溫世榮 許杰 趙延峰 鄭姣琳 李鶴 趙秀麗 張欣

[摘要] 目的 利用Nogo受體（NgR）拮抗劑NEP1-40研究P8品系快速老化小鼠（SAMP8）鼠腦中NgR與磷酸化Tau蛋白（p-Tau）表達(dá)情況，探討NgR可能作用。 方法 6月齡抗快速老化系1（SAMR1）雄性小鼠為對(duì)照組（A組），3月齡SAMP8鼠（B組），6月齡SAMP8鼠為假治療組（C組）和治療組（N組），每組6只。C組小鼠腹腔注射0.9%生理鹽水0.2 mL、N組小鼠0.2 mL NEP1-40各14 d。治療前后分別采用Morris水迷宮試驗(yàn)監(jiān)測(cè)小鼠行為學(xué)改變，利用免疫組化染色檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)p-Tau和NgR表達(dá)的變化。 結(jié)果 B、C、N組與A組比較，水迷宮試驗(yàn)潛伏期明顯延長(zhǎng)、穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少（P < 0.05）;N組第二次與第一次水迷宮實(shí)驗(yàn)比較，潛伏期明顯縮短、跨越平臺(tái)次數(shù)明顯增多（P < 0.05）。神經(jīng)元胞漿、突起NgR陽(yáng)性棕黃色顆粒狀結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜關(guān)系密切，C組海馬NgR陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)和光密度值較A組和N組明顯增多（P < 0.05）。C組p-Tau陽(yáng)性細(xì)胞沉積較A組和N組明顯增加（P < 0.05）。 結(jié)論 SAMP8鼠隨月齡增大，學(xué)習(xí)記憶能力減退，NgR及p-Tau在海馬沉積增多明顯，與小鼠老化程度相一致。NgR拮抗劑NEP1-40可能是通過(guò)下調(diào)NgR表達(dá)、減少下游p-Tau表達(dá)量，改善小鼠學(xué)習(xí)及記憶能力。

[關(guān)鍵詞] 阿爾茨海默病;Tau蛋白;Nogo受體;NEP1-40

[中圖分類號(hào)] R749.16? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）09（b）-0022-04

The expression and relationship between NgR and p-Tau in brains of senescence accelerated mice

WEN Shirong1? ?XU Jie2? ?ZHAO Yanfeng3? ?ZHENG Jiaolin3? ?LI He1? ?ZHAO Xiuli1? ?ZHANG Xin1

1.Department of Neurology， the First Affiliated Hospital of Harbin Medical University， Heilongjiang Province， Harbin 150001， China; 2.Department of Neurology， the Second Hospital of Qinhuangdao， Hebei Province， Qinhuangdao? ?066600， China; 3.Department of Neurology， the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University， Heilongjiang Province， Harbin? ?150086， China

[Objective] To investigate the expression of NgR and p-tau in senescence accelerated mouse P8 （SAMP8） was studied by using Nogo receptor （NgR） antagonist NEP1-40， explore the possible role of NgR. Methods Six months old senescence accelerated mouse-resistence 1 （SAMR1） male mice were the control group （group A）; 3 months old SAMP8 mice （group B）. Sham treatment group （group C） and treatment group （group N） of SAMP8 mice at 6 months of age， with 6 mice in each group. Mice in group C were intraperitoneally injected with 0.2 mL 0.9% normal saline， and mice in group N were intraperitoneally injected with 0.2 mL NEP1-40 for 14 days. Morris water maze test was used to monitor behavioral changes in mice before and after treatment， and immunohistochemical staining was used to detect changes in p-Tau and NgR expression in nerve cells. Results Compared with group A， the incubation periods of water maze test in group B， C and N were significantly prolonged， and the times of crossing platform were significantly reduced （P < 0.05）. Compared with the first water maze experiment， the incubation period of group N was significantly shortened and the times of crossing platform were significantly increased （P < 0.05）. The NgR positive cell count and optical density of the hippocampus in group C were significantly increased compared with those in group A and group N （P < 0.05）. The deposition of p-Tau positive cells in group C was significantly reduced compared with that in group A and group N（P < 0.05）. Conclusion The learning and memory ability of SAMP8 mice decreased with the aging of the month， and NgR and p-Tau increased significantly in the hippocampus， which was consistent with the aging degree of the mice. NgR antagonist NEP1-40 may improve the learning and memory ability of mice by down-regulating NgR expression and reducing downstream p-Tau expression.

[Key words] Alzheimer′s disease; Tau protein; NgR; NEP1-40

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease，AD）患者海馬錐體層細(xì)胞Nogo受體（NgR）免疫活性高達(dá)50%以上，特別是CA1～CA2區(qū)有大量依賴磷酸化Tau蛋白單克隆抗體AT-8免疫陽(yáng)性細(xì)胞，綁定和識(shí)別磷酸化Tau蛋白絲氨酸199/202位點(diǎn)[1]。NgR陽(yáng)性神經(jīng)元與神經(jīng)纖維纏結(jié)樣改變及AT-8在AD患者海馬CA1區(qū)共區(qū)域化，提示NgR可能與AD神經(jīng)纖維纏結(jié)相關(guān)。但AD者CA1區(qū)約2/3NgR免疫活性神經(jīng)元AT-8陰性[2]。本研究利用快速老化小鼠模型，腹腔注射NgR抑制劑NEP1-40，檢測(cè)NgR表達(dá)情況及對(duì)Tau蛋白表達(dá)影響，以闡釋NgR在AD病理改變中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3、6月齡雄性P8品系快速老化小鼠（SAMP8），6月齡雄性抗快速老化系1（SAMR1）鼠，購(gòu)自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院（合格證書(shū)：0004580），實(shí)驗(yàn)程序由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬一院動(dòng)物使用委員會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物倫理號(hào)：2016010，置于SPF環(huán)境飼養(yǎng)和護(hù)理。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器? 小鼠Morris水迷宮儀、自動(dòng)數(shù)據(jù)采集及處理系統(tǒng)（黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)）;尼康（Nikon）50i研究型正置顯微鏡;NIS-ElementsF 3.21圖像采集軟件（Nikon Inc. Japan）;圖像分析軟件（ImagePro-Plus6，MediaCybernetics，Silver Spring，MD，USA）。

1.2.2 試劑? Rabbit Anti-Nogo receptor、兔二抗（博士德生物），p-Tau（sc-101813，SANTA CRUZ生物），NEP1-40（BOC Sciences，475221-20-6）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組? 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周分6月齡SAMR1組（A組）、3月齡SAMP8組（B組），6月齡SAMP8小鼠隨機(jī)分為假治療組（生理鹽水，C組）、治療組（NEP1-40，N組）。

1.3.2 水迷宮實(shí)驗(yàn)（Morris水迷宮）? 第1、2天訓(xùn)練（可視平臺(tái)），第3～5天定向航行（隱蔽平臺(tái)），第6天空間探索（去平臺(tái)），圖像采集分析系統(tǒng)記錄動(dòng)物游泳軌跡數(shù)據(jù)。定位航行隨機(jī)取東、西、南、北4個(gè)起始位置，找到水下平臺(tái)時(shí)間（s）即潛伏期;空間搜索撤除平臺(tái)，動(dòng)物由原象限對(duì)側(cè)入水，記錄動(dòng)物進(jìn)入目標(biāo)象限次數(shù)。

1.3.3 藥物干預(yù)及二次水迷宮實(shí)驗(yàn)? 初次水迷宮后，C組腹腔注射0.9%生理鹽水0.2 mL/只，N組12.5 μg/（kg·d）NEP1-40（0.2 mL/只），每日1次，連續(xù)2周。A組和B組不干預(yù)。按初次方法重復(fù)水迷宮實(shí)驗(yàn)并采集數(shù)據(jù)。

1.3.4 灌注取腦及切片? 二次水迷宮后，所有小鼠用生理鹽水60～100 mL、4%多聚甲醛100～150 mL左心室灌注，取腦，4%甲醛固定、常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明，石蠟包埋，3 μm連續(xù)冠狀切片。

1.3.5 免疫組織化學(xué)染色? 石蠟切片脫蠟，脫水，熱抗原修復(fù)、室溫兔血清封閉。一抗p-Tau（1∶80）、NgR（1∶20） 4°C過(guò)夜。兔二抗，室溫孵育20 min。DAB染色。蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片。每標(biāo)本取5張切片，高倍鏡（400×）海馬區(qū)不重疊5個(gè)視野觀察拍照，陽(yáng)性細(xì)胞（神經(jīng)元胞漿、突起接近細(xì)胞膜棕黃色顆粒狀結(jié)構(gòu)為陽(yáng)性）計(jì)數(shù);image pro-plus 5.0圖像采集軟件采樣、圖像分析系統(tǒng)選取陽(yáng)性細(xì)胞測(cè)定其積分光密度（IOD值）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多樣本均數(shù)比較用方差分析;組間比較采用t檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮

A、B、C三組第二次潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)與第一次比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。N組第二次潛伏期短于第一次、穿越平臺(tái)次數(shù)多于第一次;C組第二次潛伏期明顯長(zhǎng)于A、B組，穿越平臺(tái)次數(shù)少于A、B組，N組第二次潛伏期短于C組，穿越平臺(tái)次數(shù)多于C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。表1。

表1? ?各組動(dòng)物水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（x±s）

注：與本組第一次比較，*P < 0.05;與A組同期比較，△P < 0.05;與B組同期比較，◇P < 0.05;與C組同期比較，&P < 0.05

2.2 免疫組化結(jié)果

2.2.1 A組、N組與C組小鼠NgR表達(dá)情況? C組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和IOD值明顯高于A組和N組（P < 0.05）。見(jiàn)表2、圖1（封四）。

表2? ?A組、N組與C組小鼠NgR陽(yáng)性表達(dá)

注：與A組比較，#P < 0.05;與C組比較，*P < 0.05

2.2.2 A組、N組與C組小鼠p-Tau表達(dá)情況? C組較A組和B組海馬陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和IOD值明顯高（P < 0.05）。見(jiàn)表3、圖2（封四）。

表3? ?A組、N組與C組小鼠p-Tau陽(yáng)性表達(dá)

3 討論

AD是最常見(jiàn)的老年癡呆，主要病理特征是神經(jīng)細(xì)胞外β淀粉樣沉積和神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結(jié)，致神經(jīng)突觸和線粒體結(jié)構(gòu)/功能異常及神經(jīng)元丟失[3-5]。

水迷宮實(shí)驗(yàn)是通過(guò)評(píng)價(jià)空間學(xué)習(xí)和記憶能力從而進(jìn)行認(rèn)知疾病模型驗(yàn)證和治療評(píng)估[6]。SAMP8 2月齡就開(kāi)始出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶功能衰退，呈增齡性加速衰退，SAMR1無(wú)此類變化[7-8]。本研究結(jié)果顯示，SAMP8小鼠與同月齡SAMR1比較的確出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶功能障礙，注射NgR抑制劑NEP1-40后，小鼠學(xué)習(xí)及記憶能力有所改善。

NgR作為髓鞘相關(guān)蛋白共同受體，其信號(hào)通路限制神經(jīng)元可塑性，抑制損傷后軸突再生，調(diào)節(jié)β淀粉樣蛋白代謝，可能參與其病理過(guò)程[9-10]。另有研究[11]顯示，皮質(zhì)及海馬等區(qū)域NgR可維持神經(jīng)元回路穩(wěn)定性及結(jié)構(gòu)可塑性，促進(jìn)突觸聯(lián)絡(luò)和長(zhǎng)時(shí)程記憶。已有研究[12-13]顯示有目的地減少NgR表達(dá)，腦內(nèi)β淀粉樣蛋白沉積和營(yíng)養(yǎng)不良神經(jīng)炎癥細(xì)胞增多，提示NgR可能有神經(jīng)保護(hù)作用。本研究中，NgR免疫活性細(xì)胞主要分布在海馬角和海馬齒狀回，與以往研究NgR分布區(qū)一致。快速老化小鼠大腦海馬NgR陽(yáng)性神經(jīng)元總數(shù)明顯高于非老化模型，支持NgR在海馬區(qū)有促進(jìn)AD病理過(guò)程的作用。

NEP1-40與NgR氨基端40個(gè)氨基酸殘基結(jié)構(gòu)相同，和NgR下游信號(hào)分子競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，不激活NgR信號(hào)通路，一方面阻斷Rho信號(hào)傳導(dǎo)途徑，另一方面阻止Nogo-66與NgR結(jié)合后介導(dǎo)的生長(zhǎng)錐潰變作用，恢復(fù)受損中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突生長(zhǎng)和功能，促進(jìn)神經(jīng)功能再生。尚可延長(zhǎng)NgR低水平表達(dá)時(shí)程，下調(diào)NgR回升時(shí)效，進(jìn)一步發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[14-15]。本研究中，N組小鼠注射NEP1-40后，水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果明顯好于非藥物干預(yù)組，提示NEP1-40確有保護(hù)作用。免疫組化顯示N組NgR免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，提示NEP1-40通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性與NgR底物結(jié)合，使NgR活性降低或喪失、表達(dá)下調(diào)，改變NgR神經(jīng)抑制作用。

Tau促進(jìn)微管蛋白聚合形成微管并維持穩(wěn)定性，異常磷酸化不能有效結(jié)合并穩(wěn)定微管，致神經(jīng)元退化[16]。AD患者異常磷酸化Tau蛋白導(dǎo)致神經(jīng)纖維纏結(jié)和纖維網(wǎng)形成，神經(jīng)元死亡后形成細(xì)胞外纏結(jié)，其數(shù)量及定位與認(rèn)知功能下降相關(guān)，在AD認(rèn)知功能缺陷中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[17-19]。有研究顯示，NgR陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)神經(jīng)纖維纏結(jié)樣改變和大量NgR陽(yáng)性神經(jīng)元與p-Tau蛋白在海馬CA1區(qū)共表達(dá)，提示NgR可能與AD的神經(jīng)纖維纏結(jié)相關(guān)[20]。NgR側(cè)鏈含有富含亮氨酸的重復(fù)序列，調(diào)節(jié)蛋白間相互作用。NgR特異生物物理學(xué)屬性可能使NgR更容易綁定到其他蛋白質(zhì)[9]。NgR除了以一種未被確定的方式抑制神經(jīng)軸突生長(zhǎng)外，可能還有其他未被發(fā)現(xiàn)的功能。小鼠腦中發(fā)現(xiàn)NgR配體Nogo-A與α微管蛋白共免疫沉淀，可能與微管穩(wěn)定性有關(guān)。據(jù)此推測(cè)NgR可能參與Tau蛋白過(guò)度磷酸化，與神經(jīng)骨架相關(guān)聯(lián)并參與AD的神經(jīng)纖維纏結(jié)[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，快速老化小鼠海馬可見(jiàn)大量p-Tau蛋白沉積，N組較C組p-Tau蛋白陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少，與應(yīng)用NgR抑制劑后NgR表達(dá)減少一致，提示NgR可能作為一個(gè)上游蛋白直接影響異常p-Tau表達(dá)或是發(fā)揮作用。

本研究結(jié)果顯示，在AD病理改變及病情進(jìn)展方面，異常p-Tau蛋白是一個(gè)關(guān)鍵因素，NgR可能通過(guò)對(duì)該蛋白表達(dá)的影響發(fā)揮作用，可以考慮將NgR作為AD治療靶點(diǎn)進(jìn)一步深入研究。

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（收稿日期：2019-04-04? 本文編輯：封? ?華）