張遠遠 曾悅 朱艷霞 廉翠紅

1深圳大學第一附屬醫(yī)院 深圳市第二人民醫(yī)院皮膚科 518035；2深圳大學醫(yī)學部醫(yī)學細胞生物學與遺傳學系 518000

臨床上，各種炎癥、潰瘍、燒傷等造成皮膚的損傷修復是亟需解決的問題［1］。研究表明，脂肪組織來源的干細胞促進皮膚創(chuàng)傷修復的一個重要作用途徑是旁分泌，旁分泌的載體外泌體可能是促進創(chuàng)傷愈合的關鍵因素［2］。與直接使用干細胞相比，富集了來源細胞的蛋白質、mRNA 和 miRNA［3-4］等信號分子的外泌體具有生物相容性、低毒性、低免疫原性等安全性特性［5-6］。相對于其他干細胞來源，人脂肪干細胞（human adipose-derived stem cells，hADSC）來源容易且體外擴增速度快［7］，外泌體獲得更為容易，因此hADSC 的外泌體更適合運用于皮膚創(chuàng)傷修復。為了探索一種基于hADSC 外泌體的無細胞療法，我們結合超速離心和超濾濃縮提取大樣本的外泌體，并在人角質形成細胞上進行功能學驗證，為后續(xù)hADSC 外泌體的無細胞創(chuàng)面治療機制研究提供依據(jù)。

材料與方法

一、材料

1.主要試劑：0.25%胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清均產(chǎn)自美國Gibco 公司；鼠抗人 CD63、Alix、TSG101 單克隆抗體來自英國abcam 公司；無外泌體培養(yǎng)基血清來自以色列Vivacell公司；BCA試劑盒來自南京碧云天公司。

2.主要儀器：Optima MAX-XP臺式超速離心機（美國Beckman Coulter 公司）、100 000 超濾管（美國Millipore 公司，UFC910096-1pk）、納米激光粒徑分析儀（DLS，美國Beckman公司，DelsaMax CORE）。

二、實驗方法

1.分離培養(yǎng)原代 hADSC［8］：本研究已通過深圳大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，批件號KS20181229001，取材前受試者已簽署知情同意書。無菌條件下獲得1 例35 歲女性志愿者抽脂術后脂肪組織20 ml，將勻漿狀脂肪移入50 ml離心管中，按照1∶2 體積加入0.25%胰蛋白酶（無乙二胺四乙酸）和0.1%Ⅰ型膠原酶消化液。37 ℃恒溫搖床振蕩消化5 min，移液管吹打消化10 min，靜置待液面分層，將下層液體移入離心管中，用2 倍體積的完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清+高糖DMEM+1%青霉素/鏈霉素）終止消化。在剩余脂肪中加入新的消化酶混合液，重復以上步驟3 次，每次消化時間應＜30 min。將收集到的液體1 500 r/min 離心15 min（最大離心半徑8.68 cm），去上清液，向細胞沉淀中加入完全培養(yǎng)基重懸細胞，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后觀察換液，棄去未貼壁細胞，每3 天換液1 次。當細胞生長至融合度90%時，用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代。

2.外泌體分離：根據(jù) Thery 等［9］所制定的外泌體提取方法中，超速離心法與超濾法結合改良。取70%～80%融合的第4 ～6代脂肪干細胞，用無外泌體血清配制的培養(yǎng)基處理48 h，收集150 ml 上清液。按照圖1流程進行差速離心，用1 ml長槍頭棄去上清液（外泌體沉淀過小，不易看到，可在管壁作標記，以防誤吸丟失），然后用1 × 磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸外泌體，收集后-80 ℃保存。

3.外泌體鑒定：采用透射電鏡觀察濃縮后的外泌體、拍照，DLS 檢測粒徑大小，收集數(shù)據(jù)。Western 印跡法檢測外泌體抗原表達，用蛋白裂解液裂解外泌體提取蛋白，加入蛋白樣品常規(guī)10%分離膠電泳轉膜后，把硝酸纖維素膜用5%脫脂牛奶在 TBST 緩沖液中封閉 1 h，TBST 洗膜 3 次，每次7 min。鼠抗人 CD63、Alix 和 TSG101 單克隆抗體（1∶1 000）4 ℃孵育過夜后，TBST 洗膜3 次，每次7 min。辣根過氧化物酶標記的特異性兔抗鼠二抗（1∶5 000）孵育1 h 后，TBST 洗膜，配制顯影液，凝膠成像系統(tǒng)下顯影曝光。按照說明書用BCA 法檢測外泌體蛋白濃度。

4.H2O2誘導構建表皮細胞損傷模型：取對數(shù)生長期HaCaT 細胞重懸計數(shù)，按照5×103個/孔接種于96孔板，孵育12 h。取上清液，加入100 μl終濃度為0、50、100、200、250、300、400、500、600、800 μmol/L的H2O2培養(yǎng)液，每組設6個復孔。在培養(yǎng)箱中作用1 h后，去除刺激培養(yǎng)基，PBS清洗1遍，加入培養(yǎng)基（110 μl/孔）與CCK8 預混液，孵育3 h，酶標儀檢測各孔450 nm波長處吸光度（A450值）。

5.外泌體攝取實驗：將HaCaT細胞（1×104個）懸液接種于共聚焦小皿中培養(yǎng)24 h后，細胞貼壁生長，當融合率為20%～30%時將HaCaT細胞分為正常組（PBS預處理）和損傷組（用100 μmol/L H2O2預處理30 min），預處理結束后損傷組撤去H2O2，將兩組再均分為兩個亞組，即治療組和對照組，其中治療組與外泌體共培養(yǎng)，對照組與PBS共培養(yǎng)。共培養(yǎng)前，按照親脂熒光染料PKH26 說明書對外泌體避光染色5 min，取染色后的外泌體（5 mg/L）與HaCaT 細胞共培養(yǎng)2 h，棄培養(yǎng)上清液，用PBS沖洗2遍，于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

6.外泌體對HaCaT細胞遷移力的影響：

（1）劃痕實驗：按照“外泌體攝取實驗”中方法對細胞分組處理，共培養(yǎng)2 h 后，取對數(shù)生長期HaCaT 細胞，消化、離心、計數(shù)，以5 × 104個/孔接種于 24 孔板，12 h 鋪滿后用 200 μl 槍頭垂直孔板劃痕，用PBS 輕輕沖洗細胞1 次，對照組和治療組分別加入2 ml 10%血清低糖培養(yǎng)基、10%血清低糖培養(yǎng)基 + 10 mg/L 外泌體（hADSC 外泌體），放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在0、12、24 h時拍照記錄，通過Image J軟件計算細胞遷移面積，分析兩組劃痕修復率。

（2）Transwell 遷移實驗：取對數(shù)生長期HaCaT細胞用PKH26 染色后重懸計數(shù)，以5×104個/孔接種于上室，分為正常組和損傷組，處理同上。撤去H2O2后，將正常組和損傷組分為治療組和對照組，治療組下室加入含10 mg/L 外泌體的完全培養(yǎng)基，而對照組下室則加入與外泌體等體積的PBS 完全培養(yǎng)基。分別置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h后用4%多聚甲醛固定，熒光顯微鏡觀察遷移細胞數(shù)。隨機選取8個10倍鏡下視野，用圖像分析軟件NIS-Elements Viewer 4.20（日本Nikong 公司）計算每個視野下的平均細胞數(shù)。

圖1 超速離心和超濾濃縮結合的改良外泌體分離流程圖 帶紅色瓶蓋者為超濾管，管中為超濾膜；帶黃色瓶蓋者為普通離心管

圖2 人脂肪干細胞形態(tài)（×100） 2A：原代培養(yǎng)24 h；2B：原代培養(yǎng)3 d；2C：原代培養(yǎng)7 d，細胞達80%融合；2D：擴增至4代時脂肪干細胞已經(jīng)純化，以成纖維樣典型梭形為主

7.統(tǒng)計學方法：用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD 檢驗，P＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。相關性檢驗采用Spearman 檢驗，P＜ 0.01 認為顯著相關。每組實驗至少重復3 次以校正P值和控制系統(tǒng)誤差。

結 果

一、hADSC的形態(tài)

從人皮下脂肪組織中分離獲得的hADSC 具有較強的增殖和分化能力。接種24 h內開始貼壁，原代hADSC初為短梭形，細胞大小不等，核質比例較大（圖2A）；3 d 后可見細胞伸展，大多數(shù)細胞為長梭形，形態(tài)類似成纖維細胞，核呈橢圓形，較大（圖2B）；7 d時可達80%融合（圖2C）；第4代hADSC已經(jīng)純化，以成纖維樣典型梭形為主，且排列緊密，大小一致，呈漩渦狀生長（圖2D）。

二、hADSC外泌體的鑒定

從hADSC 培養(yǎng)上清液中提取的外泌體，電鏡下具有外泌體典型的杯狀形態(tài)，且大小均一（圖3）。利用DLS檢測顯示，樣品中外泌體直徑中位數(shù)（P25，P75）為195.59 nm（121.62 nm，248.03 nm），范圍75.62 ～ 641.52 nm，純度為65.88%。Western 印跡檢測（圖4）顯示，外泌體表達CD63、Alix、TSG101特異蛋白。BCA 法測定外泌體蛋白實際濃度為730.14 mg/L。

圖3 透射電鏡下觀察從脂肪干細胞外泌體的形態(tài)特征 外泌體直徑略小于100 nm，具有茶托樣雙層膜結構

三、CCK8法構建表皮細胞損傷模型

如圖 5 所示，H2O2在 0 ～ 300 μmol/L 范圍內有明顯抑制HaCaT 細胞增殖的作用，細胞存活率與H2O2濃度呈負相關（r=-0.91，P＜ 0.01），而H2O2濃度在300 μmol/L 以上時，大多數(shù)細胞凋亡。因此，確定后續(xù)實驗中H2O2濃度為100 ～ 200 μmol/L，作用時間為1 h。

四、外泌體攝取實驗

見圖6。共聚焦顯微鏡下觀察，共培養(yǎng)2 h后，正常組HaCaT 細胞形態(tài)正常，呈鋪路石樣排列，損傷組HaCaT 細胞存在凋亡表現(xiàn)；正常治療組、損傷治療組兩組細胞胞質內散在分布紅色熒光顆粒，是染色后被HaCaT 細胞攝取的外泌體。正常治療組熒光亮度大于損傷治療組，說明損傷后HaCaT細胞攝取能力下降。

圖4 Western 印跡檢測外泌體 Alix、CD63、TSG101 蛋白的表達 M：標準參照物；1 ～ 3：分別為Alix、CD63、TSG101蛋白

圖5 不同濃度H2O2作用1 h后HaCaT細胞存活率 1 ～10：分別為0、50、100、200、250、300、400、500、600、800 μmol/L。0 ～ 300 μmol/L范圍內，H2O2濃度與HaCaT細胞存活率呈負相關

圖6 HaCaT 細胞吞噬外泌體情況（×200） 紅色熒光顆粒示PKH26染色后外泌體。正常治療組的熒光亮度及數(shù)量大于損傷治療組，說明損傷的HaCaT 細胞攝取外泌體數(shù)量低于正常HaCaT細胞

五、外泌體對HaCaT細胞遷移力的影響

劃痕實驗（圖7）顯示，正常對照組、正常治療組、損傷對照組、損傷治療組HaCaT 細胞12 h 劃痕面積修復率分別是40.26% ± 0.64%、69.57% ±0.69%、32.28%±0.31%、69.62%±1.68%，損傷治療組顯著高于損傷對照組（t= 37.33，P＜ 0.01）。Transwell 實驗（圖8）顯示，正常對照組、正常治療組、損傷對照組、損傷治療組10倍視野下遷移細胞數(shù)量分別是20.85±4.84、44.8±5.24、14.95±2.58、40.05 ± 7.66，正常對照組和正常治療組間（t=17.30，P＜ 0.01）、損傷對照組和損傷治療組間（t=25.10，P＜0.01）差異都有統(tǒng)計學意義，并且正常對照組遷移細胞數(shù)大于損傷對照組（t= 4.80，P＜0.01），正常治療組與損傷治療組間差異無統(tǒng)計學意義（t=4.75，P＞ 0.05）

討 論

圖7 劃痕實驗檢測人脂肪干細胞外泌體對HaCaT細胞遷移的影響 損傷治療組的劃痕修復率較損傷對照組明顯減少

圖8 Transwell實驗觀察外泌體對HaCaT細胞損傷刺激后24 h遷移能力的影響（×100） 熒光顯微鏡下，損傷治療組穿膜細胞計數(shù)高于損傷對照組

現(xiàn)有外泌體分離方法主要是超速離心法、密度梯度離心法、抗體磁珠結合法、沉淀法等［10-11］。國外研究顯示［12］，單純的超速離心由于不同類型轉子和使用者之間的差異，回收率常常不同，且耗時，操作繁瑣［13］。通過改良，我們探索出適合 hADSC 外泌體的提取方法，即先用100 000 超濾管對低速差速離心后的離心液進行超濾濃縮，得到富含外泌體的超濾液，再超速離心把外泌體從這樣的濃縮液中分離沉淀下來。這樣獲得的外泌體重懸后立即進行分析［14］，能更加準確地測量外泌體的表面特征、形態(tài)特征和蛋白質含量。如果不能立即分析，為了保證外泌體蛋白含量和功能分析的準確性，可以將外泌體在4 ℃保存（約1周）或-80 ℃保存（1年）［15］。

本研究提取外泌體的方法有如下優(yōu)點：①步驟簡單：無需其他輔助工具或者儀器，使其不僅克服了現(xiàn)有單純超速離心法步驟多帶來的操作失誤及混入雜質的缺點，而且解決了現(xiàn)有單純超濾法數(shù)次濃縮后外泌體粘連在超濾膜上造成外泌體流失的問題；②雜蛋白少：如果采用過小孔徑的超濾管易導致濾孔堵塞，造成雜蛋白混入，本研究選擇更大的孔徑可以截留相對分子質量100 000的超濾管濃縮上清液，即完全可以截留直徑40 ～200 nm 的納米囊泡結構的外泌體，又能有效防止堵塞，減少雜蛋白；③高效性：對于現(xiàn)有單純的超速離心法，最大的超速離心管僅30 ml，一次4 h 只能處理240 ml，而濃縮后超速離心，一次能處理的細胞上清液是單純超速離心法的60倍；④價格低廉：超濾管和超速離心管均可以重復利用3 ～5次，分離方法簡單，成本低，且可節(jié)省人力和物力，更加適合外泌體產(chǎn)業(yè)化要求。

通過上述改良方法所分離出的囊泡結構具有典型的外泌體形態(tài)特征：電鏡下囊泡呈杯狀、扁平球形（直徑60 ～ 80 nm），DLS 顯示樣品外泌體純度達65.88%，并且表達CD63、Alix 和TSG101，與其他學者研究的結果一致［16-17］。綜上結果說明，提取的外泌體符合現(xiàn)有研究公認水平［18-20］。DLS和電鏡所測量的粒徑有差異，有研究顯示，采用直接冷凍，低溫電鏡觀察前列腺上皮細胞來源外泌體是含水飽滿的圓型，而不是杯狀［21］，所以猜測可能因為電鏡樣品制作時化學固定導致外泌體極度脫水，使得電鏡粒徑較DLS 的結果偏小，推測杯狀結構因此產(chǎn)生。外泌體屬于溶液狀態(tài)下的復合粒子，而DLS基于動態(tài)光散射原理測水合粒徑（流體動力學直徑）會比真實粒徑大，因為溶液中的外泌體外面還有一層膨脹的膠團［22-23］。同時如果顆粒團聚，動態(tài)光散射測出的是團聚后粒徑，也會影響平均粒徑，最后DLS 測得數(shù)據(jù)因計算方法不同，半徑結果也不同。所以DLS 測量的粒徑大小只是判斷外泌體的手段之一。外泌體的囊泡結構，對于其內含有的大量不同種類的蛋白質、脂質成分以及核酸是一種保護結構，能使外泌體在不同的酸堿環(huán)境、缺氧、高溫、反復凍融等惡劣條件下仍保持較高穩(wěn)定性。

目前外泌體的定量尚不規(guī)范，常用BCA 蛋白測量法和納米顆粒分析追蹤儀這兩種方法，前者是通過檢測樣品總蛋白來間接測定外泌體含量，后者是檢測納米囊泡數(shù)量，但兩種方法其實都不能直接定量外泌體的量。本研究通過BCA 蛋白定量外泌體，150 ml左右的上清液可以收集73.14 μg左右蛋白，但也存在收集量不穩(wěn)定的情況。因為以干細胞外泌體為載體的無細胞療法，是利用其攜帶的分子（蛋白質、RNA、脂質）調控相關通路，間接或直接治療，這就迫切需要更精確的設備分析定量所提取外泌體的產(chǎn)率、純度以及內容物。

目前許多研究表明，外泌體具有類似干細胞的組織修復功能，可獨立地作為一種生物活性成分應用于皮膚損傷修復治療，甚至替代干細胞發(fā)揮功能。當皮膚損傷時，脂肪干細胞被趨化至傷口附近，產(chǎn)生外泌體調控受損區(qū)域細胞自我修復與組織再生，加速創(chuàng)面修復。Oh 等［24］發(fā)現(xiàn)誘導多能干細胞外泌體通過顯著抑制成纖維細胞（HDF）的衰老標志物SA-β-Gal 和基質降解酶的過表達，促進HDF表達Ⅰ型膠原蛋白達到治療作用，從而證明多能干細胞外泌體抗皮膚衰老的潛力。Kim 等［25］研究發(fā)現(xiàn)，間充質干細胞來源的多能干細胞的外泌體通過增加細胞外信號調節(jié)激酶ERK1/2 的磷酸化，促進HaCaT 細胞和HDF 的生長和增殖，并觀察到外泌體治療組HaCaT 細胞的纖連蛋白水平更高。Bakhtyar 等［2］采用蛋白質譜分析發(fā)現(xiàn)，人臍帶華氏膠組織（Wharton′s Jelly）來源的間充質干細胞外泌體中高表達α2M 蛋白，推測此蛋白可能是外泌體促進創(chuàng)面修復的重要因子。Hu等［16］用小鼠皮膚切口模型體內示蹤法證實，外泌體可以被成纖維細胞攝取，并以劑量依賴性方式刺激細胞遷移、增殖和膠原合成，增加神經(jīng)-鈣黏素、細胞核抗原、細胞周期蛋白D1和膠原Ⅰ、Ⅲ基因的表達，為傷口修復提供結構支架作用的膠原蛋白，從而促進小鼠皮膚肉芽組織的形成。另有研究也證實，干細胞來源的外泌體能夠加速傷口愈合和減輕瘢痕形成，并且用HDF 在細胞水平上驗證外泌體促進其增殖和遷移［26-27］，Zhang等［27］認為，臍帶間充質干細胞外泌體能促進HaCaT 細胞的增殖與遷移，并通過活化AKT 信號通路抑制熱損傷誘導的細胞凋亡，而AKT 的活化不能完全解釋外泌體對皮膚細胞增殖和遷移的促進作用。因此，雖然干細胞源外泌體在皮膚損傷修復中有大量研究，但這些研究大多集中于HDF，脂肪來源干細胞的外泌體是否也能促進HaCaT細胞遷移尚不清楚，以及外泌體修復氧化應激損傷后HaCaT細胞的效果也并未見報道。

研究發(fā)現(xiàn)，皮膚創(chuàng)傷時外源因素誘導的氧化應激在皮膚損傷中起關鍵作用。而大量活性氧自由基（ROS）產(chǎn)生是氧化應激的最重要因素之一。而具有無電荷，相對穩(wěn)定的H2O2是ROS 主要成分之一［28］。基于上述情況，本研究用100 μmol/L H2O2處理1 h 制備HaCaT 細胞輕中度損傷模型，以模擬皮膚創(chuàng)傷時生理狀態(tài)，然后用10 mg/L hADSC 外泌體來治療。劃痕實驗說明，在創(chuàng)傷發(fā)生12 h內損傷治療組的HaCaT 細胞較損傷對照組增殖和遷移速度更快［29］，外泌體治療起效的時間點相同，這說明外泌體可能攜帶促進/阻斷細胞增殖信號表達的相關遺傳信息，使其作用12 h內可以調節(jié)受體細胞的增殖水平，而后恢復正常水平。同時在外泌體攝取實驗中損傷治療組較正常治療組吞噬外泌體減少，推測主要原因是外泌體的選擇性：即處于不同狀態(tài)的HaCaT細胞選擇性地吞噬外泌體，對于正常脂肪干細胞在正常生長情況下分泌的外泌體，其內容物不是損傷組HaCaT細胞需要的，所以只是少量吞噬，既往文獻曾報道過這種選擇性［30-31］；也有可能是損傷治療組細胞膜在H2O2的作用下發(fā)生了功能損傷，無法完成流暢的攝取功能以及觀察時間過短難以力證損傷組HaCaT 細胞吞噬外泌體較正常HaCaT細胞攝取減少。這說明外泌體因為攜帶的內容物不同而具有選擇性，這種選擇性在外泌體調控效應細胞生理功能方面具有重要作用。Transwell 實驗說明，hADSC外泌體確實可以促進損傷組HaCaT細胞的遷移。在創(chuàng)傷愈合中，表皮細胞快速遷移覆蓋傷口，是抗感染和加速愈合的重要步驟［32］。根據(jù)本實驗結果，我們推測hADSC 來源的外泌體具有調節(jié)皮膚創(chuàng)傷愈合中細胞遷移的作用，可以加速創(chuàng)傷愈合與抑制瘢痕形成，提升創(chuàng)面修復能力，至于創(chuàng)傷愈合過程中外泌體與炎癥反應、細胞增殖、分化、血管生成與基質重建等多個階段［33］的關系還需更深一步研究。

綜上所述，我們通過改良法從脂肪干細胞上清液中成功分離出外泌體，證實無論損傷組還是正常組HaCaT 細胞都能夠攝入PKH26 標記的外泌體，并用提取的外泌體進行功能實驗，初步說明hADSC外泌體具有促進氧化應激損傷后HaCaT 細胞遷移的能力，為后續(xù)的機制研究提供了依據(jù)。另外，本研究由于時間和精力所限，還有很多不足，如劃痕實驗無法排除細胞生長增殖的影響，缺乏動物實驗，有待在今后研究中進一步補充、修正和深入。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突