zhèn)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna47H5小蘋果樹呼圖壁縣五工臺鎮(zhèn)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna48H6榆樹呼圖壁縣縣城2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna49M1榆樹瑪納斯縣平原林場2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子(99%)單柱菟絲子C.monogyna50M2楊樹瑪納斯縣平原林場2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna51M3苦豆子瑪納斯縣平原林場2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna52M4梧桐樹瑪納斯縣平原林場2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子(99%)單柱菟絲子C.monogyna53M5榆樹瑪納斯縣蘭州灣鄉(xiāng)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna54M6苦豆子瑪納斯縣蘭州灣鄉(xiāng)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子(99%)單柱菟絲子C.monogyna55M7天仙子瑪納斯縣蘭州灣鄉(xiāng)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna56M8苦豆子瑪納斯廣東地鄉(xiāng)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna57M9榆樹瑪納斯縣廣東地鄉(xiāng)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna58M10白蒿瑪納斯縣廣東地鄉(xiāng)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna59M11枸杞瑪納斯縣廣東地鄉(xiāng)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna60M12榆樹瑪納斯縣包家店鎮(zhèn)2017-11-7單柱菟絲子單柱菟絲子單柱菟絲子C.monogyna

3 討論

菟絲子是世界性的雜草檢疫對象，多數(shù)種類對其寄主都會造成一定程度的損害，近年來引起許多研究者的關(guān)注。據(jù)報道[1,3]，全世界分布的菟絲子屬超過200種，我國大約有10種以上。目前報道記錄的新疆地區(qū)菟絲子的種類是最多的，并且分布最廣，危害最嚴(yán)重，其中陰知勤等[5]報道了新疆存在11種菟絲子，并描述了10種菟絲子的形態(tài)學(xué)特征、寄主及分布地區(qū)；馬德英等[4,19]報道了新疆伊犁地區(qū)有4種菟絲子，并對新疆農(nóng)田的8種菟絲子的種子外部形態(tài)特征和種胚形態(tài)進(jìn)行了研究；嚴(yán)麗等[20]調(diào)查發(fā)現(xiàn)阿勒泰地區(qū)有3種菟絲子。以上文獻(xiàn)報道調(diào)查的菟絲子種類都是基于菟絲子的莖、花和種子的形態(tài)特征進(jìn)行區(qū)分，而研究發(fā)現(xiàn)同種菟絲子的莖的顏色、粗細(xì)，花的大小、顏色和種子形態(tài)特征確實存在明顯差異[10]，并且對于新疆菟絲子種類調(diào)查不夠全面、鑒定方法單一，存在極高的不準(zhǔn)確率，所以菟絲子單一的形態(tài)學(xué)鑒定不能夠完全準(zhǔn)確的判定菟絲子的種類，需要加以分子輔助鑒定來進(jìn)一步明確。艾尼古麗等[11]通過形態(tài)學(xué)特征和分子輔助鑒定相結(jié)合鑒定新疆石河子地區(qū)僅有田野菟絲子和單柱菟絲子2種。

本研究采集了來自新疆不同地區(qū)的25種寄主上的60份菟絲子樣品，采用形態(tài)學(xué)特征和分子輔助鑒定相結(jié)合的方式，最終確定新疆地區(qū)的菟絲子主要是單柱菟絲子C.monogyna和田野菟絲子C.campestris2種，這與陰知勤等[5]報道的新疆存在11種菟絲子的結(jié)果有很大的差異，但本次研究所采集的菟絲子樣品數(shù)量有限，要更加準(zhǔn)確地確定新疆地區(qū)菟絲子種類還需要進(jìn)一步擴大采樣范圍，增加采樣數(shù)量。

4 結(jié)論

本研究在新疆南北疆各地菟絲子發(fā)生嚴(yán)重區(qū)域采集菟絲子樣品60份，采用形態(tài)學(xué)鑒定和分子輔助鑒定相結(jié)合的方法，對60份菟絲子樣品進(jìn)行鑒定，明確新疆菟絲子主要是2種，即單柱菟絲子C.monogyna和田野菟絲子C.campestris。采集的60份菟絲子樣品的寄主植物有25種，包括20種草本植物和5種木本植物。調(diào)查采樣時發(fā)現(xiàn)單柱菟絲子多寄生木本植物，也可寄生草本植物；田野菟絲子僅發(fā)現(xiàn)在草本植物上有寄生。