方瑜潔 張明麗 惠 莉

西安市第一醫(yī)院干五消化科(710002)

背景：惡性腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的囊外生長模式與患者預(yù)后密切相關(guān)。目的：探討胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移囊外生長對(duì)預(yù)后的影響，及其與轉(zhuǎn)錄因子SOX9表達(dá)的相關(guān)性。方法：回顧性連續(xù)收集2010年1月—2014年12月西安市第一醫(yī)院200例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性、TNMⅠ～Ⅲ期胃癌患者，根據(jù)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移生長模式分為囊外生長組和囊內(nèi)生長組，比較兩組臨床病理特征、總體生存期和SOX9表達(dá)情況。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)預(yù)后相關(guān)因素行單因素和多因素分析。結(jié)果：囊外生長組T分期T3、T4期比例、N分期N2、N3期比例、TNMⅡ～Ⅲ期比例以及SOX高表達(dá)率(94.5%對(duì)58.3%)均顯著高于囊內(nèi)生長組(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示囊外生長組總體生存期顯著短于囊內(nèi)生長組(P<0.05)。多因素分析表明，TNMⅡ～Ⅲ期(HR=3.224, 95% CI: 2.769～5.283, P<0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移囊外生長(HR=2.388, 95% CI: 1.802～3.209, P<0.001)和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)SOX9高表達(dá)(HR=1.321, 95% CI: 1.201～1.684, P=0.001)是影響胃癌患者總體生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)論：胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移囊外生長與SOX9高表達(dá)相關(guān)，是預(yù)測(cè)預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，以及腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的組織形態(tài)學(xué)標(biāo)志。

胃癌是全世界第四大常見惡性腫瘤，也是導(dǎo)致癌癥死亡的第二大原因[1]。盡管近來年胃癌手術(shù)根治率不斷提高，加之化療和靶向治療的進(jìn)展，使患者遠(yuǎn)期生存率得到改善，但胃癌患者總體預(yù)后仍然不佳。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)期生存率降低的主要原因之一[1-2]。近年研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶內(nèi)的腫瘤細(xì)胞有囊外生長和囊內(nèi)生長兩種生長模式，并與患者預(yù)后密切相關(guān)[3]。囊外生長是指轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)的腫瘤細(xì)胞在淋巴結(jié)囊內(nèi)增殖并突破囊壁進(jìn)入周圍軟組織；囊內(nèi)生長則是指腫瘤細(xì)胞僅在淋巴結(jié)囊內(nèi)增殖，不突破淋巴結(jié)囊。據(jù)報(bào)道，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移囊外生長與結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)[3]，但關(guān)注囊外生長與胃癌患者預(yù)后關(guān)系的研究報(bào)道尚少。此外，研究[4-5]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子SOX9表達(dá)增強(qiáng)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移囊外生長模式的相關(guān)性未見報(bào)道。本研究旨在探討胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移囊外生長對(duì)預(yù)后的影響及其與SOX9表達(dá)的相關(guān)性。

材料與方法

一、標(biāo)本來源

回顧性連續(xù)收集2010年1月—2014年12月在西安市第一醫(yī)院行胃癌根治性切除術(shù)的患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①行胃癌D2根治術(shù)；②TNM分期為Ⅰ～Ⅲ期；③病理確診胃癌，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性；④術(shù)前未接受新輔助化療，術(shù)后接受FOLFOX方案化療；⑤臨床病理資料和術(shù)后隨訪資料完整；⑥可獲得淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移石蠟組織樣本或切片。排除標(biāo)準(zhǔn)：①遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；②資料不全；③淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移樣本缺失或無法進(jìn)行免疫組化分析。結(jié)果共200例患者納入研究，其中男性129例，女性71例，年齡46～84歲，平均(65.8±9.4)歲。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，患者及其家屬簽署知情同意書。

二、方法

1. 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移生長模式分析：轉(zhuǎn)移陽性淋巴結(jié)組織蠟塊4 μm連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，對(duì)腫瘤細(xì)胞生長模式進(jìn)行評(píng)估。分別于低倍鏡(×20)和高倍鏡(×200)視野下觀察轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長與淋巴結(jié)囊壁的位置關(guān)系。腫瘤細(xì)胞突破淋巴結(jié)囊壁延伸至淋巴結(jié)外，判斷為囊外生長(圖1A)；腫瘤細(xì)胞局限于淋巴結(jié)囊壁內(nèi)，判斷為囊內(nèi)生長(圖1B)。由2名對(duì)患者臨床資料和生存情況不知情的高年資病理科醫(yī)師獨(dú)立判斷，結(jié)果不符時(shí)由病理科主任醫(yī)師作最終判斷。根據(jù)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)生長模式將患者分為囊外生長組和囊內(nèi)生長組。

2. SOX9免疫組化染色：轉(zhuǎn)移陽性淋巴結(jié)組織蠟塊4 μm連續(xù)切片，脫蠟，3% H2O2室溫孵育5 min，自來水沖洗，PBS浸泡3 min，5%山羊血清室溫封閉孵育10 min；加入1∶100鼠抗人SOX9抗體(Abcam plc.)，4 ℃孵育過夜；PBS沖洗3次，加入HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育1 h；PBS沖洗3次，DAB顯色，自來水充分沖洗、復(fù)染、封片，于高倍鏡(×200)視野下評(píng)估SOX9染色強(qiáng)度。染色強(qiáng)度分為陰性(無染色)、弱(淺棕色)、中等(棕色)和強(qiáng)陽性(深棕色)，其中陰性和弱陽性定義為SOX9低表達(dá)，中等和強(qiáng)陽性定義為SOX9高表達(dá)。由2名對(duì)患者臨床資料和生存情況不知情的高年資病理科醫(yī)師獨(dú)立判斷，結(jié)果不符時(shí)由病理科主任醫(yī)師作最終判斷。

3. 術(shù)后隨訪：患者出院后接受門診隨訪，隨訪內(nèi)容包括病史、體格檢查、CT或內(nèi)鏡檢查，術(shù)后1年內(nèi)每3個(gè)月隨訪一次，術(shù)后1年后每6個(gè)月隨訪一次。以手術(shù)日期至死亡日期為總體生存期。末次隨訪時(shí)間為2018年6月。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、囊外與囊內(nèi)生長組胃癌患者臨床病理特征和預(yù)后比較

根據(jù)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長模式分組，囊外生長組73例，囊內(nèi)生長組127例。兩組間性別、年齡、胃癌Lauren分型和組織學(xué)分級(jí)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);在T分期和N分期中，囊

A：囊外生長模式(左圖：×20，右圖：×200)；B:囊內(nèi)生長模式(左圖：×20，右圖：×200)

圖1 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移囊外生長和囊內(nèi)生長典型HE染色結(jié)果

外生長組T3、T4期比例和N2、N3期比例均高于囊內(nèi)生長組，總體TNM Ⅱ～Ⅲ期比例亦高于囊內(nèi)生長組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，囊外生長組總體生存期明顯短于囊內(nèi)生長組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖2)。

圖2 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移囊外與囊內(nèi)生長胃癌患者總體生存率

二、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移囊外生長與SOX9表達(dá)的相關(guān)性

免疫組化染色顯示，200例胃癌患者的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中，143例SOX9高表達(dá)，57例SOX9低表達(dá)(圖3)。囊外生長組SOX9高表達(dá)率明顯高于囊內(nèi)生長組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[94.5%(69/73)對(duì)58.3%(74/127), χ2=29.897,P<0.001]。

三、胃癌患者預(yù)后相關(guān)因素分析

Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型單因素和多因素分析表明，TNMⅡ～Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移囊外生長和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)SOX9高表達(dá)是影響胃癌患者總體生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表2)。

討 論

惡性腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的囊外生長是近年腫瘤學(xué)研究的重要內(nèi)容之一，研究發(fā)現(xiàn)囊外生長模式與惡性腫瘤如胃腸道腫瘤的臨床病理參數(shù)，包括TNM分期、淋巴、血管和神經(jīng)侵犯、組織學(xué)分級(jí)以及腫瘤復(fù)發(fā)、預(yù)后不良等密切相關(guān)[3,6-7]。在最新版AJCC惡性腫瘤分期手冊(cè)中，囊外生長已成為頭頸部癌淋巴結(jié)分期的一項(xiàng)重要指標(biāo)[8]。本研究結(jié)果證實(shí)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移囊外生長與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和總體生存期縮短呈顯著正相關(guān)，進(jìn)一步的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移囊外生長是胃癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示了囊外生長模式對(duì)胃癌患者遠(yuǎn)期生存情況的預(yù)測(cè)價(jià)值。此外，上述結(jié)果亦表明囊外生長可作為胃癌更具侵襲、轉(zhuǎn)移能力的組織形態(tài)學(xué)標(biāo)志。

表1 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移囊外與囊內(nèi)生長胃癌患者臨床病理特征比較n(%)

A：SOX9低表達(dá)；B：SOX9高表達(dá)

既往研究[9]認(rèn)為胃癌Lauren分型中的彌漫型與腸型相比更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且預(yù)后相對(duì)較差。然而本研究發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移囊外生長組與囊內(nèi)生長組間Lauren分型差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示囊外生長可能更多地與腫瘤細(xì)胞自身的分子特征有關(guān)，如促癌基因表達(dá)增加等。為此，本研究檢測(cè)了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶內(nèi)腫瘤細(xì)胞的SOX9表達(dá)水平。SOX9是重要的腫瘤干細(xì)胞樣標(biāo)志物，同時(shí)也是腫瘤相關(guān)信號(hào)通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖等，參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[4-5,10-11]。在乳腺癌中，SOX9可維持腫瘤干細(xì)胞的自我更新和惡性潛能，參與誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[11]。在包括胃癌在內(nèi)的胃腸道惡性腫瘤中，其高表達(dá)與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移、TNM分期以及預(yù)后不良密切相關(guān)[4-5]。本研究比較了胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移囊外生長與囊內(nèi)生長腫瘤細(xì)胞的SOX9表達(dá)，發(fā)現(xiàn)前者SOX9高表達(dá)率顯著高于后者，提示SOX9表達(dá)增強(qiáng)可能參與驅(qū)動(dòng)具有高侵襲潛能的囊外生長模式。此外，單因素和多因素分析也證實(shí)SOX9高表達(dá)是胃癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表2 胃癌患者預(yù)后相關(guān)因素單因素和多因素分析(Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型)

綜上所述，本研究結(jié)果表明胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移囊外生長與SOX9高表達(dá)相關(guān)，是預(yù)測(cè)預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，同時(shí)也是腫瘤更具侵襲、轉(zhuǎn)移能力的組織形態(tài)學(xué)標(biāo)志。由此認(rèn)為，在胃癌淋巴結(jié)標(biāo)本的病理檢查中，不僅要注意是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，對(duì)于轉(zhuǎn)移陽性淋巴結(jié)還應(yīng)重視觀察轉(zhuǎn)移灶內(nèi)腫瘤細(xì)胞的囊外或囊內(nèi)生長模式，這對(duì)于評(píng)估胃癌患者預(yù)后、制訂術(shù)后治療和隨訪方案具有重要臨床意義。