王振宇 錢(qián) 祥 張愛(ài)琴

1 浙江省杭州市丁橋醫(yī)院 浙江 杭州 310021

2 浙江省腫瘤醫(yī)院 浙江 杭州 310022

本研究通過(guò)新一代的高通量測(cè)序，對(duì)腸道菌群進(jìn)行基因測(cè)序，了解原發(fā)性肺腺癌患者與健康對(duì)照組腸道菌群結(jié)構(gòu)的差異性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集：選取浙江省腫瘤醫(yī)院胸部腫瘤外科新入院患者，充分溝通后，簽署知情同意書(shū)。要求1周內(nèi)未使用中藥制劑、抗生素、類(lèi)固醇藥物、微生態(tài)制劑及酸奶等。收集的糞便于省腫瘤醫(yī)院-80℃保存。剔除各種原因不愿手術(shù)，術(shù)后病理為炎性病變，術(shù)后病理非腺癌糞便標(biāo)本。取病理確診為肺腺癌的患者糞便10例，與患者平均年齡相近的正常人糞便10例，用做實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.2 糞便DNA提取與16S rRNA PCR擴(kuò)增及Illumina測(cè)序：按TIANamp Stool DNA kit試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度及純度，1%瓊脂糖凝膠電泳跑膠觀察DNA完整性。質(zhì)檢后選取合適DNA樣本進(jìn)行后續(xù)分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析：通過(guò)生物數(shù)據(jù)分析進(jìn)行OTU聚類(lèi)及注釋、Alpha多樣性、Beta多樣性、群落組成分析、物種豐度差異分析等。

2 結(jié)果

2.1 一般資料：入組的10例原發(fā)性肺腺癌患者均為男性，年齡42～59歲，平均年齡48.8±6.12歲；健康人群對(duì)照組10例均為男性，年齡40～60歲，平均年齡48.7±6.25歲。兩組人群年齡、性別比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.2 樣本腸道菌群OTU聚類(lèi)、注釋及維恩圖：如圖1。每個(gè)橢圓代表一個(gè)樣品(分組)，橢圓間的重疊區(qū)域表示樣品間（組間）共有的OTUs，每個(gè)區(qū)域的數(shù)字大小表示該區(qū)域?qū)?yīng)的OTUs數(shù)目?？梢钥闯鲈l(fā)性肺腺癌患者與健康人群腸道菌群OTUs總數(shù)基本一致，在種類(lèi)上有一定的重合性，同時(shí)存在顯著差異。

圖1 OTU維恩圖

2.3 腸道菌群多樣性分析：Alpha多樣性是指一個(gè)特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性。常用的多樣性度量指數(shù)有：群落豐富度指數(shù)，包括Chao指數(shù)和ACE指數(shù)，兩指數(shù)越大，說(shuō)明群落豐富度越高。群落多樣性指數(shù)，包括Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。Shannon值越大，說(shuō)明群落多樣性越高；Simpson指數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越低。組間t檢驗(yàn)P均＞0.05，說(shuō)明兩組樣本多樣性無(wú)顯著性差異。見(jiàn)表1。

表1 4個(gè)多樣性指數(shù)組間t檢驗(yàn)數(shù)據(jù)表

Beta多樣性是不同生態(tài)系統(tǒng)之間多樣性的比較，利用各樣品序列間的進(jìn)化及豐度信息來(lái)計(jì)算樣品間距離，反映樣品間是否具有顯著的微生物群落差異。運(yùn)用UniFrac分析進(jìn)行層級(jí)聚類(lèi)得到叢集樹(shù)狀圖2。PCoA是一種研究數(shù)據(jù)相似性或差異性的可視化方法，通過(guò)PCoA可以觀察個(gè)體或群體間的差異圖3。從兩圖中我們可以看出肺癌患者腸道菌群與健康人組存在顯著性差異。圖中PCoA Plot12，PCoA Plot13，PCoA Plot23分別是前三個(gè)主要成分兩兩組合，分別進(jìn)行作圖。不同形狀的點(diǎn)代表不同環(huán)境或條件下的樣本組，橫、縱坐標(biāo)軸的刻度是相對(duì)距離，無(wú)實(shí)際意義。

圖2 叢集樹(shù)狀圖

圖3 PCoA圖

2.4 兩組糞便樣本腸道菌群差異分析：基于各分類(lèi)學(xué)水平樣品序列數(shù)的統(tǒng)計(jì)信息，可以比較某一特定物種在兩個(gè)或多個(gè)（組）樣品之間豐度的差異情況。根據(jù)序列數(shù)的統(tǒng)計(jì)信息，應(yīng)用軟件mothur中的Metastats命令進(jìn)行差異分析。q值越小說(shuō)明P值越準(zhǔn)確。結(jié)果如表2。Alistipes存在差異性（P＜0.05）。

表2 兩組糞便樣本腸道菌群差異分析

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究肺腺癌患者以及正常人的腸道菌群豐度分布，通過(guò)組間對(duì)照尋找肺癌患者腸道中的關(guān)鍵菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺癌患者腸道內(nèi)存在著大量的Alistipes，提示其可能與肺癌的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。

大腸與肺在生理上密切相關(guān)，又在病理上相互影響，腸道菌群作為腸道的一個(gè)重要組成部分，與肺癌也必然存在密切關(guān)系。糞便移植和益生菌的補(bǔ)充已被證明能對(duì)多種肺部疾病起到積極的療效。近年腸道菌群也被證明可以提高宿主抗癌免疫反應(yīng)[1]以及通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境下的骨髓來(lái)源的細(xì)胞功能發(fā)揮抗腫瘤療效[2]。中醫(yī)學(xué)從表里經(jīng)入手，通過(guò)歸經(jīng)為大腸的藥物（如白花蛇舌草、苦杏仁等），對(duì)肺癌起到了積極的療效。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果是祖國(guó)醫(yī)學(xué)在“肺與大腸相表里”理論正確性上的一個(gè)表現(xiàn)。腸道菌群與肺癌被證明存在著非常密切的關(guān)系。能否通過(guò)改善Alistipes的豐度分布，從而影響肺癌發(fā)生發(fā)展，對(duì)肺癌起到積極的治療效果，成為肺癌防治的新靶點(diǎn)，從而為肺癌的防治提供了一個(gè)新的思路、新靶點(diǎn)和新的技術(shù)平臺(tái)，還有待實(shí)驗(yàn)的論證。