秦又發(fā) 周光輝 潘春予 朱永坤 楊宇峰 蒲榮

中圖分類號(hào) R965.1;R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）22-3084-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.22.12

摘 要 目的：探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)病毒性心肌炎（VMC）模型小鼠心肌組織中基質(zhì)金屬酶（MMPs）、組織金屬蛋白酶抑制因子（TIMPs）表達(dá)的影響。方法：將雄性BALb/c小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組[卡托普利，100 mg/（kg·d）]和補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中、高劑量組[6、18、36 g/（kg·d）]，每組24只。除對(duì)照組外，其余各組小鼠均單次腹腔注射柯薩奇B3病毒以復(fù)制VMC模型。造模成功后，對(duì)照組和模型組小鼠均灌胃等容生理鹽水，各給藥組小鼠均灌胃相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)30 d。觀察各組小鼠的一般情況。以病毒接種當(dāng)日為0 d，分別于4、10、20、30 d時(shí)檢測(cè)小鼠心臟質(zhì)量與體質(zhì)量比值（HW/BW）;采用蘇木精-伊紅染色法觀察小鼠心肌組織形態(tài)學(xué)特征，并進(jìn)行心肌病理組織學(xué)評(píng)分;采用苦味酸天狼猩紅染色法觀察小鼠心肌組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的分布情況，并計(jì)算Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白比值。于30 d時(shí)，采用Western blotting法檢測(cè)小鼠心肌組織中MMP-1、MMP-3、MMP-9、TIMP-1的相對(duì)表達(dá)量，并計(jì)算MMPs/TIMPs。結(jié)果：與對(duì)照組比較，模型組小鼠出現(xiàn)煩躁、拱背、對(duì)刺激反應(yīng)減輕、體質(zhì)量減輕甚至精神萎靡等癥狀;其心肌組織可見(jiàn)典型的炎癥性改變和局部間質(zhì)細(xì)胞充血，并伴有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白分布，其HW/BW（10～30 d各時(shí)間點(diǎn)）、心肌病理組織學(xué)評(píng)分（4～30 d各時(shí)間點(diǎn)）、Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白比值（4～30 d各時(shí)間點(diǎn)）以及MMP-1、MMP-9的相對(duì)表達(dá)量和MMPs/TIMPs均顯著升高，而MMP-3、TIMP-1的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組小鼠上述癥狀均有不同程度改善，其HW/BW[各給藥組10～30 d各時(shí)間點(diǎn)（補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組10 d除外）]、心肌病理組織學(xué)評(píng)分（各給藥組10～30 d各時(shí)間點(diǎn)）、Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白比值（陽(yáng)性對(duì)照組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組4～10 d各時(shí)間點(diǎn)和補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中劑量組20～30 d各時(shí)間點(diǎn)）以及MMP-1（陽(yáng)性對(duì)照組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組）、MMP-9（各給藥組）的相對(duì)表達(dá)量和MMPs/TIMPs（各給藥組）均顯著降低，而MMP-3（陽(yáng)性對(duì)照組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、高劑量組）、TIMP-1（各給藥組）的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P<0.05）。結(jié)論：補(bǔ)陽(yáng)還五湯可通過(guò)抑制心肌膠原蛋白增生，調(diào)節(jié)MMPs、TIMPs的表達(dá)，改善心肌MMPs/TIMPs的失平衡狀態(tài)等途徑來(lái)發(fā)揮對(duì)VMC模型小鼠心肌纖維化的抑制作用。

關(guān)鍵詞 補(bǔ)陽(yáng)還五湯;病毒性心肌炎;心肌纖維化;基質(zhì)金屬蛋白酶;組織金屬蛋白酶抑制因子;小鼠

Effects of Buyang Huanwu Decoction on the Expression of MMPs and TIMPs in Cardiac Tissue of Viral Myocarditis Model Mice

QIN Youfa1，ZHOU Guanghui2，PAN Chunyu1，ZHU Yongkun1，YANG Yufeng3，PU Rong4（1. Dept. of Pharmacy， Dongguan Third Peoples Hospital， Guangdong Dongguan 523326， China; 2. Dept. of Rehabilitation Medicine， Dongguan Third Peoples Hospital， Guangdong Dongguan 523326， China; 3. Dept. of Pathology， Dongguan Third Peoples Hospital， Guangdong Dongguan 523326， China; 4. Dept. of Clinical Laboratory， Dongguan Third Peoples Hospital， Guangdong Dongguan 523326， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To investigate the effects of Buyang huanwu decoction on the expression of MMPs and TIMPs in cardiac tissue of viral myocarditis （VMC） model mice. METHODS： Male BALb/c mice were randomly divided into control group， model group， positive control group [captopril， 100 mg/（kg·d）]， Buyang huanwu decoction low-dose， medium-dose and high-dose groups [6， 18， 36 g/（kg·d）]， with 24 mice in each group. Except for control group， other groups were given Coxsackie virus B3 once intraperitoneally to induce VMC model. After modeling， control group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically; administration groups were given relevant medicine intragastrically; once a day， for consecutive 30 days. The general situation of mice in each group was observed. The day of inoculation was set at 0 d， heart mass to body mass ratio （HW/BW） was measured at 4， 10， 20， 30 d after inoculation. The morphological characteristics of myocardium were observed by HE staining， and the myocardial histopathological scores of myocardium were evaluated. The distribution of type Ⅰ and Ⅲ collagen in myocardium was observed by Abcam picrosirius red staining， and the ratio of type Ⅰ to Ⅲ collagen was calculated. At 30 d， relative expressions of MMP-1， MMP-3， MMP-9 and TIMP-1 in cardiac tissue were detected by Western blotting assay， and the ratio of MMPs to TIMPs was calculated. RESULTS： Compared with control group， mice in model group suffered from irritability， arch back， alleviation of stimulation response， reduction of body mass and even mental depression. Typical inflammatory changes and local interstitial hyperemia were observed in the myocardium， accompanied by a large number of lymphocyte infiltration and distribution of type Ⅰ and Ⅲ collagen. HW/BW （at different time points of 10-30 d）， myocardial histopathological score （at different time points of 4-30 d）， ratio of type Ⅰ and Ⅲ collagen （at different time points of 4-30 d）， the expression of MMP-1 and MMP-9， ratio of MMPs to TIMPs were increased significantly， while the expression of MMP-3 and TIMP-1 were decreased significantly （P<0.05）. Compared with model group， above symptoms of mice in administration groups were improved to different extents. HW/BW [at different time points of 10-30 d in administration groups （except for 10 d in Buyang huanwu decoction low-dose group）]， myocardial histopathological score （at different time points of 10-30 d in administration groups）， ratio of type Ⅰand Ⅲ collagen （at different time points of 4-10 d in positive control group and Buyang huanwu decoction high-dose group， at different time points of 20-30 d in Buyang huanwu decoction low-dose and medium-dose groups）， the expression of MMP-1 （positive control group and Buyang huanwu decoction high-dose group） and MMP-9 （administration groups）， ratio of MMPs to TIMPs （administration groups） were decreased significantly， while the expression of MMP-3 （positive control group， Buyang huanwu decoction low-dose and high-dose groups） and TIMP-1 （administration groups） were increased significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： Buyang huanwu decoction can inhibit myocardial fibrosis of VMC model mice by inhibiting myocardial collagen hyperplasia， regulating the expression of MMPs and TIMPs， improving MMPs/TIMPs imbalance.

KEYWORDS ? Buyang huanwu decoction; Viral myocarditis; Myocardial fibrosis; MMP;TIMP; Mice

心肌纖維化是病毒性心肌炎（Viral myocarditis，VMC）最嚴(yán)重的并發(fā)癥，而基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）與組織金屬蛋白酶抑制因子（TIMPs）失衡是引起VMC心肌纖維化的重要病理基礎(chǔ)[1-2]。藥理研究證實(shí)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯具有抑制肺纖維化[3]和腎間質(zhì)纖維化[4]的作用;同時(shí)本課題組前期研究也證實(shí)，該方對(duì)VMC模型小鼠心肌纖維化具有一定的抑制作用[5]，但具體的作用機(jī)制尚并不明確。為此，本研究以腹腔接種柯薩奇B3病毒（CVB3）致VMC模型小鼠為對(duì)象，通過(guò)檢測(cè)其心?、瘛ⅱ笮湍z原的含量以及MMP-1、MMP-3、MMP-9、TIMP-1蛋白的表達(dá)情況，初步探討MMPs/TIMPs在補(bǔ)陽(yáng)還五湯抑制VMC心肌纖維化中的作用，旨在為闡明該方抗VMC心肌纖維化的機(jī)制提供依據(jù)，為尋找中藥方劑治療VMC心肌纖維化的新靶點(diǎn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Eclipse TI-SR型倒置熒光顯微鏡、DS-U3型成像系統(tǒng)（日本Nikon公司）;BX53-p型偏振光顯微鏡（日本Olympus公司）;Trans-Blot? Sd Semi-Dry Transfer Cell型垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）;Centrifuge5424型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

補(bǔ)陽(yáng)還五湯各組方藥材顆粒均購(gòu)自東莞市中醫(yī)院，包括黃芪[批號(hào)：8012463，規(guī)格：24 g，顆粒當(dāng)量（即顆粒劑與原藥材質(zhì)量的比值）：0.2 ∶ 1]、當(dāng)歸尾（批號(hào)：8056523，規(guī)格：1.5 g，顆粒當(dāng)量：0.25 ∶ 1）、赤芍（批號(hào)：7120253，規(guī)格：1.0 g，顆粒當(dāng)量：0.22 ∶ 1）、地龍（批號(hào)：7106023，規(guī)格：0.3 g，顆粒當(dāng)量：0.1 ∶ 1）、川芎（批號(hào)：8061673，規(guī)格：0.65 g，顆粒當(dāng)量：0.22 ∶ 1）、紅花（批號(hào)：8040493，規(guī)格：0.48 g，顆粒當(dāng)量：0.16 ∶ 1）、桃仁（批號(hào)：8041503，規(guī)格：0.6 g，顆粒當(dāng)量：0.2 ∶ 1）。

卡托普利片（陽(yáng)性對(duì)照，中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)：AAS7080，規(guī)格：25 mg）;乙二胺四乙酸（EDTA）抗原修復(fù)液、蘇木精染液、伊紅染液、苦味酸天狼猩紅染液、RIPA總蛋白裂解液、兔抗小鼠MMP-9單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上樣緩沖液及相關(guān)試劑（武漢谷歌生物科技有限公司，批號(hào)分別為G1203、G1031、G1018、G1002、G2002、GB12132-1、GB23303、G2013、G2018）;兔抗小鼠MMP-1、MMP-3、TIMP-1單克隆抗體[艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，批號(hào)分別為ab137332、ab52915、ab86482];兔抗小鼠β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體（內(nèi)參，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：AF0003）;二喹啉甲酸（BCA）蛋白含量測(cè)定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：PC0020）;二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液（美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：35085）;MEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：12571048）;其余試劑均為分析純，水為去離子水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)BALb/c小鼠，雄性，4周齡，體質(zhì)量（17.2±0.84）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。

1.4 病毒株

CVB3 Nancy標(biāo)準(zhǔn)株由廣州呼吸健康研究院惠贈(zèng)，在HeLa細(xì)胞上傳代并凍融3次，病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）為1×109個(gè)/mL。

2 方法

2.1 藥液的制備

補(bǔ)陽(yáng)還五湯每劑的總質(zhì)量為28.53 g（即黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁藥材顆粒各1袋，與該方處方組成一致），溶解于溫水（30～40 ℃，下同）7.9 mL中，配制成質(zhì)量濃度約為3.6 g/mL（以顆粒劑總質(zhì)量計(jì)，下同）的藥液，再用溫水分別稀釋成1.8、0.6 g/mL的藥液，備用。

2.2 分組、造模與給藥

所有小鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組[卡托普利100 mg/（kg·d），以溫水為溶劑;劑量參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-7]設(shè)置]和補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中、高劑量組[6、18、36 g/（kg·d），將“2.1”項(xiàng)下相應(yīng)質(zhì)量濃度藥液按10 mL/kg給藥;劑量參考本課題組前期研究及相關(guān)文獻(xiàn)[3，5，8]設(shè)置]，每組24只。

對(duì)照組小鼠單次腹腔接種不含病毒的MEM培養(yǎng)基0.2 mL;其余各組小鼠均單次腹腔接種TCID50為1×109個(gè)/mL的CVB3病毒液0.2 mL（以MEM培養(yǎng)基為溶劑）以復(fù)制VMC模型[6，9]。待模型復(fù)制成功（即小鼠出現(xiàn)煩躁、拱背，對(duì)刺激反應(yīng)減輕、覓食減少和體質(zhì)量減輕，甚至精神萎靡等現(xiàn)象[6，9]）后，對(duì)照組和模型組小鼠均灌胃等容生理鹽水，各給藥組小鼠均灌胃相應(yīng)藥物;給藥體積均為10 mL/（kg·d），每日1次，連續(xù)30 d。

2.3 小鼠一般情況

于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，觀察各組小鼠的一般情況，包括體態(tài)、精神、活動(dòng)、對(duì)刺激的反應(yīng)、覓食和體質(zhì)量等。

2.4 小鼠心肌標(biāo)本的采集及處理

將病毒接種當(dāng)日計(jì)為0 d，分別于4、10、20、30 d時(shí)稱定小鼠體質(zhì)量（BW）后，各時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)斷頸處死6只，摘取心臟，濾紙吸干后，稱定心臟質(zhì)量（HW），計(jì)算兩者比值（HW/BW，mg/g）。隨后沿左室長(zhǎng)軸將心臟分為3份，保存，備用。

2.5 心肌病理組織學(xué)檢查和心肌病理組織學(xué)積分評(píng)價(jià)

分別于4、10、20、30 d時(shí)采用蘇木精-伊紅（HE）染色法檢測(cè)。取“2.3”項(xiàng)下1/3心肌組織，行常規(guī)石蠟切片（厚度約為5 μm），經(jīng)HE染色后，于倒置熒光顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞的浸潤(rùn)、壞死等情況。同時(shí)，每張切片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，計(jì)算每個(gè)視野中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及壞死面積（即病變面積，其病理表現(xiàn)為：細(xì)胞間質(zhì)充血，心肌細(xì)胞出現(xiàn)水腫且部分壞死崩解，血管周圍伴大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)）與整個(gè)視野面積的比例，并按如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行心肌病理組織學(xué)積分：無(wú)病變計(jì)0分，病變面積比例<25%計(jì)1分，25%～50%計(jì)2分，50%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分[10]。

2.6 Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白檢測(cè)

分別于4、10、20、30 d時(shí)采用苦味酸天狼猩紅染色法檢測(cè)。取“2.3”項(xiàng)下另1/3心肌組織，行常規(guī)石蠟切片（厚度約為5 μm），經(jīng)0.1%苦味酸天狼猩紅染液染色后，使用偏振光顯微鏡觀察（其中，Ⅰ型膠原蛋白呈黃紅色，排列緊密且具有較強(qiáng)的雙折光性;Ⅲ型膠原蛋白呈黃綠色，而雙折光性較弱）。每張切片選擇5個(gè)高倍視野拍照，并使用Image Pro Plus Software 6.0軟件分析Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白面積占整個(gè)視野面積的比例，并計(jì)算Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白比值（即兩者面積的比值）。

2.7 相關(guān)蛋白表達(dá)情況檢測(cè)

于30 d時(shí)采用Western blotting法檢測(cè)。各組取“2.3”項(xiàng)下余下1/3心肌組織，剪碎，研磨，以RIPA總蛋白裂解液1 mL在冰浴中裂解，于4 ℃下以10 000×g離心15 min，取上清液采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取蛋白70 μg，加至上樣緩沖液中，煮沸5 min變性，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳（濃縮膠濃度：5%，電壓：90 V;分離膠濃度：10%，電壓：120 V;電流：300 mA，時(shí)間：60 min）;電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入相應(yīng)一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過(guò)夜;TBST溶液清洗8 min×3次，加入二抗（稀釋度均為1 ∶ 3 000），37 ℃孵育1 h;TBST溶液清洗15 min×4次，以DAB顯色顯色后，置于成像系統(tǒng)中成像并采用Image J 1.48軟件處理。以相應(yīng)蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度值比值表示該蛋白的相對(duì)表達(dá)量，并計(jì)算MMPs與TIMPs相對(duì)表達(dá)量的比值（即MMPs/TIMPs）。上述試驗(yàn)重復(fù)6次。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，采用Levene法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn);多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)（方差齊）或Dunnetts T3檢驗(yàn)（方差不齊）。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 動(dòng)物一般情況

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，模型組小鼠于造模當(dāng)日死亡1只，隨后補(bǔ)足。接種病毒后，對(duì)照組小鼠無(wú)明顯異常，模型組和各給藥組小鼠均出現(xiàn)煩躁、拱背、對(duì)刺激反應(yīng)減輕、覓食及體質(zhì)量減輕甚至精神萎靡等癥狀。經(jīng)藥物干預(yù)后，各給藥組小鼠上述癥狀均有所緩解。

3.2 HW/BW

4 d時(shí)，各組小鼠HW/BW組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。10、20、30 d時(shí)，與對(duì)照組比較，模型組小鼠HW/BW均顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，各給藥組（補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組10 d時(shí)除外）小鼠HW/BW均顯著降低（P<0.05），詳見(jiàn)表1。

3.3 心肌病理組織學(xué)特征及心肌病理組織學(xué)積分

對(duì)照組小鼠心肌細(xì)胞排列整齊，間質(zhì)未見(jiàn)充血及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);模型組小鼠心肌組織可見(jiàn)典型的炎癥性改變，局部細(xì)胞間質(zhì)充血，并伴大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，其心肌病理組織學(xué)積分（4～30 d各時(shí)間點(diǎn)）均顯著升高（P<0.05）;各給藥組小鼠心肌組織上述病理改變均較模型組有所減輕，其心肌病理組織學(xué)積分（10～30 d各時(shí)間點(diǎn)）均顯著降低（P<0.05），詳見(jiàn)圖1[以纖維化早期（10 d）為例]、表2。

3.4 Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白比值

對(duì)照組小鼠心肌細(xì)胞間隙可見(jiàn)少量膠原蛋白。模型組小鼠心臟細(xì)胞間隙可見(jiàn)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白，且增生粗大的Ⅰ型膠原蛋白反復(fù)重疊、排列無(wú)序、直徑不均勻，伴有較強(qiáng)的雙折射光，其Ⅰ/Ⅲ膠原蛋白比值（4～30 d各時(shí)間點(diǎn)）均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組小鼠心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白分布均有所減少，不同時(shí)間點(diǎn)Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白比值（陽(yáng)性對(duì)照組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組4～30 d各時(shí)間點(diǎn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中劑量組20～30 d各時(shí)間點(diǎn)）均顯著降低（P<0.05），詳見(jiàn)圖2[以纖維化晚期（20 d）為例;圖中，細(xì)箭頭為Ⅰ型膠原蛋白，粗箭頭為Ⅲ膠原蛋白]、表3。

3.5 MMP-1、MMP-3、MMP-9、TIMP-1蛋白的表達(dá)

與對(duì)照組比較，模型組小鼠心肌組織中MMP-1、MMP-9的相對(duì)表達(dá)量和MMPs/TIMPs均顯著升高，MMP-3、TIMP-1的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組小鼠心肌組織中MMP-1以及各給藥組MMP-9的相對(duì)表達(dá)量和MMPs/TIMPs均顯著降低，陽(yáng)性對(duì)照組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、高劑量組MMP-3以及各給藥組TIMP-1的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P<0.05），詳見(jiàn)圖3、表4。

4 討論

VMC是由嗜心性病毒感染引起的急性炎癥性心臟疾病，其致病病毒以CVB3多見(jiàn)[11]。約21%的急性VMC患者會(huì)出現(xiàn)心肌纖維化并進(jìn)展為擴(kuò)張型心肌病，導(dǎo)致心力衰竭[12]，其病理基礎(chǔ)為膠原蛋白在心肌細(xì)胞外基質(zhì)中過(guò)度沉積，主要表現(xiàn)為膠原蛋白含量升高，膠原纖維排列、構(gòu)象紊亂以及Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白比例改變[13]。Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白主要由心肌成纖維細(xì)胞分泌，為心臟中主要的膠原蛋白，分別約占80%和11%。已有研究指出，與Ⅲ型膠原蛋白比較，Ⅰ型膠原蛋白的抗拉力更強(qiáng)，而伸展性和回縮性更弱，兩者的比例決定了心臟的順應(yīng)性及僵硬程度[14]。MMPs是一組能特異性降解細(xì)胞外基質(zhì)的Ca2+、Zn2+依賴性蛋白水解酶家族，其重要成員MMP-1、MMP-3、MMP-9在正常心肌組織中的含量高于其他MMPs，主要降解心肌中含量較多的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白[6，15]。TIMPs是一組可抑制MMPs活性的多功能因子家族，兩者能以1 ∶ 1的比例形成MMP-TIMP復(fù)合體，發(fā)揮阻斷MMPs與底物結(jié)合、抑制MMPs活性的作用，其中TIMP-1能抑制除MMP-2和膜型-MMP以外的大多數(shù)MMPs的活性。有研究顯示，VMC急性期大量炎癥細(xì)胞因子可通過(guò)誘導(dǎo)MMPs、抑制TIMPs的表達(dá)來(lái)增加心肌膠原蛋白的降解，此時(shí)MMPs/TIMPs最高;VMC恢復(fù)期至慢性期，TIMPs逐漸上調(diào)，MMPs/TIMPs持續(xù)降低，心肌膠原蛋白的降解也隨之減弱或停止，但MMPs/TIMPs仍高于發(fā)病前，表明MMPs與TIMPs平衡的失調(diào)貫穿于VMC發(fā)病的整個(gè)過(guò)程[7，16-18]。

本研究采用腹腔接種CVB3病毒液復(fù)制小鼠VMC模型。結(jié)果顯示，模型組小鼠出現(xiàn)煩躁、拱背、對(duì)刺激反應(yīng)減輕、覓食減少、體質(zhì)量減輕、精神萎靡等癥狀，心肌細(xì)胞可見(jiàn)明顯炎癥性改變及大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，其HW/BW（10～30 d各時(shí)間點(diǎn)）、心肌病理組織學(xué)積分（4～30 d各時(shí)間點(diǎn)）、Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白比值（4～30 d各時(shí)間點(diǎn)）、MMP-1和MMP-9的相對(duì)表達(dá)量以及MMPs/TIMPs均顯著升高，而MMP-3和TIMP-1的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低。這提示小鼠VMC病程以炎癥性改變?yōu)橹鳎⒅饾u出現(xiàn)纖維化現(xiàn)象，模型復(fù)制成功。但上述結(jié)果與李秀清等[19]研究結(jié)果不同的是，本研究中MMP-3在VMC模型小鼠心肌組織中的表達(dá)明顯降低，推測(cè)可能與本研究檢測(cè)的是VMC恢復(fù)期（30 d）MMP-3的表達(dá)有關(guān)，但尚需進(jìn)一步研究予以證實(shí)。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯出自清代名醫(yī)王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，由生黃芪120 g、當(dāng)歸6 g、赤芍4.5 g、川芎3 g、桃仁3 g、紅花3 g、地龍3 g組成，是治療氣虛血瘀證的代表方劑。其中，黃芪為君藥，味甘、性溫，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、消腫生肌的功效;當(dāng)歸為臣藥，具有補(bǔ)血的作用，有祛瘀而不傷好血之妙;川芎為佐藥，性溫、味辛，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效;紅花、桃仁為佐藥，用量較少，但卻有活血化瘀之效;地龍為使藥，可通經(jīng)活絡(luò);諸藥合用，共奏補(bǔ)氣活血通絡(luò)之功，主要用于治療心腦血管梗死性疾病[20-22]。有臨床研究顯示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可改善慢性阻塞性肺疾病合并肺間質(zhì)纖維化患者的肺功能，延緩肺組織纖維化[23-24]?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可通過(guò)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抑制肺間質(zhì)和腎間質(zhì)膠原纖維增殖，達(dá)到拮抗組織纖維化的目的[3-4，13]。為此，本研究以卡托普利作為陽(yáng)性對(duì)照藥物（該藥具有較好的抑制VMC心肌纖維化的作用[6]），初步探討了不同劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)VMC模型小鼠相關(guān)指標(biāo)的影響。結(jié)果顯示，與模型組比較，各給藥組小鼠煩躁、拱背等一般情況以及心肌組織纖維化癥狀均有不同程度的改善，其HW/BW[各給藥組10～30 d各時(shí)間點(diǎn)（補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組除外）]、心肌病理組織學(xué)評(píng)分（各給藥組10～30 d各時(shí)間點(diǎn)）、Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白比值（陽(yáng)性對(duì)照組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組4～10 d各時(shí)間點(diǎn)以及各給藥組20～30 d各時(shí)間點(diǎn)）以及心肌組織中MMP-1（陽(yáng)性對(duì)照組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯高劑量組）、MMP-9（各給藥組）的相對(duì)表達(dá)量和MMPs/TIMPs（各給藥組）均顯著降低，而MMP-3（陽(yáng)性對(duì)照組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、高劑量組）和TIMP-1（各給藥組）的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高。這提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯可降低VMC模型小鼠的HW/BW，改善其心肌病理組織學(xué)積分，抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白增生，改善心肌組織中MMPs/TIMPs失衡狀態(tài)。但這種作用并非完全隨用量劑量的增大而增強(qiáng)，特別是對(duì)MMP-3、MMP-9、TIMP-1等蛋白表達(dá)的影響，其具體原因還需進(jìn)一步研究予以明確。

綜上所述，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可通過(guò)抑制心肌膠原蛋白增生，調(diào)節(jié)MMPs、TIMPs的表達(dá)，改善VMC模型小鼠心肌MMPs/TIMPs的失平衡狀態(tài)等途徑來(lái)發(fā)揮對(duì)VMC心肌纖維化的抑制作用。但該方在調(diào)控MMPs/TIMPs平衡的分子機(jī)制和信號(hào)通路上仍不明確，有待后續(xù)研究予以完善。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 翟淑波，劉仕成，孫景輝.病毒性心肌炎的發(fā)病機(jī)制、診斷和治療[J].實(shí)用兒科臨床雜志，2010，25（22）：1762-1764.

[ 2 ] 王娟，程志清.基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制劑與病毒性心肌炎心肌纖維化[J].中國(guó)心血管雜志，2007，12（6）：476-479.

[ 3 ] 楊晗，王飛，楊昆.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)博萊霉素所致肺纖維化大鼠肺組織ERK表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2017，32（4）：1727-1730.

[ 4 ] 張選明，楊百京，葉學(xué)鋒，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠模型膠原纖維和TGF-β1的作用[J].中藥藥理與臨床，2011，27（6）：3-6.

[ 5 ] 秦又發(fā)，周光輝，潘春予，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)病毒性心肌炎小鼠心肌纖維化的作用[J].今日藥學(xué)，2018，28（5）：298-301.

[ 6 ] 郭春艷.慢性病毒性心肌炎膠原代謝變化及苦參素與卡托普利抗心肌纖維化作用比較研究[D].濟(jì)南：山東大學(xué)，2010.

[ 7 ] 鄧巍，江瑞，王世紅，等.不同劑量卡托普利對(duì)病毒性心肌炎小鼠心肌線粒體的保護(hù)效應(yīng)[J].實(shí)用兒科臨床雜志，2007，22（13）：1004-1005.

[ 8 ] 朱永坤，黃志恩，潘春予，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血模型大鼠血清中CD40和CD40L含量的影響[J].中國(guó)藥房，2015，26（25）：3479-3482.

[ 9 ] 劉慧強(qiáng).核因子κB在病毒性心肌炎小鼠發(fā)病中的作用[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2006.

[10] 文純，謝圭，曾萍，等.曲尼司特抑制病毒性心肌炎小鼠心肌纖維化的作用[J].中國(guó)當(dāng)代兒科雜志，2016，18（5）：446-454.

[11] CAFORIO AL，PANKUWEIT S，ARBUSTINI E，et al. Current state of knowledge on aetiology，diagnosis，management，and therapy of myocarditis：a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on myocardial and pericardial diseases[J]. Eur Heart J，2013，34（33）：2636-2648.

[12] DAMBROSIO A，PATTI G，MANZOLI A，et al. The fate of acute myocarditis between spontaneous improvement and evolution to dilated cardiomyopathy：a review[J]. Heart，2001，85（5）：499-504.

[13] 吳嵐，呂欣桐，張春艷，等.百令膠囊對(duì)病毒性心肌炎小鼠心肌纖維化及TGF-β1-MAPK/ERK通路的影響[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2017，33（10）：1493-1497.

[14] 韓奇杰，羅斌，馬藝列，等.病毒性心肌炎引起心肌纖維化機(jī)制探討[J].國(guó)際內(nèi)科學(xué)雜志，2009，36（9）：512-513.

[15] IWANAGA Y，AOYAMA T，KIHARA Y，et al. Excessive activation of matrix metalloproteinases coincides with left ventricular remodeling during transition from hypertrophy to heart failure in hypertensive rats[J]. J Am Coll Cardiol，2002，39（8）：1384-1391.

[16] 楊敏，陳淳媛，蔡姿麗，等.病毒性心肌炎小鼠心肌基質(zhì)金屬蛋白酶-9的動(dòng)態(tài)變化及意義[J].中國(guó)當(dāng)代兒科雜志，2011，13（8）：669-673.

[17] CHEUNG C，LUO H，YANAGAWA B，et al. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in coxsackievirus-induced myocarditis[J]. Cardiovasc Pa- thol，2006，15（2）：63-74.

[18] 張召才，楊英珍，陳瑞珍，等.病毒性心臟病小鼠心臟膠原代謝的動(dòng)態(tài)變化[J].中國(guó)病理生理雜志，2006，22（8）：1529-1534.

[19] 李秀清，周娜丹，李岳春.卡維地洛對(duì)急性病毒性心肌炎小鼠TNF-α、MMP-3及TIMP-1表達(dá)的影響[J].中國(guó)新藥雜志，2011，20（8）：736-739.

[20] 陳寶華.補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療慢性阻塞性肺疾病合并肺間質(zhì)纖維化的臨床觀察[D].成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2013.

[21] 汪強(qiáng)，谷惠敏，朱建中，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療氣虛血瘀型冠心病心絞痛的臨床回顧性研究[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，33（6）：579-582.

[22] 董剛，賈洪剛.補(bǔ)陽(yáng)還五湯聯(lián)合重組人組織型纖溶酶原激活物靜脈溶栓治療腦梗死的研究[J].中華全科醫(yī)學(xué)，2018，16（3）：470-472.

[23] 楊昆，李勇華，王飛，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯防治特發(fā)性肺纖維化的作用及機(jī)制探討[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，40（7）：550-557.

[24] 姚玉蘭.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)比沙美特羅對(duì)慢性阻塞性肺疾病穩(wěn)定期合并肺間質(zhì)纖維化患者臨床療效研究[J].四川中醫(yī)，2017，35（8）：77-79.

（收稿日期：2019-04-08 修回日期：2019-08-19）

（編輯：張?jiān)拢?/p>