花 莉，楊春燕，吳 川，李軍軍

(1.陜西科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.河南省欒川縣自然資源局，河南 欒川 471500)

0 引言

銻(Sb)位于元素周期表第五周期第ⅤA族，Sb在自然條件下以較低的濃度廣泛分布于水體以及土壤.近幾年銻的工業(yè)用量不斷上升，導(dǎo)致了銻向人類生活環(huán)境不斷擴散[1].銻及其化合物在1979年就已經(jīng)被國際環(huán)境保護組織列為重要污染物，并被美國環(huán)境保護局列為優(yōu)先控制污染物[2].根據(jù)世界健康組織的規(guī)定，飲用水中的銻濃度不得超過5μg/L[3].我國《重金屬污染綜合防治“十二五”規(guī)劃》中把銻列為主要控制污染物之一，根據(jù)我國《錫、銻、汞工業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB30770-2014)規(guī)定，銻在工業(yè)排污過程中不得超過1.0 mg/L[4].

銻在自然界中的存在形式以輝銻礦(Sb2S3)為主，常見價態(tài)為Sb(Ⅲ)和Sb(Ⅴ)，Sb(Ⅲ)毒性害高于Sb(Ⅴ).有研究報道，Sb(Ⅲ)毒性是Sb(Ⅴ)毒性的十倍[5].Paul Westerhoff等[6]和Maher[7]研究發(fā)現(xiàn)，水體中的銻同時具有急性與慢性毒理效應(yīng)，短時間接觸會造成人體惡心，嘔吐等癥狀，長期接觸可能會引起人體的角膜炎、結(jié)膜炎和胃炎等病癥.我國銻礦儲量位居世界第一，銻產(chǎn)量約占世界總量的79.6%[8].在中國湖南冷水江，因為銻礦分布較多，被稱為世界銻都，此外，在貴州和廣西等省份也有比較集中的銻礦分布[9].近年來由于人類對銻礦的開采，冶煉以及運輸也對當(dāng)?shù)卦斐闪虽R污染[10]，嚴(yán)重影響了當(dāng)?shù)氐耐寥拉h(huán)境.

目前，Sb污染土壤的修復(fù)方法包括生物氧化、植物修復(fù)、生物修復(fù)和吸附等.研究發(fā)現(xiàn)，自然界中存在部分植物，原生生物，藻類以及微生物可以通過自身作用氧化Sb(Ⅲ)，污染地區(qū)的Sb(Ⅲ)可以通過銻氧化細菌轉(zhuǎn)化為毒性較小的Sb(Ⅴ)，從而達到對銻的解毒，減輕銻對周圍動植物的毒害作用，改善周圍動植物的生存條件[11].Lialikova[12]首次報道了一株銻氧化細菌，該菌株能夠把 Sb(Ⅲ)氧化成 Sb(Ⅴ)，并為自身提供能量.微生物的氧化作用被認(rèn)為是一種銻污染環(huán)境潛在的修復(fù)方法.這些微生物在整個銻的地球循環(huán)過程中發(fā)揮著重要作用.近年來，對Sb(Ⅲ)氧化菌的發(fā)現(xiàn)已有報道，Li等[13]從錫礦山分離得到了 6 株具有Sb(Ⅲ)氧化能力的菌，這些菌株表現(xiàn)出不同的Sb(Ⅲ)氧化能力.Hamamura等[14]從日本銻礦區(qū)分離到了 3 株具有Sb(Ⅲ)氧化能力的菌株，經(jīng)過鑒定屬于α-和γ-變形菌門.然而，由于對于銻氧化微生物的研究開展得相對較晚，目前報道的銻氧化微生物的種類相對較少.微生物對于銻的代謝機制具有一定的多樣性.截止目前，完整的銻氧化酶系統(tǒng)還沒有被鑒定得到.為了盡快開展對銻氧化酶的深入探索，急需從不同銻污染樣品中分離純化得到多株高效銻氧化菌，以全面揭示銻氧化微生物的氧化機制，從而利用微生物修復(fù)銻污染土壤.

基于此，本研究采用湖南銻礦區(qū)的銻污染土壤，為分離更多種不同的銻氧化菌，并探究這些銻氧化菌氧化效率和最佳生長條件，為完善銻氧化酶系統(tǒng)以及利用微生物修復(fù)銻污染土壤技術(shù)的推廣應(yīng)用提供更多的理論依據(jù).

1 實驗部分

1.1 銻污染土壤的收集與處理

銻污染土壤取自于湖南冷水江銻礦區(qū)(27 °43′08.60″N，111 °27′08.66″E)，采用無菌袋密封運輸，在實驗室內(nèi)風(fēng)干并剔除植物殘體以及其他雜物，研磨并過2 mm篩使用.土壤的pH/Eh采用1∶10土水比，pH計(Sartorius pH 10，中國)測定；電導(dǎo)率(EC)采用1∶5土水比，電導(dǎo)儀(YP220，中國)測[15].土壤的陽離子交換量(CEC)的測定方法參考(NIAST，2000)[16]，有效磷(P)含量的測定采用國標(biāo)法NY/T 1121.7-2014.土壤Sb、As、Pb、Zn、Cu總含量采用濃硝酸-氫氟酸電熱板消解法，將Guo等[17]的測定方法改進，具體方法：稱取0.25 g土樣于加消解管中，加入10 mL濃硝酸，4 mL氫氟酸泡酸過夜，于電熱消解儀(DigiBlock ED54，LabTech)中120 ℃下消解1 h，150 ℃消解2 h(該過程中間斷搖勻消解管)，175 ℃趕酸至1 mL，冷卻后用1%的硝酸沖洗，轉(zhuǎn)移并定容，用0.45μm的濾膜過濾后，采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES，ICAP6000 Radial，Thermo，英國)測定土壤中重金屬總含量.

土壤的理化性質(zhì)如表1所示.供試土壤中銻含量高達220.97 mg·kg-1，已達到重度污染級別.

表1 銻污染土壤基本理化性質(zhì)

1.2 耐銻細菌的分離及其氧化性的鑒定

用于細菌分離的培養(yǎng)基CDM[18](MgSO4·7H2O，2.0 g；NH4Cl，1.0 g；Na2SO4，1.0 g；K2HPO4，0.013 g；CaCl2·2H2O，0.067 g；Na-lactate，5.0 g；瓊脂，15.0 g；蒸餾水1 000 mL；pH7.2)，其中酒石酸銻鉀([C8H4K2O12Sb2·3(H2O)])最終濃度為100μmol·L-1，培養(yǎng)基經(jīng)過1×105Pa 滅菌20 min后，用于分離耐銻細菌.

具體分離方法:取1 g孵化的土壤到9 mL 0.85%的NaCl 溶液中，30 ℃，180 r·min-1，震蕩30 min，采用連續(xù)稀釋的方法在CDM-A固體培養(yǎng)基涂布培養(yǎng)1周，挑取單菌落劃線純化培養(yǎng)1周，分離出耐銻的純菌株.對于耐銻菌株的銻氧化性鑒定，挑取純化后的單菌株在無菌條件下接種到裝有10 mL已滅菌的CDM-A液體培養(yǎng)基的試管中，在30 ℃，180 r·min-1條件下連續(xù)震蕩培養(yǎng)10 d，10 d后取9 mL菌液用0.22μm水系濾膜過濾細菌后，加入1mL 1% APDC溶液(吡咯烷二硫代氨基甲銨)，搖勻，震蕩10 min后，濾過C-18固相萃取小柱.由于APDC與Sb(Ⅲ)生成絡(luò)合物，無法通過萃取小柱，被氧化的Sb(Ⅴ)無法與APDC絡(luò)合，可以通過萃取小柱.以不加菌的培養(yǎng)基作為空白對照，因此用ICP-OES測定濾液中Sb的含量，該含量與空白的差值即為被氧化的Sb(Ⅲ)含量，即生成的Sb(Ⅴ)的量[1].

1.3 銻氧化菌的系統(tǒng)發(fā)育鑒定

將分離的純菌株在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)之后進行16sPCR擴增，16s引物序列為：27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)and 1492R(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)，擴增產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司測序進行菌種鑒定[13].

1.4 銻氧化菌的形貌特征分析

取液體或固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 h左右、旺盛生長的菌體.

(1)收集菌體：①液體培養(yǎng)基中的菌體，取10 mL培養(yǎng)液8 000 rpm離心3～5 min，棄上清液，倒入2.5%戊二醛固定液；②固體培養(yǎng)基上的菌體，在菌落表面滴幾滴戊二醛固定液，輕刮菌落.將菌液吸入離心管，離心后換入新鮮戊二醛固定.

(2)固定、脫水，按常規(guī)方法進行：2.5%戊二醛，磷酸緩沖液清洗3次-乙醇梯度脫水，30%，50%，70%，85%，95%各一次，100%乙醇2次，15～20 min/次-乙酸異戊酯置換2次，20 min/次.將樣品進行冷凍干燥處理.干燥后的樣品進行離子濺射儀噴鍍后，透射電子顯微鏡(美國FEI，F(xiàn)EI Tecnai G2 F20 S-TWIN)觀察、拍照[19,20].

1.5 銻氧化菌的氧化效率及生長特性

將具有氧化性的單菌落挑在100 mL LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，將菌液在6 000 g下離心5 min后用PBS溶液洗滌兩次，將OD600調(diào)到1.取1 mL菌液接種到200 mL的CDM-A培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)10 d，前24 h每隔2 h取一次樣，隨后每隔12 h取一次樣測OD值(用96孔板測，每個樣只需要200 uL)，同時每2 d取樣采用1.2中氧化性鑒定的方法測定生成的Sb(Ⅴ)濃度(每次需要取10 mL).試驗均設(shè)置三個平行.

1.6 銻氧化菌最佳生長條件測定

根據(jù)氧化效率結(jié)果，選擇氧化效率最強的菌株，采用正交試驗考察溫度，pH，鹽度以及銻濃度對該菌株生長的影響并研究其最佳生長條件.用于試驗的CDM-A培養(yǎng)基除銻含量以及鹽分濃度變化外，其余各組分保持一致，并按照正交試驗安排調(diào)整培養(yǎng)基pH.將具有氧化性的單菌落先挑在100 mL LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期(OD600=0.4～0.5左右)，將菌液在6 000 g下離心5 min后用PBS溶液洗滌兩次，將OD600調(diào)到1.取1 mL菌液接種到50 mL的CDM-A培養(yǎng)基中，按照正交試驗安排調(diào)整試驗溫度，在180 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h后測定OD值.試驗均設(shè)置三個平行，同時做不加菌的空白[21-23].

2 結(jié)果與討論

2.1 耐銻細菌的分離及其銻氧化性的鑒定

本研究從銻污染土壤中分離了8株耐銻細菌，對8株細菌進行氧化性鑒定，結(jié)果如圖1所示.8株耐銻細菌均表現(xiàn)出一定的氧化能力，且ZH1、ZH2、ZH3、ZH4、ZH6表現(xiàn)出了較強的氧化能力，ZH4的氧化能力顯著較高(p<0.01).在自然界中，銻的氧化是一個極其緩慢的過程[24]，而在微生物的作用下，銻的氧化速率明顯提高[25].此類微生物的存在，有利于促進銻從低價態(tài)往高價態(tài)轉(zhuǎn)變，從而降低其環(huán)境風(fēng)險.

圖1 耐銻細菌銻氧化性能力測定

2.2 銻氧化菌的微觀形態(tài)及系統(tǒng)發(fā)育鑒定

對Sb礦區(qū)土壤進行Sb氧化菌的分離篩選，從Sb濃度為200 umol·L-1的CDM-A培養(yǎng)基中分離篩選出8株耐Sb的細菌.對菌進行氧化性鑒定之后發(fā)現(xiàn)有6株具有氧化性.菌株ZH1(如圖2所示)屬于假單胞菌屬，該菌株為桿狀，菌落呈乳白色，圓形，表面凸起.菌株ZH2屬于假單胞菌屬，該菌株為球狀，菌落不規(guī)則形狀，皺紋，干燥.ZH3為不動桿菌屬，該菌株為桿狀，菌落為圓形，邊緣濕潤，黃色.ZH4為假單胞菌屬，該菌株球狀，表面有褶皺，菌落較干燥，貼合培養(yǎng)基不易脫落，淡黃色.ZH6為貪銅菌屬，該菌株為桿狀，菌落呈圓形，光滑，濕潤.其中前四株菌的基因測序序列上傳NCBI數(shù)據(jù)庫并獲取ACCESSION No.分別為SUB5682247 ZH1 MK990007，SUB5682247 ZH2 MK990008，SUB5682247 ZH3 MK990009，SUB5682247 ZH4 MK990010.

(a)菌株ZH1 (b)菌株ZH2

(c)菌株ZH3 (d)菌株ZH4

(e)菌株ZH6圖2 氧化菌株的電鏡照片

將分離的耐銻細菌的16s rRNA基因序列經(jīng)過BLAST比對發(fā)現(xiàn)，分離的菌株與已發(fā)表的模式菌株的相似度達99%～100%.菌株ZH1，ZH2，ZH4，ZH5屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)(最大相似度99%～100%)，菌株ZH3，ZH7，ZH8屬于不動桿菌屬(Acinetobacter)(最大相似度99%～100%)，菌株ZH6屬于貪銅菌屬(Cupriavidus)(最大相似度100%)(如圖3所示).因此該土壤中銻氧化菌主要是假單胞菌屬(P-seudomonas)和不動桿菌屬(Acinetobacter).這與Shi等[11]的研究結(jié)果一致.Shi 等從中國采集了11種不同的礦物樣品(富含Sb/Cu等)，分離得到了100多株耐銻和耐銅菌，其中36株具有Sb(Ⅲ)氧化能力，這些菌株主要來自于假單胞菌屬(Pseudomonas)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)和不動桿菌屬(A-cinetobacter).

圖3 基于16S rRNA基因序列Neighbor-Joining法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 銻氧化菌的氧化效率以及生長曲線

選擇氧化能力較強的ZH1、ZH2、ZH3、ZH4、ZH6進行氧化效率及生長測定.5株銻氧化菌的氧化效率如圖4(a)～(e)所示，5株菌均表現(xiàn)出良好的三價銻氧化能力，其中ZH1、ZH2和ZH6號菌在培養(yǎng)的第10天能氧化超過60%的三價銻，ZH3號菌在培養(yǎng)的第10天氧化超過70%的三價銻，而ZH4號菌能在培養(yǎng)的第10天氧化培養(yǎng)基中95%的三價銻.這與Nguyen V K等[1]的研究結(jié)果相似.Van等共分離出8株銻氧化菌，培養(yǎng)基所含三價銻濃度為100μmol·L-1，8株菌的氧化性在35.8%以上，其中氧化效率最高的菌Cupriavidus sp.NL4在21天內(nèi)可氧化掉98.7%的銻.此外，在Li等[13]分離得到的銻氧化菌中，Comamonas spp.S44和JL40，能在3～5天后氧化50 mmol·L-1Sb(Ⅲ).

由此可知，相比于已有的研究分離的銻氧化菌，本研究中所分離出來的幾種銻氧化菌均可在10 d內(nèi)達到60%甚至95%的氧化能力.此外本研究分離菌所用土壤，除了銻濃度較高之外，Pb、Zn、Cu的含量也嚴(yán)重超標(biāo)(表1)，說明這些菌株在復(fù)合重金屬污染土壤中的耐受性較強，其應(yīng)用范圍更加廣泛.

(a)菌株ZH1

(b)菌株ZH2

(c)菌株ZH3

(d)菌株ZH4

(e)菌株ZH6圖4 不同銻氧化菌氧化曲線和生長曲線(圖中紅線代表三價銻氧化曲線；黑線代表生長曲線)

5株菌生長曲線結(jié)果顯示，不同菌株達到對數(shù)生長期所用的時間不同.ZH1、ZH2生長到96 h左右OD600分別達到0.5 mg/L，0.54 mg/L.ZH3、ZH4在72 h左右OD600分別達到0.58 mg/L，0.53 mg/L.ZH6在36 h左右OD600達到0.54 mg/L.在實際的銻氧化菌運用中，應(yīng)明確不同銻氧化菌生長周期，使得其在生長對數(shù)期發(fā)揮最大的氧化效率.

2.4 銻氧化菌最佳生長條件測定

選擇氧化性最強的ZH4進行最佳生長條件的測定，采用正交試驗考察溫度、pH、銻濃度以及鹽度對ZH4生長的影響.正交試驗結(jié)果如表2所示.由極差分析，可以得出主要因子為鹽度以及溫度，次要因子為銻濃度和pH；最佳水平組合為A3B2C2D1，即ZH4在溫度為28 ℃，pH為5.2，銻濃度為50μmol·L-1，鹽度為1%條件下生長，其OD600達到最高，說明該條件適合該菌株的生長，通過Design-Expert 8.06 Trial 對因子數(shù)據(jù)進行進一步分析，得到該菌株菌體個數(shù)和生長條件的函數(shù)公式如下：

OD600=

0.118 91-0.136 19*A+0.074 801*B+

6.112 91×10-4*C+0.143 9*D

(1)

式(1)中：A代表溫度，B代表pH，C代表銻濃度，D代表鹽度.

該條件適合該菌株的生長，但其他條件下的氧化效率，還有待進一步的實驗研究.劉成佐等[26]發(fā)現(xiàn)，從銻礦區(qū)受污染的土壤中篩選的菌株對堿性環(huán)境最為敏感，適宜生長的pH在6.5左右.其次是溫度，適宜溫度為25 ℃左右.適宜的培養(yǎng)基銻質(zhì)量濃度為300μg·mL-1，銻質(zhì)量濃度過高會對菌株有一定抑制作用；聶孝紅等[27]的研究中4株細菌的生長對pH和滲透壓變化的響應(yīng)也存在差異，不同的菌株對pH和滲透壓條件要求不同.

表2 正交試驗表 L16(45)

3 結(jié)論

本研究從銻礦區(qū)土壤中分離篩選出8株耐銻菌，其中有5株菌均表現(xiàn)出了較強的氧化能力，分離的銻氧化菌主要屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)和不動桿菌屬(Acinetobacter)，不同的銻氧化菌其形態(tài)存在差異.其中ZH4的氧化性最強，ZH3、ZH4、ZH6的氧化效率較高，且不同的菌株表現(xiàn)出不同的生長特性，且在常規(guī)的自然條件下便能很好的繁殖，為微生物修復(fù)銻污染提供了良好的菌種資源，可以作為較好的試驗材料應(yīng)用于生物修復(fù)Sb污染土壤的研究.