蔣雅嫻，王志萍，李曉霞，蘇佳昇，施顯怡

(廣西中醫(yī)藥大學(xué) 廣西高校中藥制劑共性技術(shù)研發(fā)重點實驗室，廣西 南寧 530001)

0 引言

石墨烯也可稱為“單層石墨”,是二維的平面多環(huán)芳香烴原子晶體.近年來,石墨烯類材料由于其具有優(yōu)良的電化學(xué)[1-3]、熱學(xué)和機械性能[4-6]、被認(rèn)為是材料科學(xué)和物理學(xué)的新星，而其獨特的結(jié)構(gòu)、優(yōu)異的性能特點、良好的生物相容性[7]在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也引起了極大的興趣[8].

石墨烯作為一種新型制劑材料，比表面積達(dá)到2 630 m2/g，比大多數(shù)納米材料的比表面積大1個數(shù)量級以上，巨大的比表面積使石墨烯具有較高的載藥能力[9].Yang等[10]利用氫鍵作用實現(xiàn)抗腫瘤藥物多柔比星(DOX)在氧化石墨烯上的高效負(fù)載，其負(fù)載量可達(dá)235%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他傳統(tǒng)藥物載體.石墨烯具有導(dǎo)熱性能良好的優(yōu)勢，其作為載體時導(dǎo)熱系數(shù)可達(dá)600 W/mK[11].文獻(xiàn)[12,13]研究發(fā)現(xiàn),化學(xué)藥物、DNA、RNA等均能通過π-π共軛、靜電作用等非共價鍵作用,有效地固定在氧化石墨烯上,從而實現(xiàn)高效運載藥物的功能.

十一方藥酒是由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院專家結(jié)合古方及臨床經(jīng)驗所研發(fā)的院內(nèi)制劑，由紅花、續(xù)斷、自然銅(煅)等中藥組成，具有跌打止痛、消腫散瘀的功效，且臨床應(yīng)用和動物實驗表明其療效顯著、毒性小、致敏性低[14-18].

但由于藥酒在臨床應(yīng)用過程中存在難保存攜帶、穩(wěn)定性差等缺點，本研究將十一方藥酒與適宜的親水性基質(zhì)混勻后涂布在背襯材料上制成貼膏劑，制成基質(zhì)載藥量大、釋藥性能良好、皮膚刺激性小且易于使用的十一方巴布劑[19,20].

為研究十一方巴布劑及聯(lián)用石墨烯的鎮(zhèn)痛效果，本實驗通過利用醋酸及熱板致疼痛動物模型，證實石墨烯熱敷貼與十一方巴布貼聯(lián)用的鎮(zhèn)痛活性，從而為開發(fā)效果好、安全性高的相關(guān)制劑提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

1.1.1 主要儀器

電熱恒溫水浴鍋(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司，HWS-12)；電子天平(余姚市紀(jì)銘稱重校驗設(shè)備有限公司，JM-A5002)；智能熱板儀(成都泰盟軟件有限公司，RB-200).

1.1.2 主要試劑及藥品

水合氯醛(成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號：2017030302)；硫化鈉(成都市科龍化工試劑廠，批號：2016081601)；冰醋酸(成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號：2017041301).

十一方巴布劑(自制，批號：20170701)；空白十一方巴布劑(自制，批號：20170701)；石墨烯熱敷貼(烯旺新材料科技有限公司提供)；天和骨通貼膏(桂林華潤天和藥業(yè)有限公司，批號：20170223)；十一方藥酒(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，批號：20170518).

十一方巴布劑制法：取CMC-Na1.6 g加入12倍量的水，于50 ℃水浴進(jìn)行溶脹，制得A相；PVP-K30 10.0 g，加入0.2%尼泊金乙酯和20 mL十一方藥酒，于50 ℃水浴進(jìn)行溶解，制得B相；稱取15.0 g甘油和1.0 g PEG400，加入13.0 g高嶺土，攪拌均勻，制得C相.將A、B二相依次加入到C相中，高速攪拌均勻后，用涂膜機將藥膏均勻地涂布于無紡布上，然后55 ℃恒溫干燥8 h，取出，放冷，覆上保護膜，裁剪成7 cm×10 cm大小的貼片，包裝，即得.

1.1.3 實驗動物

SPF級KM小鼠200只，雌鼠150只，雄鼠50只，體重(20±2)g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)動物房.合格證號:SCXK桂(2014-0002)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(23±2)℃，濕度為 40% ～60%，明暗交替周期為 12 h.實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，自由取食飲水.

1.2 實驗方法

1.2.1 十一方巴布劑及聯(lián)用石墨烯熱敷貼對醋酸致小鼠疼痛的作用[21]

取健康KM小鼠80只，雌雄各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按體重隨機分為5組，即空白組(450 cm2·kg-1空白基質(zhì))、陽性組(450 cm2·kg-1天和骨通貼膏)、藥酒組(27 mL·kg-1十一方藥酒)、巴布劑組(450 cm2·kg-1十一方巴布劑)、聯(lián)用組(450 cm2·kg-1十一方巴布劑聯(lián)用石墨烯熱敷貼).給藥前24 h，各組小鼠腹部處用剃毛器進(jìn)行約3 cm × 3 cm的脫毛處理，脫毛后飼養(yǎng)24 h，并檢查脫毛區(qū)皮膚是否有損傷.24 h后使用5%水合氯醛(0.08 mL/10 g)進(jìn)行麻醉，后按劑量在小鼠脫毛區(qū)皮膚給藥6 h，連續(xù)給藥7 d.末次給藥后1 h，小鼠腹腔注射0.8%冰醋酸溶液(0.1 mL/10 g)，觀察計數(shù)注射后小鼠出現(xiàn)第一次扭體反應(yīng)的潛伏期(s)及15 min內(nèi)出現(xiàn)扭體反應(yīng)的次數(shù).可按公式(1)計算各組給藥小鼠扭體反應(yīng)潛伏期延長百分率(%).

(1)

1.2.2 十一方巴布劑及聯(lián)用石墨烯熱敷貼對熱板致小鼠疼痛的影響[22]

小鼠分組及給藥方法同1.2.1，預(yù)熱熱板儀致至55 ℃，以小鼠放入熱板中至出現(xiàn)舔后足的時間為該小鼠的疼痛閾值，取兩次測定的平均值作為小鼠給藥前的疼痛閾值(s)，若小鼠疼痛閾值超過30 s(痛覺不敏感)或小于3 s(痛覺過于敏感)則剔除.各組合格小鼠給藥前用5%水合氯醛(0.08 mL/10 g)進(jìn)行麻醉，后按劑量在小鼠脫毛區(qū)皮膚給藥，每天給藥6 h，連續(xù)給藥7 d.末次給藥后30 min、60 min分別測定各組小鼠的痛閾值.可按公式(2)計算各組小鼠給藥后在不同時間點的痛閾值提高百分率(%).

(2)

1.2.3 給藥劑量

空白組給予450 cm2·kg-1的空白基質(zhì)；陽性組給予450 cm2·kg-1的天和骨通貼膏；藥酒組給予與巴布劑等效劑量的藥酒(27 mL·kg-1)；巴布劑組給予450 cm2·kg-1的十一方巴布劑；聯(lián)用組給予450 cm2·kg-1的十一方巴布劑并聯(lián)用石墨烯熱敷貼，熱敷時間為2 h.

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 十一方巴布劑及聯(lián)用石墨烯熱敷貼對醋酸致小鼠疼痛影響的實驗結(jié)果

聯(lián)用組、巴布劑組小鼠15 min內(nèi)扭體反應(yīng)潛伏期均比空白組顯著延長，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(**P<0.01，*P<0.05)，扭體次數(shù)也均比空白組顯著減少(**P<0.01，*P<0.05).聯(lián)用組與巴布劑組比較，小鼠15 min內(nèi)扭體反應(yīng)潛伏期無顯著性延長，扭體次數(shù)也無顯著性減少(*P>0.05)，但是聯(lián)用組小鼠15 min內(nèi)扭體反應(yīng)潛伏期延長百分率較巴布劑組延長.結(jié)果說明十一方巴布劑及其聯(lián)用石墨烯熱敷貼均能緩解醋酸所致小鼠的疼痛，石墨烯熱敷貼具有提高十一方巴布劑緩解醋酸所致小鼠疼痛作用的趨勢.其實驗結(jié)果如表1及表2所示.

表1 十一方巴布劑及聯(lián)用石墨烯熱敷貼對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)潛伏期的影響(x±s,n=10)

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01

表2 十一方巴布劑及聯(lián)用石墨烯熱敷貼對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)的影響(x±s,n=10)

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 十一方巴布劑及聯(lián)用石墨烯熱敷貼對熱板致小鼠疼痛影響的實驗結(jié)果

聯(lián)用組與巴布劑組小鼠在給藥后30 min其痛閾值比空白組顯著提高(*P<0.05)，60 min時兩組痛閾值顯著性提升(**P<0.01，*P<0.05).聯(lián)用組與巴布劑組比較，小鼠給藥后30 min和60 min的痛閾值均無顯著提高(*P>0.05)，但聯(lián)用組小鼠給藥前后不同時間點的痛閾提高百分率較巴布劑組增長.結(jié)果說明十一方巴布劑及聯(lián)用石墨烯熱敷貼均能緩解熱板所致小鼠的疼痛.其實驗結(jié)果如表3及表4所示.

表3 十一方巴布劑及聯(lián)用石墨烯熱敷貼對熱板致小鼠痛閾值的影響(x±s，n=10)

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01

表4 十一方巴布劑及聯(lián)用石墨烯熱敷貼對熱板致小鼠痛閾值提高百分率的影響(x±s，n=10)

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01

由上述實驗結(jié)果可知，十一方巴布劑及聯(lián)用石墨烯熱敷貼均能緩解熱板所致小鼠的疼痛.但聯(lián)用組與巴布劑組比較，小鼠給藥后30 min和60 min的痛閾值均無顯著提高(P>0.05)，其原因可能有：一為石墨烯熱敷貼材質(zhì)偏硬，在給藥時由于實驗動物的活動不能與巴布劑完全貼合，從而導(dǎo)致傳熱不均勻，二為石墨烯熱敷貼使用時間不充分，未能提升十一方藥酒巴布劑的經(jīng)皮吸收，但是聯(lián)用組小鼠給藥前后不同時間點的痛閾提高百分率較巴布劑組大些，說明石墨烯熱敷貼具有提高十一方巴布劑緩解熱板所致小鼠疼痛作用的趨勢.

3 結(jié)論

本研究以石墨烯類材料與傳統(tǒng)的巴布劑結(jié)合——石墨烯熱敷貼作為研究對象,開展了以石墨烯熱敷貼聯(lián)合十一方巴布劑對鎮(zhèn)痛作用的藥效研究.研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)用組、巴布劑組小鼠15 min內(nèi)扭體反應(yīng)潛伏期均顯著延長，扭體次數(shù)均顯著減少給藥后30 min的痛閾值均顯著提高，給藥后60 min的痛閾值提高有所變化.

實驗表明,石墨烯熱敷貼具有提升十一方巴布劑鎮(zhèn)痛活性的趨勢，石墨烯熱敷貼盡管對十一方巴布劑的鎮(zhèn)痛效果提升不顯著，但其溫?zé)崂懑熥饔每梢栽黾踊颊吣[痛部位的舒適感，提高患者對十一方巴布劑的順應(yīng)性.石墨烯良好的生物兼容性以及二維平面結(jié)構(gòu)與藥物的微妙作用仍需進(jìn)一步開發(fā)[21]，方使其更好地應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，這其中具體的作用機制仍需實驗進(jìn)一步去驗證和探究.