沈銀峰 金文銀 張霞 陳乾

[摘要] 目的 探討JAK2-STAT3信號(hào)通路在重癥急性胰腺炎（SAP）大鼠肺組織中表達(dá)與外周炎性因子的相關(guān)性。 方法 將5月齡雄性Wistar大鼠240只按隨機(jī)數(shù)字表法分為SAP組、SAP+R組、SAP+S組、SAP+R+S組和假手術(shù)組（SO組），每組48只。各組動(dòng)物于造模后3、6、12、18 h取腹主動(dòng)脈血和肺組織，測(cè)定血清白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-10（IL-10），檢測(cè)肺組織中JAK2 mRNA、STAT3 mRNA、p-JAK2蛋白、p-STAT3蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果 造模后3、6、12、18 h，五組血清IL-6和IL-10水平組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。SO組的血清IL-10水平組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。SAP組、SAP+R組、SAP+S組及SAP+R+S組的血清IL-6和IL-10水平從造模后3 h開(kāi)始逐漸升高，造模后12 h達(dá)到峰值，隨后降低，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。造模后3、6、12、18 h，五組肺組織JAK2 mRNA、STAT3 mRNA和p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)水平組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。五組的肺組織JAK2 mRNA、STAT3 mRNA和p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)水平從造模后3 h開(kāi)始逐漸升高，造模后12 h達(dá)到峰值，隨后降低，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 SAP病程中，肺JAK2/STAT3通路活化可能與全身炎性反應(yīng)密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 重癥急性胰腺炎;Janus激酶2-信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3信號(hào)通路;肺組織;炎性因子

[中圖分類號(hào)] R576? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）09（b）-0017-05

Expression of JAK2-STAT3 signaling pathway in lung tissues of rats with severe acute pancreatitis and its correlation with peripheral inflammatory factors

SHEN Yinfeng? ?JIN Wenyin? ?ZHANG Xia? ?CHEN Qian

Department of Surgery Ⅳ， Affiliated Hospital of Hubei University of Traditional Chinese Medicine? Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Hubei Province， Wuhan? ?430070， China

[Abstract] Objective To investigate expression of JAK2-STAT3 signaling pathway in lung tissues of rats with severe acute pancreatitis （SAP） and its correlation with peripheral inflammatory factors. Methods 5-month-old male Wistar rats （n = 240） were randomly divided into SAP group， SAP+R group， SAP+S group， SAP+R+S group and sham-operated group （SO group）， 48 rats in each group. Abdominal aortic blood and lung tissues were collected 3， 6， 12 and 18 hours after model establishment in each group animals. Serum interleukin-6 （IL-6） and interleukin-10 （IL-10） were measured. The expression levels of JAK2 mRNA， STAT3 mRNA， p-JAK2 Protein and p-STAT3 protein in lung tissues were detected. Results The levels of serum IL-6 and IL-10 at 3， 6， 12 and 18 hours after model establishment were significantly different among the five groups （P < 0.05）. There was significant difference in serum IL-10 level in SO group （P < 0.05）. The serum levels of IL-6 and IL-10 in SAP group， SAP+R group， SAP+S group and SAP+R+S group increased gradually at 3 hours after model establishment， peaked at 12 hours after model establishment， and then decreased， there were statistically significant differences among different time points with in the group （P < 0.05）. The expression levels of JAK2 mRNA， STAT3 mRNA， p-JAK2 protein and p-STAT3 protein in lung tissue of five groups at 3， 6， 12 and 18 hours after model establishment were significantly different （P < 0.05）. The expression levels of JAK2 mRNA， STAT3 mRNA， p-JAK2 protein and p-STAT3 protein protein in lung tissues of five groups increased gradually at 3 hours after model establishment， peaked at 12 hours after model establishment， and then decreased， there were statistically significant differences among different time points within groups （P < 0.05）. Conclusion Activation of JAK2/STAT3 pathway may be closely related to systemic inflammatory response in the course of SAP.

[Key words] Severe acute pancreatitis; JAK2-STAT3 signaling pathway; Lung tissue; Inflammatory factors

重癥急性胰腺炎（SAP）是一種臨床危重病，死亡率高[1]。急性肺損傷是SAP最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，由肺損傷導(dǎo)致的急性呼吸窘迫綜合征是SAP患者死亡的重要原因[2-3]。炎癥介質(zhì)不僅作用于胰腺局部，而且進(jìn)入循環(huán);大量炎性因子的釋放，形成鏈鎖和放大效應(yīng)，造成器官損傷[4]。近年研究顯示，眾多的信號(hào)通路參與了SAP病程的病理生理過(guò)程[5]。Janus激酶（JAK）/信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）信號(hào)傳導(dǎo)通路是目前已知最主要的基本通路，其中JAK2-STAT3通路是JAK-STAT通路中最重要的[6]。本研究通過(guò)抑制JAK2-STAT3信號(hào)通路，探討SAP狀態(tài)下肺損傷與全身炎性反應(yīng)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康5月齡Wistar大鼠體重（210～250 g）240只，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，雄性，許可證號(hào)：SCXK9（鄂）2008-0005;合格證號(hào)：NO.20080016364630。實(shí)驗(yàn)前，大鼠給予標(biāo)準(zhǔn)化飲食和自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 試劑與儀器

牛磺膽酸鈉（Sigma公司）;Ruxolitinib（JAK2抑制劑）和Stattic（STAT3抑制劑）購(gòu)自美國(guó)Selleck Chemicals;白細(xì)胞介素（IL）-6和IL-10的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D Systems（生產(chǎn)批號(hào)：M1000B和M6000B）;RT-qPCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific（生產(chǎn)批號(hào)：K1641）;cDNA合成試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad Laboratories（生產(chǎn)批號(hào)：170-8841）;引物和探針購(gòu)自中國(guó)大連Takara Bio;JAK2和STAT3一抗和二抗購(gòu)自南京KeyGen生物科技;BLO-RAD Model 550型自動(dòng)酶標(biāo)光度儀（日本）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型建立與實(shí)驗(yàn)分組? 采用逆行膽胰管注射法制備動(dòng)物模型[7]。大鼠于模型制備前12 h禁食不禁水，采用5%?；悄懰徕c（1.0 mL/kg體重，0.1 mL/min）逆行膽胰管內(nèi)注射法制備SAP模型，術(shù)后大鼠自由飲水。按隨機(jī)數(shù)字表法將SAP大鼠分為SAP組、SAP+Ruxolitinib組（SAP+R組）、SAP+Stattic組（SAP+S組）、SAP+Ruxolitinib+Stattic組（SAP+R+S組）及假手術(shù)組（SO組），每組48只。SO組大鼠逆行膽胰管內(nèi)注射生理鹽水（1.0 mL/kg體重，0.1 mL/min）。SAP組和SO組術(shù)前2 h生理鹽水灌胃（180 mg/kg）并腹腔注射（3.75 mg/kg）。SAP+R組術(shù)前2 h灌胃Ruxolitinib（180 mg/kg），同時(shí)腹腔注射生理鹽水（3.75 mg/kg）。SAP+S組術(shù)前2 h腹腔注射Stattic（3.75 mg/kg），同時(shí)灌胃生理鹽水（180 mg/kg）。SAP+R+S組術(shù)前2 h灌胃Ruxolitinib（180 mg/kg），同時(shí)腹腔注射Stattic（3.75 mg/kg）。于造模后3、6、12、18 h分批處死大鼠，取腹主動(dòng)脈血，立即以3000 r/min（離心半徑15 cm）離心10 min，取上清于-70℃冰箱，凍存?zhèn)溆?取肺組織，以PBS液沖洗干凈后，于-70℃液氮，凍存?zhèn)溆谩Ｒ詣?dòng)物的處死時(shí)間，分別標(biāo)記為造模后3、6、12、18 h亞組。

1.3.2 血清IL-6和IL-10水平測(cè)定? 采用ELISA，根據(jù)試劑盒說(shuō)明方法和步驟進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 JAK2和STAT3 mRNA表達(dá)水平測(cè)定? 肺組織研磨后采用Trizol提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用RT-qPCR定量測(cè)定JAK2和STAT3的mRNA表達(dá)水平。引物序列見(jiàn)表1。RT-qPCR反應(yīng)條件：預(yù)變性（95℃，3 min），然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的變性（95℃，15 s），退火（60℃，30 s）和延伸（72℃，30 s）。以GAPDH為內(nèi)參，以公式2-△△Ct法計(jì)算JAK2和STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 磷酸化JAK2（p-JAK2）和磷酸化STAT3（p-STAT3）蛋白表達(dá)水平測(cè)定? 肺組織勻漿，加入細(xì)胞裂解液;30 min后，將蛋白質(zhì)（10 μg）裂解物和上樣緩沖液混合并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜室溫，用含有5%脫脂奶粉的PBS封閉蛋白質(zhì)1 h，并與一抗在4℃下孵育過(guò)夜;PBS漂洗3次后，將膜與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h;PBS沖洗膜3次后，電化學(xué)發(fā)光溶液顯影，使用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)曝光成像;使用Gel-Pro Analyzer 4.0軟件測(cè)定每個(gè)條帶的OD。用GAPDH作為內(nèi)參測(cè)量p-JAK2和p-STAT3蛋白的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件包SPSS 11.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五組大鼠造模后不同時(shí)間血清IL-6和IL-10水平比較

造模后3、6、12、18 h，五組血清IL-6和IL-10水平組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。SO組的血清IL-10水平組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。SAP組、SAP+R組、SAP+S組及SAP+R+S組的血清IL-6和IL-10水平組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），造模后3 h開(kāi)始逐漸升高，造模后12 h達(dá)到峰值，隨后降低。見(jiàn)表2。

2.2 五組大鼠造模后不同時(shí)間肺組織JAK2 mRNA和p-JAK2蛋白表達(dá)水平比較

造模后3、6、12、18 h，五組肺組織JAK2 mRNA和p-JAK2蛋白表達(dá)水平組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。五組組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)肺組織JAK2 mRNA和p-JAK2蛋白表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），從造模后3 h開(kāi)始逐漸升高，造模后12 h達(dá)到峰值，隨后降低。SAP組、SAP+R組、SAP+S組及SAP+R+S組的JAK2 mRNA和p-JAK2蛋白表達(dá)水平變化一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表3、圖1。

2.3 五組大鼠造模后不同時(shí)間肺組織STAT3 mRNA和p-STAT3蛋白表達(dá)水平比較

造模后3、6、12、18 h，五組肺組織STAT3 mRNA和p-STAT3蛋白表達(dá)水平組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。五組組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)肺組織STAT3 mRNA和p-STAT3蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），從造模后3 h開(kāi)始逐漸升高，造模后12 h達(dá)到峰值，隨后降低。SAP組、SAP+S組、SAP+R組及SAP+R+S組的STAT3 mRNA和p-STAT3蛋白表達(dá)水平變化一致，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表4、圖2。

3 討論

急性肺損傷是SAP時(shí)出現(xiàn)較早、引發(fā)死亡率最高的并發(fā)癥[8]。急性肺損傷的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中主要表現(xiàn)為肺組織爆發(fā)式、連續(xù)性炎性反應(yīng)[9];大量炎癥介質(zhì)和炎性因子的產(chǎn)生、釋放，促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞以及肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，加快了肺損傷的病理過(guò)程[10]。

IL-6是炎癥急性期合成的重要介質(zhì)，作為一種重要的非特異性炎性因子，參與全身炎性反應(yīng)[11]。IL-10是一種有效的抗炎性因子，通過(guò)阻斷促炎性反應(yīng)細(xì)胞因子、炎性趨化因子和細(xì)胞表面分子的基因編碼等，發(fā)揮抗炎作用[12]。本研究顯示，SAP大鼠外周血清中IL-6和IL-10均有不同程度的升高;SAP組大鼠的IL-6和IL-10升高最為明顯，肺組織中JAK2 mRNA、STAT3 mRNA、p-JAK2蛋白和p-STAT3蛋白過(guò)度表達(dá)。

JAK2-STAT3通路與炎癥關(guān)系密切，JAK2-STAT3通路參與許多細(xì)胞因子的免疫應(yīng)答，包括TNF-α和IL-6[13]。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3參與炎性反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，IL-6是其激活的重要因子之一[14]。Ruxolitinib是一種酪氨酸激酶抑制劑，廣泛應(yīng)用于抑制JAK1/2[15]。Stattic是一種有效的活化STAT3的抑制劑，成功地應(yīng)用于STAT3活化的細(xì)胞系或動(dòng)物模型[16]。激活的JAK2-STAT3通路在急性胰腺炎中起關(guān)鍵作用[17-18]。本研究表明，JAK2抑制劑和STAT3抑制劑可明顯下調(diào)炎性細(xì)胞因子水平，抑制肺組織中JAK2 mRNA、STAT3 mRNA、p-JAK2蛋白和p-STAT3蛋白過(guò)度表達(dá);聯(lián)合應(yīng)用抑制效果最明顯。Han等[19]通過(guò)抑制IL-6和TNF-α誘導(dǎo)的JAK2/STAT3活化，證實(shí)地塞米松治療SAP能夠抑制SAP急性肺損傷大鼠模型中細(xì)胞間黏附分子-1 mRNA和蛋白的表達(dá)。徐志紅等[20]通過(guò)對(duì)SAP大鼠皮下注射垂盆草提取物，發(fā)現(xiàn)垂盆草提取物可能是通過(guò)調(diào)控JAK2/STAT3信號(hào)通路，抑制促炎細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá)，改善SAP大鼠肺損傷。

總之，SAP病程中，肺JAK2/STAT3信號(hào)通路活化可能與全身炎性反應(yīng)密切相關(guān)。

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（收稿日期：2019-02-13? 本文編輯：李亞聰）