李 芳， 劉羅根， 黃 果， 戈 欣， 歐陽靖霖, 章運生, △

(1湖南環(huán)境生物職業(yè)技術學院化學教研室， 湖南 衡陽 421005；2南華大學附屬第二醫(yī)院臨床研究所，3湖南省乳甲疾病防治臨床醫(yī)學研究中心， 4南華大學附屬第二醫(yī)院超聲醫(yī)學科， 湖南 衡陽 421001)

F-box蛋白是一類含有F-box結構域的蛋白家族[1]。F-box結構域位于F-box蛋白的N端，與SKP1和cullin蛋白結合成SCF(SKP1-CUL1-F-box)E3泛素連接酶復合體[2-3]。F-box蛋白的C端主要參與特異性底物蛋白的識別。F-box蛋白的功能主要與腫瘤發(fā)生發(fā)展[4]、細胞周期調控[5]、上皮細胞間質轉化[6]、細胞代謝[7]和生殖發(fā)育[8-9]等過程相關，例如F-box蛋白家族成員FBXO31能夠選擇性降解cyclin D1來誘導G1期的阻滯，但對cyclin B1和周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases, CDKs)以及CDK抑制因子p14和p27等沒有影響，其中cyclin D1正是G1/S期的關鍵調控因子;另外兩種F-box蛋白家族成員FBXO4和FBXW8也能夠介導cyclin D1的降解來阻滯細胞周期G1進程[6]。

FBXO39是F-box蛋白家族成員之一，目前在乳腺癌、結腸癌、甲狀腺未分化肉瘤、卵巢和肺癌均發(fā)現(xiàn)其表達[10]。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)其高表達于成年男性睪丸組織中，而在其它大部分正常器官組織中表達缺失或低表達。因此，F(xiàn)BXO39被認為是一種新的腫瘤/睪丸抗原[11]。在骨肉瘤U-2OS細胞中，敲減FBXO39的表達能夠抑制細胞的增殖，并促進腫瘤細胞凋亡[12]。在乳腺癌中，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)FBXO39在2種乳腺癌細胞系(MCF-7和MDA-MB-231)和臨床乳腺癌標本中都有表達，但在正常乳腺組織中表達缺失[13]。因此，F(xiàn)BXO39被認為參與了乳腺癌的發(fā)生，但其具體機制目前尚不清楚。已知，F(xiàn)-box結構域對于F-box蛋白的分子功能起到了至關重要的作用[1]。F-box結構域對FBXO39蛋白的細胞定位和功能是否產生影響呢？細胞定位的改變對FBXO39蛋白的功能是否有影響呢？本課題采用缺失突變的方法，構建F-box結構域缺失的真核表達載體pEGFP-FBXO39ΔF及其野生型pEGFP-FBXO39轉染在乳腺癌MCF-7細胞，探究F-box結構域對FBXO39蛋白的細胞定位及功能的影響。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

pEGFP-C2質粒、大腸桿菌DH5α和乳腺癌MCF-7細胞由本實驗室保存；限制性內切酶HindIII和KpnI，高保真DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DpnI酶及PNK磷酸化酶均購自Fermentas；DNA純化試劑盒、無內毒素質粒提取試劑盒和逆轉錄試劑盒等購于天根公司；轉染試劑Lipofectamine 2000和RNA提取試劑(TRIzol)購自Invitrogen；FBXO39多克隆抗體以及山羊抗兔II抗購于Sigma；Alexa Fluor 488標記的熒光II抗購于Jackson；DAPI購于碧云天公司；EdU試劑盒購于恒宇生物公司。

2 主要方法

2.1引物設計與合成 使用Primer 5.0軟件設計FBXO39和FBXO39ΔF載體構建的上、下游引物，以及用于RT-PCR檢測的上、下游引物，并由Invitrogen合成(序列見表1)。

表1 引物序列

2.2目的基因的擴增 以MCF-7細胞cDNA為模板，PCR擴增FBXO39基因的ORF序列。反應體系為2×Phusion Master Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，cDNA模板 1 μL，ddH2O 20 μL。反應條件為 98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。取3 μL PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳確定得到的目的片段大小。利用DNA純化回收試劑盒純化PCR產物的基因片段。

2.3pEGFP-FBXO39 和pEGFP-FBXO39ΔF重組質粒的構建Hind III和KpnI雙酶切目的基因FBXO39和pEGFP-C2空載體，DNA純化回收試劑盒回收酶切片段，使用T4 DNA連接酶于16 ℃連接過夜。將連接產物轉入DH5α感受態(tài)細胞后，接種于含卡那霉素的LB平板上。培養(yǎng)12 h后，挑取若干單菌落。經菌液PCR和DNA測序驗證為正確的pEGFP-FBXO39重組質粒。

以pEGFP-FBXO39重組質粒為模板，PCR擴增含F(xiàn)BXO39ΔF(F-box結構域缺失)的質粒片段。反應體系如上述步驟2.2，反應條件為98 ℃ 30 s;98 ℃ 10 s、47 ℃ 30 s、72 ℃ 3 min，共25個循環(huán);72 ℃ 5 min。DNA純化回收試劑盒純化PCR產物后，DpnI酶切PCR模板質粒。再次純化酶切產物后，經PNK酶磷酸化PCR的產物末端。利用T4 DNA連接酶于16 ℃連接過夜。經轉化、菌液PCR和DNA測序鑒定為pEGFP-FBXO39ΔF重組質粒。

2.4細胞培養(yǎng)與轉染 人乳腺癌細胞MCF-7在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液 (青霉素1×105U/L，鏈霉素1×105U/L)中，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

取對數(shù)期生長的細胞，經胰蛋白酶消化后，鋪入6孔細胞培養(yǎng)板。待12 h后，取4 μg上述重組質粒分別與250 μL Opti-MEMI無血清培養(yǎng)基和10 μL Lipofectamine 2000混勻。室溫孵育20 min后，加入6孔細胞培養(yǎng)板中。轉染4～6 h后，需要更換新鮮的正常DMEM(包含血清和抗生素)的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h。

2.5總RNA提取和RT-PCR 采用TRIzol試劑提取pEGFP-C2、 pEGFP-FBXO39 和pEGFP-FBXO39ΔF質粒轉染的MCF-7細胞總RNA。并用核酸蛋白測定儀測定RNA濃度和純度。然后采用Quant One Step RT-PCR試劑盒(天根)對所提取的RNA進行cDNA逆轉錄。最后用RT-PCR方法檢測FBXO39在mRNA水平上的表達。反應體系為2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板 1 μL，ddH2O 7 μL。反應條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。取3 μL PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳確定FBXO39相對表達量，以β-actin為內參照。

2.6Western blot實驗 將MCF-7細胞分別轉染pEGFP-C2、pEGFP-FBXO39 和pEGFP-FBXO39ΔF質粒。24～48 h后提取細胞總蛋白。經SDS-PAGE后，轉移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶中室溫孵育2 h?？笷BXO39抗體(1 ∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜。后加入HRP標記的山羊抗兔II抗(1 ∶5 000稀釋)室溫孵育1 h。經ECL化學發(fā)光試劑上機曝光顯色并拍照。

2.7細胞定位實驗 將pEGFP-FBXO39 和pEGFP-FBXO39ΔF質粒分別轉入MCF-7細胞。24 h后加入預冷PBS洗滌3次，每次5 min。后加入4%多聚甲醛室溫固定30 min。PBS洗滌后，DAPI染核10 min，指甲油封片。共聚焦熒光顯微鏡觀察FBXO39和FBXO39ΔF蛋白在MCF-7中的細胞定位。

2.8細胞免疫熒光觀察 將MCF-7細胞接種于細胞爬片12 h后，加入預冷PBS洗滌3次，每次5 min。4%多聚甲醛室溫固定30 min后，0.1%Triton X-100細胞打孔10 min。經PBS洗滌后，加入5%血清封閉1 h?？笷BXO39抗體(1 ∶100稀釋)4 ℃孵育過夜，加入紅色熒光II抗(1 ∶250稀釋)避光室溫孵育1 h。DAPI染核10 min，指甲油封片。共聚焦熒光顯微鏡觀察內源性FBXO39蛋白在MCF-7中的細胞表達和定位。

2.9流式細胞術 將MCF-7細胞分別轉染pEGFP-C2、pEGFP-FBXO39 和pEGFP-FBXO39ΔF質粒。24～48 h后經胰蛋白酶消化收集細胞。預冷PBS洗滌3次，每次5 min。后加入75%乙醇固定。送賽維爾生物科技有限公司進行流式細胞周期檢測分析。

2.10MTT和EdU實驗檢測細胞增殖 將MCF-7細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板12 h后，分別轉染pEGFP-C2、pEGFP-FBXO39 和pEGFP-FBXO39ΔF質粒，每種質粒轉染設置5個復孔。24、48和72 h后分別加入2 g/L的MTT試劑。37 ℃孵育4 h后，加入150 μL DMSO。以490 nm波長上機檢測其吸光度(A)值。

將MCF-7細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板12 h后，分別轉染pEGFP-C2、pEGFP-FBXO39 和pEGFP-FBXO39ΔF質粒。24 h后加入2×EdU工作液孵育2 h。按照EdU試劑盒說明書對細胞進行染色，熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.11免疫組化染色 從病理科獲取乳腺癌及其癌旁組織的石蠟切片。經脫水、滅活、抗原修復和封閉等步驟后，滴加抗FBXO39抗體(1 ∶300稀釋)4 ℃孵育過夜。PBS沖洗后，滴加II抗室溫孵育30 min。后經復染、脫水、透明和封片。倒置顯微鏡觀察并拍照。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對各數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組差異比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 pEGFP-FBXO39 和pEGFP-FBXO39ΔF重組質粒的構建及鑒定

以MCF-7細胞的cDNA為模板，PCR擴增FBXO39基因的ORF，得到大小為1 348 bp的片段，見圖1A。經限制性內切酶HindIII和KpnI雙酶切后，利用T4 DNA連接酶與真核表達載體pEGFP-C2相連接，見圖1B。以pEGFP-FBXO39為模板，PCR擴增含F(xiàn)BXO39ΔF(F-box結構域缺失)的質粒片段約6 000 bp左右，見圖1C。經DpnI酶消化以及PNK酶磷酸化后，利用T4 DNA連接酶連接PCR產物，組成pEGFP-FBXO39ΔF載體，見圖1B。菌液PCR結果顯示，擴增出大小為1 300 bp左右的FBXO39基因片段和大小為1 200 bp左右的FBXO39ΔF基因片段，見圖1D。DNA測序結果證實，所獲得的重組質粒目的片段序列與預期完全相符，見圖1E。表明pEGFP-FBXO39 和pEGFP-FBXO39ΔF重組質粒構建成功。

Figure 1. Construction and identification of recombinant plasmids. A: theFBXO39gene fragment was detected by agarose gel electrophoresis; B: schematic of pEGFP-FBXO39 and pEGFP-FBXO39ΔF (F-box domain deletion mutation) expression vectors; C:the pEGFP-FBXO39ΔF vector was detected by agarose gel electrophoresis; D:theFBXO39andFBXO39ΔFfragments were detected by agarose gel electrophoresis; E: DNA sequencing of pEGFP-FBXO39 and pEGFP-FBXO39ΔF vectors.

圖1 重組質粒的構建與鑒定

2 FBXO39與FBXO39ΔF在MCF-7細胞中的表達

分別將pEGFP-C2、pEGFP-FBXO39和pEGFP-FBXO39ΔF質粒轉染MCF-7細胞。24 h后，利用熒光顯微鏡觀察轉染效率，發(fā)現(xiàn)3種質粒的轉染效率都超過70%，見圖2A。我們首先通過RT-PCR檢測FBXO39和FBXO39ΔF在MCF-7細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)與空質粒對照組相比，轉染重組質粒細胞中FBXO39和FBXO39ΔF的mRNA水平顯著增加，見圖2B。進一步通過Western blot檢測了GFP-FBXO39及GFP-FBXO39ΔF蛋白在MCF-7細胞中的表達情況，發(fā)現(xiàn)2種蛋白均成功在細胞中表達，見圖2C。上述結果說明pEGFP-FBXO39 和pEGFP-FBXO39ΔF重組質粒在MCF-7細胞中都成功獲得表達。

Figure 2. The expressions of FBXO39 and FBXO39ΔF in the MCF-7 cells. A: transfection efficiency of pEGFP-C2, pEGFP-FBXO39 and pEGFP-FBXO39ΔF vectors was observed by fluorescence microscope. The scale bar=100 μm;B: the expression of FBXO39 and FBXO39ΔF was detected by RT-PCR at mRNA level; C:the expression of FBXO39 and GFP-FBXO39ΔF was detected by Western blot at protein level.

圖2 FBXO39與FBXO39ΔF在MCF-7細胞中的表達

3 FBXO39與FBXO39ΔF在MCF-7細胞中的定位

為了研究F-box結構域對FBXO39蛋白細胞定位的影響，我們將pEGFP-FBXO39和pEGFP-FBXO39ΔF質粒轉染MCF-7細胞后用共聚焦熒光顯微鏡觀察目的蛋白在細胞中的定位。結果顯示，F(xiàn)BXO39在細胞質中均勻分布；FBXO39ΔF也定位在細胞質中，見圖3A。此外，細胞免疫熒光技術結果顯示內源性FBXO39蛋白也主要表達在細胞質中，見圖3B。上述結果表明F-box結構域對FBXO39蛋白的細胞定位沒有影響。

4 FBXO39與FBXO39ΔF對MCF-7細胞增殖的影響

為了進一步研究F-box結構域對FBXO39蛋白生物學功能的影響，我們將pEGFP-C2、pEGFP-FBXO39和pEGFP-FBXO39ΔF質粒轉染MCF-7細胞，MTT法檢測FBXO39和FBXO39ΔF對MCF-7細胞活力的影響，結果顯示，與空質粒對照組相比，F(xiàn)BXO39顯著地促進了細胞的活力(P<0.05)；而FBXO39ΔF組對細胞活力無明顯影響(P>0.05)，見圖4A。此外，EdU染色結果也顯示，F(xiàn)BXO39促進了細胞的增殖；FBXO39ΔF對細胞的增殖幾乎沒有影響，見圖4。上述結果表明F-box結構域在FBXO39對MCF-7細胞的增殖過程起著至關重要的作用。

5 FBXO39與FBXO39ΔF對MCF-7細胞周期的影響

為了進一步研究F-box結構域對FBXO39蛋白促進細胞增殖能力的影響，我們將pEGFP-C2、pEGFP-FBXO39和pEGFP-FBXO39ΔF質粒轉染MCF-7細胞，流式細胞術檢測FBXO39和FBXO39ΔF對MCF-7細胞周期的影響。結果顯示，與空質粒對照組相比，F(xiàn)BXO39組細胞處于S期的比例明顯增加，處于G1期的細胞比例明顯減少，表明FBXO39能夠促進細胞增殖；然而，F(xiàn)BXO39ΔF組細胞比例沒有發(fā)生顯著性變化，見圖5A。此外，Western blot檢測細胞周期相關蛋白cyclin E1和cyclin D1的表達情況，發(fā)現(xiàn)FBXO39抑制了cyclin E1和cyclin D1的表達；同樣地，F(xiàn)BXO39ΔF組沒有發(fā)生顯著性變化，見圖5B，說明F-box結構域的缺失可能抑制了FBXO39在細胞周期調控方面的作用。

Figure 3. The cellular localization of FBXO39 and FBXO39ΔF in the MCF-7 cells. A: the cellular localization of GFP-FBXO39 and GFP-FBXO39ΔF was observed under confocal fluorescence microscope in the MCF-7 cells; B:cellular localization of FBXO39 was analyzed by immunofluorescence staining. The scale bar=10 μm.

圖3 FBXO39與FBXO39ΔF在MCF-7細胞中的定位

6 FBXO39在乳腺癌組織中的表達及臨床意義

為了探究FBXO39在乳腺癌組織中表達的臨床意義，我們利用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com/analysis/)分析了FBXO39表達與乳腺癌患者生存期的相關性，結果發(fā)現(xiàn)高表達FBXO39患者具有較好的生存期，見圖6A。此外我們利用免疫組化的方法分析了FBXO39在乳腺癌及其癌旁組織中的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)FBXO39高表達于乳腺癌組織中，見圖6B，提示FBXO39可能與乳腺癌的發(fā)生相關。

討 論

F-box蛋白是一類廣泛存在于真核生物中的蛋白家族，該蛋白家族都含有F-box結構域，該結構域由大約50個氨基酸殘基構成，位于F-box蛋白的N端，介導底物蛋白的泛素化水解[14-15]。F-box蛋白C端也存在一些相對保守的結構域，介導底物蛋白的特異性識別。根據(jù)C端結構域的不同，可以將F-box蛋白家族分為3個亞家族[16]：FBXW亞家族，包含WD40重復結構域；FBXL亞家族，富含亮氨酸重復序列；FBXO亞家族，這類F-box蛋白C端包含多種類的結構域并且功能暫時還不明確， FBXO39蛋白就是屬于該亞家族[1]。

Figure 4. FBXO39 promoted MCF-7 cell proliferation. A: the effect of FBXO39 and FBXO39ΔF on the cell viability was analyzed by MTT assay in the MCF-7 cells;B: the effect of FBXO39 and FBXO39ΔF on the cell proliferation was detected by EdU assay. The scale bar=100 μm. Mean±SD.n=3.*P<0.05vspEGFP-C2 group.

圖4 FBXO39促進MCF-7細胞增殖

Figure 5. The cell cycle analysis. A: the cell cycle was analyzed by flow cytometry in the MCF-7 cells after transfection with pEGFP-C2, pEGFP-FBXO39 and pEGFP-FBXO39ΔF vectors; B:the protein expression of cell cycle-related proteins (cyclin E1and cyclin D1) was detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P<0.05vspEGFP-C2 group.

圖5 細胞周期分析

Figure 6. The expression and clinical significance analysis of FBXO39 in breast cancer. A: the survival analysis of the breast cancer patients in Kaplan-Meier Plotter database. The log-rank test was used to evaluate the clinical significance of FBXO39 expression; B:immumohistochemical staining showed that FBXO39 expression in breast cancer and tumor-adjacent tissues.

圖6 FBXO39在乳腺癌中的表達及臨床意義分析

FBXO39是通過SEREX免疫篩選技術篩選發(fā)現(xiàn)的一個新的CT抗原[11]，在正常的睪丸組織和多種腫瘤組織中其mRNA呈高表達[17]。在結腸癌中，F(xiàn)BXO39的表達被認為是腫瘤轉移的危險指標，具有重要的臨床意義[18]。在對乳腺癌的研究中也發(fā)現(xiàn)，多種乳腺癌組織以及2種乳腺癌細胞系中FBXO39的mRNA水平表達上調[13]，以上的研究結果在一定程度上說明了FBXO39可能具有癌基因的功能。然而，Yang等[19]在研究泌尿上皮腫瘤中DNA甲基化的時候發(fā)現(xiàn)FBXO39基因在該種類型的腫瘤中出現(xiàn)普遍甲基化現(xiàn)象，提示FBXO39可能具有抑癌基因的特點。Ponsuksili等[20]在研究豬的下丘腦數(shù)量控制基因座的時候，發(fā)現(xiàn)FBXO39就位于其中，并暗示FBXO39的功能可能與動物的適應行為以及生物鐘調節(jié)有關。根據(jù)目前的研究進展來看，對于FBXO39在腫瘤中的具體功能仍不明確[10]。

在本研究中，F(xiàn)BXO39過表達能夠促進乳腺癌細胞增殖，具有癌基因的特點；FBXO39在乳腺癌組織中表達高于癌膀組織，也具有癌基因的特點。但在生存期統(tǒng)計中高表達FBXO39的患者預后反而較好，具有抑癌基因的特點。二者結論相反。根據(jù)我們的實驗結果和文獻報道[13]，我們考慮FBXO39是一個抑癌基因。在乳腺癌發(fā)生過程中，可能是其它基因(如BRCA1/2等)或環(huán)境因素主導發(fā)生的，F(xiàn)BXO39部分參與了抑癌過程。當正常細胞癌變后，F(xiàn)BXO39可能是受到癌變過程中其它因素或癌細胞本身的反饋調控、刺激或突變而呈現(xiàn)高表達狀態(tài)和“癌基因”特點，此時外源過表達FBXO39會促進腫瘤細胞的增殖，例如抑癌基因p53能夠通過功能性突變變成一個“癌基因”促進乳腺癌的發(fā)生[21]。因此，對于FBXO39到底是癌基因還是抑癌基因這個問題，需要今后進一步深入研究才能準確回答。但可以肯定的是，F(xiàn)BXO39參與了乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生[12-13, 18]。

本課題的研究結果證實了FBXO39能夠促進乳腺癌MCF-7細胞的增殖。F-box結構域影響FBXO39蛋白的功能，但不影響它的細胞定位。此外，我們的研究進一步證實FBXO39可能與乳腺癌的發(fā)生相關。本研究明確了后續(xù)的研究方向，對進一步探究FBXO39蛋白的作用機制有重要意義。