劉明智 黃光磊 張鈺祺 易徐航 袁娟麗

摘要：目的 建立水蛭膠囊薄層鑒別及次黃嘌呤含量測(cè)定方法。方法 采用薄層色譜法以水蛭對(duì)照藥材對(duì)水蛭膠囊進(jìn)行定性鑒別；以高效液相色譜法對(duì)其中的次黃嘌呤進(jìn)行含量測(cè)定：采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），以甲醇-水（5：95）為流動(dòng)相，流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為25 ℃。結(jié)果 水蛭膠囊供試品的薄層色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，可以作為水蛭膠囊的鑒別方法；高效液相色譜法中，次黃嘌呤的進(jìn)樣濃度在2.67-85.40μg·mL-1（r =1.0000）范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系；次黃嘌呤的平均回收率（n=6）分別為98.3%（RSD%=0.5）；5個(gè)批次水蛭膠囊樣品中次黃嘌呤的含量測(cè)定結(jié)果分別為100.0μg/袋，104.7μg/袋，97.6μg/袋、101.5μg/袋、103.7μg/袋。結(jié)論 本文建立的方法經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于評(píng)價(jià)水蛭膠囊質(zhì)量。

關(guān)鍵字：水蛭膠囊，薄層色譜法，高效液相色譜法，次黃嘌呤，含量測(cè)定

[ABSTRACT] Objective To establish a qualitative identification method and a HPLC method for the determination of hypoxanthine in Shuizhi Capsule.Methods TLC was employed to make qualitative identification of Hirudo in Shuizhi Capsule and HPLC was used to determine the content of hypoxanthine in Shuizhi Capsule：The analytical column was Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6×250mm，5μm），methanol-water（5：95）as mobile phase.The flow rate was 1.0ml/min and the detection wavelength was 254nm，The column temperature was 25℃.Results The spot in the chromatograms of Shuizhi Capsule were in the same location and color with those in the chromatograms of standard hirudo and the result showed that the method has good durable ability.The linear range for hypoxanthine was 2.67-85.40μg·mL-1（r =1.0000）. The average recoveries（n=6）were 98.3%（RSD%=0.5）for hypoxanthine.The contents in 5 sapmles of Shuizhi Capsule were 100.0μg/bag，104.7μg/ bag，97.6μg/ bag、101.5μg/ bag、103.7μg/ bag.Conlusion The method is accurate and reliable，and it can be applied to the quality control of Shuizhi Capsule.

[Key words] Shuizhi Capsule；TLC；HPLC；hypoxanthine；determination

水蛭最早收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，是一味具有強(qiáng)效破血逐瘀的蟲(chóng)類(lèi)藥，對(duì)血液動(dòng)力等方面有積極的改善作用[2-3]。因其療效確切，為歷版《中國(guó)藥典》所收載[4]。《中國(guó)藥典》收載的水蛭為水蛭科動(dòng)物螞蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman或柳葉螞蟥Whitmannia acranulata Whitman的干燥全體[5]。水蛭含有多種有效成分，主要含有兩類(lèi)：一類(lèi)是以水蛭素為代表的多肽及蛋白類(lèi)大分子成分；另一類(lèi)是蝶啶等小分子化學(xué)成分[6]。水蛭“夏、秋二季捕捉，用沸水燙死，曬干或低溫干燥[5]?！钡嗡卦?0℃條件下15min能將其破壞[7]，即水蛭飲片中水蛭素已被破壞。次黃嘌呤是水蛭所含的有效成分之一，是核酸的代謝產(chǎn)物，廣泛存在于動(dòng)植物中，具有平喘、舒張支氣管、降壓等藥理作用，其作為有效成分指標(biāo)測(cè)定其含量的研究廣泛[8-9]，已有報(bào)道測(cè)定水蛭飲片中次黃嘌呤的含量[10]。水蛭膠囊為醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，為單方制劑，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)由江西省食品藥品監(jiān)督管理局頒布，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為GZJ-0296-（1）-2006，其正文內(nèi)容并無(wú)鑒別方法和含量測(cè)定方法。本文對(duì)水蛭膠囊采用薄層色譜法（TLC）進(jìn)行了定性鑒別、采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)其主要成分次黃嘌呤進(jìn)行了含量測(cè)定。方法簡(jiǎn)便易行，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，建立了水蛭膠囊的質(zhì)量控制的有效方法，也為含水蛭成方制劑的質(zhì)量研究提供了重要參考。

1儀器與試藥

1.1儀器：1200高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫）；ME-204萬(wàn)分之一電子天平（梅特勒-托利多）；CP225D十萬(wàn)分之一電子天平（賽多利斯）；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6×250mm，5μm）。

1.2 試藥：水蛭中藥材對(duì)照品（中國(guó)食品藥品研究檢定院，批號(hào)：121061-201305）；次黃嘌呤（中國(guó)食品藥品研究檢定院，批號(hào)：140661-200903，含量：99.5%）；水蛭膠囊樣品（五批，萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)分別為：20150704；20150103；20160611；20170102；20170904）；薄層層析硅膠G（產(chǎn)地：東洋化工有限公司分廠，批號(hào)：0140121）；乙腈（HPLC級(jí)，購(gòu)于北京百靈威科技有限公司）；其他試劑均為分析純；水為純化水。

2方法及結(jié)果

2.1 薄層色譜法鑒別水蛭膠囊中水蛭

取水蛭對(duì)照藥材細(xì)粉lg，加乙醇5ml，超聲處理15min，濾過(guò)，取濾液作為對(duì)照品溶液。取本品內(nèi)容物粉末lg，同法制成供試品溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2015年版第四部通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各5μ1，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（4：1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10% 硫酸乙醇溶液，在105°C加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫紅色斑點(diǎn)；紫外光燈（365nm）下顯相同的橙紅色熒光斑點(diǎn)。

2.2 HPLC法測(cè)定水蛭膠囊中水蛭含量

2.2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）柱，以甲醇-水（5：95）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；流速：1.0 ml/min，柱溫：25 ℃，進(jìn)樣量10μl。理論塔板數(shù)按次黃嘌呤峰計(jì)算，不得低于3000。

2.2.2 溶液的制備（1）對(duì)照品溶液 取次黃嘌呤對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每1ml含10μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。（2）供試品溶液 取裝量差異項(xiàng)下本品內(nèi)容物，混勻，研細(xì)，取約0.8g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水25mL，稱定重量，超聲處理（功率250W，25kHz）60min，放冷，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，為供試品溶液。

2.2.3. 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

取次黃嘌呤對(duì)照品，按2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液的制備方法制備對(duì)照品溶液和供試品溶液。精密量取上述兩種10μl注人液相色譜儀，記錄色譜圖。對(duì)照品溶液和供試品溶液中，主峰對(duì)稱因子以及與其他雜峰分離度均符合規(guī)定，理論踏板數(shù)按照次黃嘌呤計(jì)為22416。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2.5 線性范圍考察

取次黃嘌呤對(duì)照品適量，精密稱定，置25ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取適量，用甲醇稀釋至濃度為2.67、5.34、10.48、21.35、42.70、85.40μg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述對(duì)照品溶液各10μl注入液相色譜儀，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，以對(duì)照品的濃度（X，μg/ml）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程Y=0.0223X+0.0718，r =0.9999，線性范圍為26.7μg～854.0μg。

2.2.6 系統(tǒng)精密度試驗(yàn)

精密吸取次黃嘌呤對(duì)照品溶液10μl，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算次黃嘌呤峰面積的RSD為0.2%（n=6），結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品（批號(hào)：20160611）共6份，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備6份供試品溶液，按照2.2.1項(xiàng)下測(cè)定次黃嘌呤的含量，計(jì)算得次黃嘌呤含量分別為98.2μg /粒、97.7μg /粒、97.5μg /粒、98.7μg /粒、98.1μg /粒、98.0μg /粒，RSD為0.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液（批號(hào)：20160611），室溫保存，按2.2.1下色譜條件，分別于0、2、4、8、12h精密吸取10μl進(jìn)樣，測(cè)定次黃嘌呤的峰面積，峰面積的RSD為0.3%（n=5），表明供試品溶液在室溫下12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收實(shí)驗(yàn)

取本品（批號(hào)：20160611）適量，精密稱定，分別加入取次黃嘌呤適量，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備同一濃度（相當(dāng)于100%濃度水平）供試品溶液共6份，精密取10μl注人液相色譜儀，記錄色譜圖；另取次黃嘌呤對(duì)照品，按2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液的制備方法制備對(duì)照品溶液，同法測(cè)定。記錄色譜圖，計(jì)算回收率?？山邮艿幕厥章蕬?yīng)在90～110%，本品含量測(cè)定的平均回收率為98.3%，RSD=0.5%，表明含量測(cè)定方法的回收率良好，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.10 樣品測(cè)定

取裝量差異項(xiàng)下本品內(nèi)容物，混勻，研細(xì)，取約0.8g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水25mL，稱定重量，超聲處理（功率250W，25kHz）60min，放冷，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液，精密取10μl注人液相色譜儀，記錄色譜圖；另取次黃嘌呤對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每1ml含10μg的溶液，作為對(duì)照品溶液，同法測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，既得。記錄色譜圖，量取峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算樣品的含量。三批樣品的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

《中國(guó)藥典》2015年版一部水蛭中藥材及其飲片的含量測(cè)定法采用的是生物測(cè)定法[5]，所需的凝血酶試劑價(jià)格昂貴且不易保存，且檢測(cè)時(shí)操作稍復(fù)雜。次黃嘌呤相對(duì)穩(wěn)定，提取方法相對(duì)簡(jiǎn)單 [11]，其廣泛存在于動(dòng)植物中。本文采用薄層色譜法對(duì)水蛭膠囊進(jìn)行定性，結(jié)合高效液相色譜法對(duì)其主要成分次黃嘌呤的含量進(jìn)行測(cè)定，可有效控制水蛭膠囊的質(zhì)量。

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