趙汗青，張博森，高峰

(新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院,新疆 石河子 832003)

赤霉素(Gibberellins，GA)是一種四環(huán)二萜類物質(zhì)，是自然界中廣泛存在的一種植物激素，在被子植物、裸子植物、真菌和細(xì)菌中均有廣泛分布[1]。赤霉素由日本植物病理學(xué)研究水稻惡苗病(Rice bakanae)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)。目前，已經(jīng)從植物、真菌和細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)赤霉素類物質(zhì)136種，其中GA3是目前研究最為清楚的一類赤霉素[2]。

大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)是一種土傳植物病原真菌，是引起我國(guó)棉花黃萎病的主要病原菌，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的巨大的危害，可以侵染棉花、向日葵等200多種重要的經(jīng)濟(jì)作物[3]。因大麗輪枝菌成功逃避寄主先天免疫的機(jī)制尚不清楚，加上植物種質(zhì)資源中抗原的缺乏，黃萎病目前并沒(méi)有有效的防治手段。

近期，中科院微生物所錢韋課題組[4-5]發(fā)現(xiàn)植物激素在植物-病原細(xì)菌跨界信號(hào)交流過(guò)程中發(fā)揮重要功能。在致病病原真菌中同樣有研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，毛霉和根霉菌可以通過(guò)響應(yīng)植物來(lái)源的赤霉素信號(hào)，增加其自身細(xì)胞壁中殼聚糖的含量。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，大麗輪枝菌侵染結(jié)構(gòu)和芽管細(xì)胞壁中含有一定量殼聚糖成分，并且與植物的赤霉素信號(hào)相關(guān)。我們推測(cè)這種細(xì)胞壁成分的動(dòng)態(tài)變化，可能與大麗輪枝菌逃避寄主的先天免疫相關(guān)。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是近年興起的一種高通量測(cè)序技術(shù)，可快速獲得某一物種特定組織或功能狀態(tài)下幾乎所有轉(zhuǎn)錄本及基因序列，運(yùn)用該技術(shù)對(duì)不同處理中的轉(zhuǎn)錄本比較和分析，有助于挖掘樣本在不同處理下的響應(yīng)情況[8-11]。本研究利用RNA-Seq比較分析了強(qiáng)致病力大麗輪枝菌菌株V592在GA3處理下的基因表達(dá)情況，進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析。研究結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步解析大麗輪枝菌響應(yīng)赤霉素信號(hào)的分子機(jī)制具有重要參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株為強(qiáng)致病力大麗輪枝菌V592,由石河子大學(xué)植物病理教研室提供。

赤霉素GA3購(gòu)自Sigma-Aldrich(CAS:G7645-6);NaNO3、K2HPO4和檸檬酸等其他常用試劑均為國(guó)產(chǎn)或者進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.2 樣品準(zhǔn)備

PDA(potato dextrose agar)培養(yǎng)基、Czapek’s液體培養(yǎng)基參照Z(yǔ)hao[12]的方法配置。

大麗輪枝菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為5～7 d，培養(yǎng)條件為26 ℃，避光。赤霉素GA3用無(wú)水乙醇溶解后用去離子水稀釋到10 μmol/L的工作濃度。

大麗輪枝菌分生孢子收集：V592平板上用無(wú)菌打孔器打取直徑1 cm的菌餅，將6～8塊菌餅接種到100 mL Czapek’s液體培養(yǎng)基中，26 ℃、200 rpm避光搖培2 d，經(jīng)4層紗布過(guò)濾收集孢子。

赤霉素誘導(dǎo)：將收集好的孢子懸浮在5 ml無(wú)菌水中，孢子濃度為1×108cfu·L-1，分裝為2份。分別將GA3母液和等量的無(wú)菌水加入至2份孢子懸浮液中，使赤霉素的終濃度為0.1 μmol·L-1，26 ℃，200 rpm避光震蕩1 h后離心收集分生孢子，去除上清，置于液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

取適量上述收集的分生孢子，使用Invitrogen公司的Trizol試劑盒提取總RNA，提取方法參照User Guide:TRIzol Reagent(Invitrogen)。

提取完畢后,用NanoPhotometer spectrophotometer分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度(OD260/OD280及OD260/OD230)。使用Agilent 2100 bioanalyzer來(lái)精確檢測(cè)RNA完整性。

1.4 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與質(zhì)檢

cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與檢測(cè)由北京諾禾致源公司完成。以片段化mRNA為模版，隨機(jī)寡核苷酸為引物，在M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系中合成cDNA第1條鏈。隨后用RNase降解RNA鏈，并在DNA polymerase I體系下，以dNTPs為原料合成cDNA第2條鏈。純化后的雙鏈cDNA經(jīng)過(guò)末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，用AMPure XP beads篩選250～300 bp左右的cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并再次使用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，最終獲得文庫(kù)。

文庫(kù)構(gòu)建完成后，先使用Qubit 2.0 Fluorometer進(jìn)行初步定量。對(duì)文庫(kù)稀釋至1.5 mg·L-1，隨后使用Agilent 2100 bioanalyzer對(duì)文庫(kù)的insert size進(jìn)行檢測(cè)，insert size符合預(yù)期后，qRT-PCR對(duì)文庫(kù)有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫(kù)有效濃度高于2 nmol·L-1)，以保證文庫(kù)質(zhì)量。

1.5 上機(jī)測(cè)序及測(cè)序數(shù)據(jù)組裝

轉(zhuǎn)錄組上機(jī)測(cè)序及測(cè)序數(shù)據(jù)組裝均由北京諾禾致源公司完成。使用平臺(tái)Illumina Hiseq 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)測(cè)序,測(cè)序條件為PE 150，雙端序列150 bp。對(duì)原始序列進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾：去除帶接頭(adapter)的reads，去除含N(N表示無(wú)法確定堿基信息)的reads以及去除低質(zhì)量reads，獲得較高質(zhì)量的序列。我們使用HISAT 2進(jìn)行spliced reads比對(duì)，并采用Trinity軟件進(jìn)行序列組裝，獲得2個(gè)樣品的功能基因。

1.6 基因差異表達(dá)分析及功能注釋

基因表達(dá)定量由北京諾禾致源公司完成，根據(jù)基因在參考基因組上的位置信息，統(tǒng)計(jì)每個(gè)基因從起始到終止范圍內(nèi)覆蓋的reads數(shù)目。采用subread軟件中的featureCounts工具對(duì)基因進(jìn)行表達(dá)水平的定量，featureCounts主要使用Q10-B-C參數(shù)，分別過(guò)濾掉比對(duì)質(zhì)量值低于10的reads，非成對(duì)比對(duì)上的reads，比對(duì)到基因組多個(gè)區(qū)域的reads?；虮磉_(dá)定量完成后，需要對(duì)其表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，篩選樣本在不同狀態(tài)下表達(dá)水平顯著差異的基因。

根據(jù)功能基因在處理組和對(duì)照組中的表達(dá)量進(jìn)行差異表達(dá)分析，使用edgeR軟件進(jìn)行差異顯著性分析(FC>1或者padj<0.05);差異表達(dá)基因的功能注釋由北京諾禾致源公司完成，采用clusterProfiler軟件對(duì)差異基因集進(jìn)行GO(Gene Ontology,http:// www.geneontology.org/)、功能富集分析，KEGG(Kyoto Encyclopedia of genes and genomes,http://www.gebime.jp/kegg/)通路富集分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麗輪枝菌GA3處理組和對(duì)照組總RNA質(zhì)量分析

對(duì)提取的GA3處理組和對(duì)照組總RNA的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。處理組和對(duì)照組總RNA完整性均大于8.0，且OD260/OD280均大于2.0，總RNA質(zhì)量濃度分別為172和181 mg·L-1，說(shuō)明樣品總RNA的完整性與純度合格達(dá)到測(cè)序要求。

表1 大麗輪枝菌總RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果Tab.1 RNA quality test results of Verticillium dahliae

2.2 大麗輪枝菌GA3處理組和對(duì)照組轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及測(cè)序數(shù)據(jù)組裝

利用Illumina Hiseq 2000對(duì)GA3處理組和對(duì)照組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)測(cè)序，數(shù)據(jù)質(zhì)量匯總?cè)绫?所示。大麗輪枝菌GA3處理組和對(duì)照組測(cè)序分別獲得8.28 G和7.98 G數(shù)據(jù)量，GC含量分別為59.07%和59.15%，其質(zhì)量值大于30的(Q30)分別為91.17%和91.23%，質(zhì)量值大于20(Q20)的分別為96.51%和96.54%。

采用Trinity軟件對(duì)去冗余后的高質(zhì)量序列進(jìn)行組裝，共獲得9184和9164個(gè)功能基因。

表2 大麗輪枝菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量匯總Tab.2 Summary of the quality of transcriptome sequencing data of Verticillium dahlia %

2.3 大麗輪枝菌GA3處理組和對(duì)照組轉(zhuǎn)錄組功能基因差異表達(dá)分析及功能注釋

2.3.1 顯著差異表達(dá)基因(DEGs)

通過(guò)差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)分析，與無(wú)菌水處理的對(duì)照組相比，大麗輪枝菌GA3處理組中共有161個(gè)DEGs，其中70個(gè)上調(diào)基因，91個(gè)下調(diào)基因。

2.3.2 GO功能富集分析

GO功能富集以padj小于0.05作為為顯著性富集的閾值，對(duì)98個(gè)DEGs進(jìn)行GO功能富集分析。其中43個(gè)上調(diào)和55個(gè)下調(diào)的DEGs被標(biāo)記為30個(gè)功能類別，其中包括16個(gè)生物過(guò)程(BP)、3個(gè)細(xì)胞組分(CC)和11個(gè)分子功能(MF)。生物過(guò)程(BP)中最主要的是單一生物過(guò)程，其次是單一生物代謝過(guò)程、氧化還原過(guò)程、有機(jī)酸代謝過(guò)程和蛋白質(zhì)復(fù)合物亞基組織等；細(xì)胞組分(CC)中最主要的是膜的積分分量，其次是宿主細(xì)胞核、宿主細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器、宿主細(xì)胞內(nèi)膜有界細(xì)胞器；分子功能(MF)中最主要的是氧化還原酶活性，其次是NAD或NADP作為受體，輔因子結(jié)合等。這證明了單一生物過(guò)程、氧化還原過(guò)程、有機(jī)酸代謝過(guò)程、宿主細(xì)胞核和氧化還原酶等功能可能與大麗輪枝菌響應(yīng)赤霉素有關(guān)(圖1)。

縱坐標(biāo)為差異基因表達(dá)數(shù)；橫坐標(biāo)為GO Term，生物過(guò)程(BP,1—16):1—單一生物代謝過(guò)程;2—己糖生物合成過(guò)程;3—單糖生物合成過(guò)程;4—調(diào)節(jié)DNA代謝過(guò)程;5—氧化還原過(guò)程;6—輔酶代謝過(guò)程;7—蛋白質(zhì)復(fù)合物亞基組織;8—有機(jī)酸代謝過(guò)程;9—單一生物過(guò)程;10—三羧酸代謝過(guò)程;11—輔助因子代謝過(guò)程;12—甘露糖生物合成過(guò)程;13—氰酸代謝過(guò)程;14—羧酸代謝過(guò)程;15—含氧酸代謝過(guò)程;16—硫氨基酸生物合成過(guò)程；分子功能(MF,17-27):17—氧化還原酶活性;18—蘋果酸脫氫酶活性;19—氧化還原酶活性，作用于供體的CH-OH基團(tuán);20—輔酶結(jié)合;21—亞甲基四氫葉酸脫氫酶(NADP +)活性;22—四吡咯結(jié)合;23—氧化還原酶活性，作用于供體的CH-OH基團(tuán)，NAD或NADP作為受體;24—輔因子結(jié)合;25—蛋白質(zhì)組氨酸激酶活性;26—磷酸甘露糖酶活性;27—磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，含氮基團(tuán)作為受體；細(xì)胞組成(CC,28-30):28—宿主細(xì)胞核;29—宿主細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器;30—宿主細(xì)胞內(nèi)膜有界細(xì)胞器。圖1 差異表達(dá)基因GO功能注釋Fig.1 GO classification of all differentially expressed genes

2.3.3 KEGG通路分析

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的綜合性數(shù)據(jù)庫(kù)。為了解大麗輪枝菌在赤霉素處理情況下差異表達(dá)基因(DEGs)參與的代謝途徑，通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEGs進(jìn)行分析共有68個(gè)上調(diào)的DEGs和30個(gè)下調(diào)的DEGs被標(biāo)注于20個(gè)KEGG通絡(luò)中，結(jié)果如圖2A所示。次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成途徑(KEGG ID-vda01110,共有26個(gè)DEGs被標(biāo)注)是最顯著的(圖2B)，其次是丙酮酸代謝(KEGG ID:vda00620,共有7個(gè)DEGs被標(biāo)注)，乙醛酸和二羧酸根陰離子代謝(KEGG ID:vda00100,共有6個(gè)DEGs被標(biāo)注)，抗生素生物合成代謝(KEGG ID:vda01130，共有17個(gè)DEGs被標(biāo)注)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與大麗輪枝菌響應(yīng)外源赤霉素相關(guān)的代謝通路主要包括次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成途徑、丙酮酸代謝和乙醛酸和二羧酸根陰離子代謝等。

A—KEGG富集通路差異表達(dá)基因數(shù)量;B—KEGG富集通路顯著性分析;1—次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成，2—丙酮酸代謝，3—乙醛酸和二羧酸根陰離子代謝，4—生物合成的抗生素，5—碳代謝，6—類固醇生物合成，7—果糖和甘露糖代謝，8—羧酸循環(huán)，9—苯丙烷代謝，10—糖酵解-糖質(zhì)新生，11—氮代謝，12—精氨酸和脯氨酸代謝，13—硫代謝，14—丙氨酸，15—天門冬氨酸和谷氨酸代謝，16—苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代謝，17—精氨酸生物合成，18—酮戊二酸代謝，19—氨基甲酸代謝，20—淀粉和蔗糖代謝，其他多糖降解。圖2 差異表達(dá)基因KEGG功能分類Fig.2 KEGG classification of all differentially expressed genes

3 結(jié)論與討論

對(duì)大麗輪枝菌響應(yīng)外源赤霉素GA3進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析和差異表達(dá)分析，結(jié)果表明，大麗輪枝菌中多種生物過(guò)程及代謝通路參與了對(duì)外源赤霉素的響應(yīng)。

根據(jù)HéRIVAUX A等[13]研究發(fā)現(xiàn)，人們僅在幾種早期分化真菌中鑒定到了識(shí)別植物激素信號(hào)的受體，但是這些真菌都屬于根際共生真菌或者內(nèi)生真菌，在高等病原真菌并沒(méi)有相關(guān)報(bào)道，也并未在真菌中發(fā)現(xiàn)與響應(yīng)赤霉素相關(guān)的基因。植物中的識(shí)別赤霉素的機(jī)制、赤霉素的代謝網(wǎng)絡(luò)和次生壁的合成機(jī)制研究的較為清楚[14-15]，但我們并沒(méi)有在真菌基因組中找到相關(guān)的同源蛋白，說(shuō)明真菌響應(yīng)赤霉素的機(jī)制可能與植物不同有關(guān)。真菌細(xì)胞壁作為一個(gè)活的細(xì)胞器，其組分是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，大麗輪枝菌侵染結(jié)構(gòu)和芽管細(xì)胞壁中含有一定量殼聚糖成分，并且與植物的赤霉素信號(hào)相關(guān)。

我們研究發(fā)現(xiàn)，大麗輪枝菌在響應(yīng)赤霉素過(guò)程中，差異表達(dá)基因主要富集在次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成途徑，并且相較于對(duì)照組全部為上調(diào)表達(dá)，這與禾谷鐮刀菌在侵染早期的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究[16]結(jié)果一致。在大麗輪枝菌和鐮刀菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究中發(fā)現(xiàn)，次級(jí)代謝產(chǎn)物磺胺醋酰和單端孢霉烯霉菌毒可以在侵染早期幫助病原菌侵染宿主[17-18]，說(shuō)明次級(jí)代謝產(chǎn)物合成在真菌侵染宿主植物的致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。赤霉素是植物的主要激素之一，在病原菌早期的侵染過(guò)程中，赤霉素可能作為一個(gè)跨界信號(hào)而被大麗輪枝菌識(shí)別。因此，我們推測(cè)大麗輪枝菌在響應(yīng)外源赤霉素過(guò)程中，部分次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)可能與侵染宿主早期的致病過(guò)程有關(guān)。