胡志祥 鄒丹陽 廖春潔 鄭 昕 倪禮楠 尚夢雅 閆靜敏 周平玉,*

1.安徽醫(yī)科大學上海皮膚病臨床學院（上海 200050）；2.上海市皮膚病醫(yī)院

梅毒（Syphilis）是由梅毒螺旋體(TreponemaPallidum,TP)感染引起的在全球范圍內(nèi)廣泛流行的慢性、系統(tǒng)性性傳播疾病[1]。在中國，梅毒已經(jīng)超越淋病成為最常見的性傳播疾病，穩(wěn)居我國傳染病的前三位，數(shù)據(jù)顯示2017年我國有超過47萬人新感染梅毒[2]。

已知梅毒螺旋體可侵犯人體各器官組織引起不同的病理損傷并出現(xiàn)相應的臨床表現(xiàn)，而迄今梅毒螺旋體對人體睪丸的病理損傷及精子影響的研究鮮少有報道?；谛挛魈m兔的梅毒模型與人類的梅毒感染有很多相似之處[3]，本研究將梅毒螺旋體接種新西蘭兔睪丸，研究梅毒螺旋體感染后不同時間點睪丸的形態(tài)學改變、病理損傷及其對精子的影響，以期初步認識梅毒螺旋體對男性生殖系統(tǒng)的影響。

材料和方法

一、實驗動物

純種新西蘭雄兔購于上海奉賢輝煌養(yǎng)殖場[SCXK（滬）2009-0022]，體質(zhì)量 2.8～3.5 kg，兔齡在 3個月左右，飼養(yǎng)于不銹鋼干養(yǎng)式兔籠中，飼料（上海仕林生物科技有限公司）及飲水均不含抗生素。

二、菌株

Nichols標準株由美國華盛頓大學梅毒研究團隊饋贈、廈門大學附屬中山醫(yī)院檢驗科轉(zhuǎn)贈。

三、主要試劑

10%福爾馬林溶液由1份40%甲醛（西隴化工股份有限公司，廣東汕頭）與9份雙蒸水配制而成，梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗（TPPA）和甲苯胺紅不加熱反應素試驗（TRUST）試劑均由上海市榮盛生物藥業(yè)有限公司提供。蘇木素伊紅試劑盒與Warthin-Starry試劑盒分別由上海杰浩生物有限公司和美國abcam公司提供。

四、實驗方法

（一）菌株的接種

將12只新西蘭兔稱量后隨機分為8只活性菌株接種組和4只滅活菌株接種對照組。接種前采集所有家兔的外周血進行檢測以排除梅毒螺旋體的感染。活性菌株接種組：從-80℃冰箱中取出加有50%甘油的凍存菌株，置于37℃水浴鍋中快速融化解凍菌株。將新西蘭兔麻醉后，用醫(yī)用安爾碘消毒陰囊區(qū)域進行雙側(cè)睪丸接種，每側(cè)睪丸注射暗視野顯微鏡下TP計數(shù)為3×107個/mL的Nichols株各1mL。滅活菌株接種對照組：所用接種菌株均經(jīng)過56℃水浴鍋水浴1h，其余條件均和活性菌株接種組相同。將所有接種后的新西蘭兔隨機分為3d組、7d組、14d組和21d組，保證每個時間點的分組內(nèi)包括2只活性菌株接種的新西蘭兔和1只滅活菌株接種的新西蘭兔。

（二）睪丸形態(tài)學觀察

接種前和接種后每隔3d觀察、觸診并記錄所有新西蘭兔睪丸形態(tài)學變化情況，包括大小、硬度、水腫程度、回縮狀況和潰瘍發(fā)生情況。

（三）睪丸組織學觀察

在接種后的第3天、第7天、第14天和第21天用空氣栓塞法處死對應時間段分組的新西蘭兔并剝離睪丸組織，用組織剪剪去每側(cè)睪丸的中末端，于10%福爾馬林溶液充分固定后，送至上海市皮膚病醫(yī)院病理科經(jīng)取材、乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋和切片后分別進行HE染色和Warthin-Starry鍍銀染色（W-S）。HE染色：石蠟切片經(jīng)常規(guī)烘烤脫蠟水化后進行蘇木素染色、藍化伊紅復染、脫水、透明、樹脂封片。W-S鍍銀染色：石蠟切片進行常規(guī)脫蠟水化，于螺旋預備液常溫處理5分鐘后浸泡于已預熱的0.5%硝酸銀溶液3～5min，將切片置于還原液中浸染1～5min（此過程于65～70℃震蕩水浴鍋內(nèi)進行），之后進行熱純水沖洗、脫水、透明、樹脂封片。閱片由專業(yè)病理人員在光學顯微鏡下進行。

（四）兔外周血樣本的采集

于處死家兔的4個時間點用真空抗凝管經(jīng)兔耳緣靜脈采血2mL，經(jīng)3000×g離心5min后取上層血清行梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗（TPPA）和甲苯胺紅不加熱反應素試驗（TRUST）檢測。

結(jié) 果

一、不同時間點兔睪丸的形態(tài)學變化

活性菌株接種組睪丸形態(tài)學表現(xiàn)如圖1所示，與接種前相比，接種后第9天兔睪丸開始逐漸腫脹且觸診變硬，于12～15d時兔睪丸腫脹最為明顯且均不可回縮，部分兔睪丸伴明顯水腫。隨后兔睪丸腫脹程度逐漸減小，且觸診硬度逐漸下降，至第21天兔睪丸恢復至比接種前稍大且略硬狀態(tài)。本次實驗中所有新西蘭兔均未發(fā)生睪丸潰瘍。滅活菌株接種組僅在接種后第3天出現(xiàn)輕微睪丸腫脹，無明顯變硬。

圖1 活性菌株接種組不同時間點兔睪丸形態(tài)學表現(xiàn)

二、兔血清TPPA和TRUST結(jié)果

活性菌株接種組接種前及接種后的3d組兔血清樣本TPPA及TRUST檢測結(jié)果均為陰性，7d組、14d組和21d組家兔血清的TPPA結(jié)果呈陽性，TRUST滴度呈上升趨勢，其中除外14d組中1號兔血清TPPA和TRUST結(jié)果均為陰性，表明其梅毒模型建立失敗，將其剔除實驗組。滅活菌株接種組各時間點采集的兔血清樣本檢測結(jié)果均為陰性。詳見表1。

表1 兔血清TPPA和TRUST結(jié)果

三、接種后不同時間點的兔睪丸病理表現(xiàn)

根據(jù)已有研究顯示：正常兔睪丸由緊密間隔的生精小管和間質(zhì)區(qū)組成。生精小管由排列整齊的精原細胞組成，完全成熟的精子通常見于腔內(nèi)。管間間隙或間質(zhì)區(qū)包含小靜脈、小動脈和間質(zhì)細胞，也可見少量分散的淋巴細胞[4,5]。在活性菌株接種組中：3d組的兔睪丸組織學特征為出現(xiàn)急性炎癥的顯微區(qū)，主要表現(xiàn)為少量的多形核白細胞（中性粒細胞為主）和淋巴細胞浸潤，尤其在血管周圍 （圖2 A）；7d組的兔睪丸組織切片中間質(zhì)和血管區(qū)出現(xiàn)中度炎癥改變，多形核細胞較3d組減少，淋巴細胞的比例明顯增加（圖2 B）；14d組的兔睪丸間質(zhì)和血管區(qū)出現(xiàn)明顯的單核細胞和淋巴細胞浸潤，生精小管出現(xiàn)萎縮，精子產(chǎn)生受到抑制（圖2 C）；21d組的兔睪丸組織切片中出現(xiàn)近乎滿視野的淋巴細胞浸潤，睪丸間質(zhì)出現(xiàn)纖維化，生精小管萎縮明顯，成熟精子數(shù)量顯著減少（圖2 D）。

作為對照組，滅活菌株接種組的兔睪丸病理切片組織學特征除了在3d組中出現(xiàn)了急性炎癥，表現(xiàn)為少量的多形核白細胞和淋巴細胞浸潤外，其余時間點和正常睪丸組織病理表現(xiàn)無明顯差異（圖3）。

圖2 活性菌株接種組接種后不同時間點的兔睪丸病理表現(xiàn)

圖3 滅活菌株接種組接種后不同時間點的兔睪丸病理表現(xiàn)

四、接種后不同時間點的兔睪丸鍍銀染色表現(xiàn)

如圖4所示，活性菌株接種組中3d組兔睪丸鍍銀染色顯示梅毒螺旋體位于生精小管中，7d組及14d組結(jié)果顯示梅毒螺旋體位于間質(zhì)區(qū)，而在21d組的兔睪丸鍍銀染色中未發(fā)現(xiàn)梅毒螺旋體。滅活菌株接種組的兔睪丸鍍銀染色中未發(fā)現(xiàn)梅毒螺旋體存在。

圖4 活性菌株接種組接種后不同時間點兔睪丸鍍銀染色表現(xiàn)

討 論

梅毒是一種全身性疾病，梅毒的病原體梅毒螺旋體可侵犯人體各個器官組織，如皮膚黏膜、眼、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)臟器官等。根據(jù)文獻，梅毒睪丸炎、梅毒性睪丸鞘膜積液等病例也被陸續(xù)報道出來[6,7]，近期一項研究顯示，1名梅毒病人的精液中檢測出了梅毒螺旋體[8],因而梅毒螺旋體對睪丸的影響引發(fā)關(guān)注，它是否會通過影響男性生殖系統(tǒng)和精子而導致男性的生育問題，應該引起我們足夠的重視。迄今為止，梅毒螺旋體在體外的長期培養(yǎng)依舊是梅毒研究的難點，但其在實驗動物體內(nèi)的傳代培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)相當成熟。大量研究表明新西蘭兔是梅毒研究很好的動物模型，經(jīng)睪丸接種可對梅毒螺旋體進行傳代擴增，而經(jīng)背部皮損接種可以很好的模擬一期梅毒典型的硬下疳皮損[9]。由于新西蘭兔的梅毒模型可模仿人類的梅毒感染的許多臨床癥狀，故此我們選用新西蘭兔建立梅毒模型來研究梅毒螺旋體對睪丸的病理損傷及其對精子產(chǎn)生的影響。

Lukehart等的研究顯示新西蘭兔經(jīng)睪丸接種梅毒螺旋體后，在9～11d里睪丸出現(xiàn)明顯臨床癥狀[10]，這與我們的實驗結(jié)果12～15d有所差別。因此不能依據(jù)固定的時間點作為處死家兔分離梅毒螺旋體菌株的指標，必須根據(jù)實際的睪丸腫脹程度來判定。本實驗還通過對兔血清進行TPPA及TRUST檢測來判定梅毒兔模型是否建立成功，根據(jù)文獻及經(jīng)驗，活性菌株接種兔睪丸所建立的梅毒兔模型其梅毒血清試驗約在1周內(nèi)可轉(zhuǎn)陽[11,12]，本實驗中活性菌株接種組中3d組中兔梅毒血清試驗結(jié)果暫未轉(zhuǎn)陽，其余3組其兔血清TPPA及TRUST結(jié)果均為陽性，故其梅毒兔模型建立成功。其中除外14d組中1號兔梅毒模型建立失敗，故由此將其剔除實驗組。

早在1980年就有文獻報道，經(jīng)睪丸接種梅毒兔模型在感染初期其睪丸組織學特征是單核細胞浸潤，在感染后的第6天即有淋巴細胞浸潤，第13天達到高峰，隨后逐漸出現(xiàn)巨噬細胞，病灶中浸潤的淋巴細胞以T細胞為主[13]，這與我們的實驗結(jié)果顯示的早期睪丸病理表現(xiàn)中以多形核白細胞和淋巴細胞浸潤為主有所區(qū)別。但在另一項研究中[14]，分別選取接種后的第3天、第6天、第11天和第24天的兔睪丸病理結(jié)果中其炎癥細胞浸潤特點與我們的實驗結(jié)果無明顯差異。這說明在梅毒感染的早期，即使機體對梅毒螺旋體做出快速的免疫應答，但隨著梅毒螺旋體的不斷增殖，機體的炎癥反應會不斷加重，進而致使睪丸中生精管不斷萎縮和間質(zhì)纖維化，成熟的精子明顯減少。為了了解梅毒螺旋體在兔睪丸組織內(nèi)的分布情況，我們對其進行了鍍銀染色。我們于活性菌株接種3d組的兔睪丸生精小管中發(fā)現(xiàn)了梅毒螺旋體的存在，而后在7d及14d組的兔睪丸間質(zhì)區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)了梅毒螺旋體，然而21d組兔睪丸中則未有梅毒螺旋體，這也與前面的結(jié)果相對應，在淋巴細胞和單核細胞浸潤的高峰期后，兔睪丸內(nèi)的梅毒螺旋體被清除，根據(jù)研究顯示淋巴細胞在遷移到感染部位后釋放淋巴因子吸引并激活巨噬細胞，被激活的巨噬細胞可吞噬并殺死梅毒螺旋體[13]。與我們的結(jié)果不同的是，Lukehart等[13]和Lauderdale等[15]僅在兔睪丸間質(zhì)區(qū)中發(fā)現(xiàn)了梅毒螺旋體，而生精小管中未見其分布。但在梅毒病人的精液中也存在梅毒螺旋體這一事實這也表明我們的結(jié)果是合理的。梅毒螺旋體可侵入兔睪丸間質(zhì)區(qū)和生精小管中，而它可通過黏多糖酶、透明質(zhì)酸酶等機制對機體組織造成損傷[16]，故我們推測梅毒螺旋體所造成的睪丸損傷不僅是因為其誘發(fā)宿主免疫反應的產(chǎn)生，也有可能與它本身入侵所造成的組織損傷有關(guān)。

本實驗所建立的梅毒兔模型在其病程發(fā)展中出現(xiàn)了睪丸損傷以及精子數(shù)量減少的表現(xiàn)，我們可以推測梅毒螺旋體可能會通過造成睪丸組織損傷及精子數(shù)量減少等影響其生育情況，但由于無法從梅毒患者中完成相關(guān)探究，且我們僅選取了接種后3周內(nèi)的兔睪丸進行實驗，且實驗兔數(shù)量存在一定限制，所以針對男性梅毒患者在感染梅毒螺旋體后是否會在一定的時間段內(nèi)因成熟的精子數(shù)量減少而影響到生育能力，需要我們更進一步的研究。