楊文娟，張嘉園，馬養(yǎng)民，龔 頻，王 蘭，陳 瑤

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院 教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710021)

0 引言

性腺功能減退癥臨床表現(xiàn)為性欲減退、勃起功能障礙 (erectile dysfunction，ED)等，且患者病情隨著年齡的增長(zhǎng)而加重[1,2].由于該病發(fā)病率高，患者大多諱疾忌醫(yī)，加之傳統(tǒng)觀念束縛，易造成病情延誤，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，增加心理負(fù)擔(dān).目前涉及STZ對(duì)糖尿病小鼠的性腺功能影響的研究較少，因此，探究STZ對(duì)小鼠性腺功能的影響進(jìn)而開展性腺功能減退癥臨床前研究的工作尤為必要[3].

Abidu Figueiredo M等[4]采用四氧嘧啶對(duì)新西蘭白兔進(jìn)行耳緣靜脈注射從而誘導(dǎo)ED動(dòng)物模型，但缺點(diǎn)是四氧嘧啶對(duì)機(jī)體組織毒性較高，且用量差異較大[5].Mulhall J P等[6]通過手術(shù)或藥物去勢(shì)的方法，對(duì)大鼠輸精管和相關(guān)血管進(jìn)行結(jié)扎和切除，建立雄激素分泌減少或作用障礙的ED模型，但手術(shù)難度較高.Huang Y C等[7]采用高脂飼料對(duì)大鼠飲食進(jìn)行干預(yù)，5個(gè)月后血脂升高，且表現(xiàn)出明顯的性腺功能損傷，但造模時(shí)間周期較長(zhǎng).

造成性腺功能減退癥的危險(xiǎn)因素包括糖尿病、高血壓、肥胖、抑郁及其他因素[8,9]，其中糖尿病患者性腺器官損傷及功能減退尤為嚴(yán)峻[10].流行病學(xué)表明，全世界35%～70%的糖尿病男性患者受到性欲減退、勃起功能障礙的影響，其發(fā)病率是非糖尿病男性的3倍，年齡超過45歲，病程超過10年，表現(xiàn)的更為顯著[11].糖尿病患者勃起功能障礙患病率為52.5%,其中37.5%的男性患者由Ⅰ型糖尿病引起 ，66.3%的男性患者由Ⅱ型糖尿病引起[12].

目前糖尿病造模方法包括鏈脲佐菌素或四氧嘧啶注射，以及聯(lián)合高脂高糖飲食干預(yù)等方法，鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)是最經(jīng)典的糖尿病建模方法[13]，通過進(jìn)一步減少或終止動(dòng)物胰島素分泌，導(dǎo)致血糖升高，體內(nèi)代謝發(fā)生紊亂，但大劑量注射易造成動(dòng)物死亡率上升.在糖尿病動(dòng)物勃起功能障礙篩選過程中，阿撲嗎啡需要較長(zhǎng)的觀測(cè)時(shí)間，且只能以大鼠陰莖勃起情況進(jìn)行定性研究[14]；而對(duì)陰莖海綿體內(nèi)壓進(jìn)行測(cè)定可對(duì)勃起功能進(jìn)行定量評(píng)價(jià)，具有一定穩(wěn)定性[15]，但預(yù)先要對(duì)動(dòng)物進(jìn)行麻醉處理，易造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡，進(jìn)而影響后續(xù)研究.小鼠是最常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，其陰莖內(nèi)部生理結(jié)構(gòu)及勃起時(shí)海綿體內(nèi)生理變化都與人類具有較高的相似度，且體型小、易捕捉、性成熟較快[16].因此，本研究旨在以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用小劑量多次腹腔注射STZ，通過STZ誘導(dǎo)小鼠血糖升高進(jìn)而影響性腺功能的研究.以期為糖尿病并發(fā)性腺功能減退的發(fā)病機(jī)理、治療靶點(diǎn)及藥物研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明雄性小鼠70只，雌性小鼠70只，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(陜)2017-003，體質(zhì)量25±2 g.室溫18 ℃～22 ℃，空氣流通，定期更換墊料，雌雄分籠，自由攝食飲水，保持晝夜節(jié)律周期.

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑

鏈脲佐菌素(美國Sigma公司，溶解于0.1 mol/L(pH4.4)檸檬酸鹽緩沖液，臨用前配制)；雌二醇注射液(四川金科藥業(yè)有限責(zé)任公司)；ACCU-CHEK活力型血糖試紙(羅氏診斷試劑公司)；睪酮測(cè)定試劑盒(南京翼飛雪生物科技有限公司)，其余試劑均為分析純.

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

全活力血糖儀(德國羅氏公司)；Varioskan Flash全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀(芬蘭THERMO)；BSASS2S電子天平(德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；PHS-3C精密PH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；WH3微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；DM2500/DFC正置式顯微鏡(德國Leica)；HA/KD-202A電腦快速冷凍石蠟兩用切片機(jī)(北京恒奧德儀有限公司).

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 STZ腹腔注射

昆明雄性小鼠70只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，通過與性成熟雌性小鼠進(jìn)行交配，交配實(shí)驗(yàn)證明小鼠具有正常性功能.隨機(jī)分為對(duì)照組(Control，10只)和模型組(Model，60只)，模型組小鼠禁食12 h后，腹腔注射1%STZ溶液，劑量為75 mg/kg，連續(xù)注射2 d，1次/d，72 h后測(cè)小鼠空腹血糖值，再分別于7 d、14 d、21 d、28 d測(cè)定小鼠空腹血糖值.

1.4.2 交配實(shí)驗(yàn)

分別于7 d、14 d、21 d、28 d對(duì)小鼠進(jìn)行交配實(shí)驗(yàn).交配前2 d，雌性小鼠每日皮下注射雌二醇注射液(1 mg/kg)刺激雌鼠發(fā)情.交配于19:00～23:00進(jìn)行，觀察時(shí)保持室內(nèi)安靜，減少燈光照明，調(diào)至昏暗，足以觀察交配行為即可，并采集交配行為錄像.具體操作為：取雄性小鼠1只置于30 cm× 50 cm× 20 cm的觀察盒內(nèi)，適應(yīng)5 min后，放入發(fā)情雌性小鼠1只，記錄20 min內(nèi)騎跨次數(shù)(mount frequency，MF)：觀察時(shí)間內(nèi)爬高總次數(shù)，有無插入均計(jì)數(shù);交配次數(shù)(intromission frequency，IF)：雄鼠射精前插入的總次數(shù).統(tǒng)計(jì)小鼠交配行為的相關(guān)數(shù)據(jù)[17].

1.4.3 血清指標(biāo)測(cè)定

造模28 d天后，小鼠脫頸椎處死，眼球取血，3 000 r/min離心10 min，分離血清.采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒測(cè)定血清睪酮水平.在450 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算小鼠血清睪酮濃度.

1.4.4 睪丸組織形態(tài)觀察

打開小鼠腹腔，迅速取出睪丸，切成1 cm3組織塊，放入10%甲醛溶液中固定24 h，流水沖洗24 h，依次經(jīng)過乙醇脫水，二甲苯透明，液體石蠟包埋，切片、脫蠟、復(fù)水，蘇木精染色，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，曙紅染色，中性樹膠封片，于鏡下觀察睪丸組織形態(tài).

1.4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用以計(jì)算模型組、對(duì)照組均數(shù)并進(jìn)行單因素分析.比較獨(dú)立組分選用t-test，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠空腹血糖測(cè)定結(jié)果

72 h血糖測(cè)定結(jié)果為：模型組60只小鼠中血糖值高于11.1 mmol/L的小鼠為53只，糖尿病成模率為88.33%.再分別于7 d、14 d、21 d、28 d檢測(cè)小鼠空腹血糖的變化.由圖1可知，對(duì)照組小鼠血糖值均處于正常范圍內(nèi).與對(duì)照組相比，模型組小鼠的血糖值顯著增高(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明STZ造成小鼠胰腺損傷，血糖持續(xù)升高.

圖1 小鼠血糖變化趨勢(shì)圖

2.2 小鼠交配實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別于7 d、14 d、21 d、28 d，對(duì)對(duì)照組和模型組小鼠進(jìn)行交配實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2、圖3所示.與對(duì)照組比較，STZ損傷后14 d，模型組小鼠跨騎次數(shù)(MF)、交配次數(shù)(IF)明顯減少，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).且該損傷不能自愈，21 d、28 d仍然表現(xiàn)出持續(xù)性的性腺功能減退，結(jié)果表明STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠出現(xiàn)典型的性腺功能減退.

圖2 小鼠交配次數(shù)變化

圖3 小鼠跨騎次數(shù)變化

2.3 血清睪酮水平測(cè)定結(jié)果

對(duì)照組、模型組小鼠的血清睪酮測(cè)定結(jié)果如圖4所示.由結(jié)果可知，模型組血清睪酮水平明顯降低，與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.05).表明STZ誘導(dǎo)的糖尿病可以引起小鼠血清睪酮水平降低，進(jìn)而使性腺功能減退，與交配實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符.

圖4 小鼠血清睪酮水平測(cè)定結(jié)果

2.4 睪丸組織病理形態(tài)改變

小鼠睪丸組織切片H.E染色觀察，結(jié)果如圖5所示.對(duì)照組睪丸的曲精小管中細(xì)胞排列較緊密，精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞緊貼基膜內(nèi)緣，精子細(xì)胞可見，形態(tài)規(guī)則；模型組睪丸組織生精細(xì)胞與基底膜脫離，生精上皮細(xì)胞排列紊亂，精子細(xì)胞數(shù)量減少.

a:精原細(xì)胞;b:初期精母細(xì)胞;c:精子細(xì)胞(a)Control組

d:生精細(xì)胞與基底膜脫離;e:生精上皮細(xì)胞排列紊亂;f:精子細(xì)胞數(shù)量減少(b)Model組圖5 小鼠睪丸組織形態(tài)圖(10×4)

性腺功能減退癥是糖尿病的常見并發(fā)癥之一，其主要表現(xiàn)為勃起功能障礙.有研究表明，糖尿病勃起功能障礙的發(fā)病機(jī)制主要包括糖尿病性血管神經(jīng)病變、內(nèi)分泌改變及社會(huì)心理等各方面因素，雖然在病理生理學(xué)研究領(lǐng)域已取得一定的研究進(jìn)展，但由于其發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，影響因素眾多，至今無法完全闡明[18].臨床上相應(yīng)的治療手段還處于不完善階段，治療效果仍然不盡人意，有必要對(duì)其發(fā)病機(jī)理，影響因素進(jìn)行更加深入的研究.因此通過研究STZ對(duì)糖尿病小鼠性腺功能的影響，構(gòu)建有效、穩(wěn)定的ED動(dòng)物模型就顯得尤為重要，本研究旨在探索STZ對(duì)糖尿病性腺功能減退小鼠的誘導(dǎo)作用，總結(jié)STZ作為誘導(dǎo)劑的適宜劑量，具有安全穩(wěn)定的特點(diǎn).

鏈脲佐菌素(STZ)是一種氨基葡萄糖-亞硝基脲，是一種強(qiáng)烷基化藥劑.可誘導(dǎo)DNA雙鍵斷裂，抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，影響葡萄糖激酶功能，通過質(zhì)膜中的 GLUT2 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT2 glucose trasport protein)有選擇性地進(jìn)入胰島β細(xì)胞中，產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性，損傷胰島β細(xì)胞[19]，導(dǎo)致胰島素分泌減少，血糖升高，進(jìn)而引發(fā)機(jī)體代謝紊亂而改變性腺內(nèi)環(huán)境，干擾性腺代謝，使其機(jī)能發(fā)生變化.本研究通過對(duì)模型組小鼠進(jìn)行STZ小劑量多次腹腔注射，誘導(dǎo)建立糖尿病性腺功能減退動(dòng)物模型，并通過交配實(shí)驗(yàn)、血清睪酮水平、組織形態(tài)觀察等對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，其中模型組跨騎次數(shù)、交配次數(shù)明顯減少(P<0.01)；血清睪酮水平顯著降低(P<0.05)；對(duì)睪丸進(jìn)行組織形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組精子細(xì)胞數(shù)量減少、生精上皮細(xì)胞排序紊亂.研究表明，STZ注射產(chǎn)生的毒性與小鼠年齡具有一定相關(guān)性.在造模過程中為了降低死亡率，應(yīng)篩選12周或更小的小鼠進(jìn)行STZ注射，如使用老年小鼠則需要相應(yīng)減少STZ的劑量，以保證小鼠存活率[20].

3 結(jié)論

采用小劑量多次腹腔注射STZ可導(dǎo)致糖尿病小鼠的性腺功能減退癥和勃起功能障礙.在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中無小鼠死亡，且具有所選物易得，操作方便的特點(diǎn).該方法實(shí)驗(yàn)時(shí)間短，無手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，成功率較高，具有性腺功能低下等病理表現(xiàn)，病理學(xué)檢查符合性腺功能減退癥的病理變化，為開展男性性功能相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).