秦俊霞 秦小衛(wèi) 趙鵬

山西省人民醫(yī)院皮膚科，太原 030012

銀屑病的發(fā)病與多基因遺傳背景下的細(xì)胞免疫異常密切相關(guān)，T 細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等以及這些細(xì)胞之間的復(fù)雜相互作用誘導(dǎo)銀屑病的發(fā)生發(fā)展［1］。T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白3（T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3，TIM-3）是一類T細(xì)胞表面抑制性分子，在病毒感染、腫瘤等疾病過程中發(fā)揮介導(dǎo)免疫耐受的作用［2-3］。TIM-3 不但可調(diào)控T 細(xì)胞功能，還在多種抗原提呈細(xì)胞中高表達(dá)，調(diào)控單核巨噬細(xì)胞活化，參與機(jī)體固有免疫應(yīng)答［4-5］。TIM-3 在銀屑病患者 Th1 和Th17 細(xì)胞中的表達(dá)降低，誘導(dǎo)并促進(jìn)炎癥應(yīng)答［6］，但TIM-3 對銀屑病患者單核細(xì)胞的調(diào)控作用尚未見相關(guān)報道。本研究利用體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，研究TIM-3對銀屑病患者CD14+單核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子功能的調(diào)控作用，以期初步闡釋TIM-3對固有免疫的調(diào)控在銀屑病發(fā)病中的作用。

對象和方法

一、對象

2017年11月至2018年3月于山西省人民醫(yī)院皮膚科就診的尋常型銀屑病患者47例，入組標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18 歲且符合《中國銀屑病治療專家共識（2014版）》診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并惡性腫瘤、合并自身免疫性疾病、合并慢性病毒感染或者長期接受免疫抑制劑治療。其中，男21 例，女26 例，年齡18 ～ 57（41.8 ± 13.9）歲，銀屑病面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（psoriasis area and severity index，PASI）評分4 ～ 29（8.12± 3.37）分。19例年齡和性別相匹配的健康體檢者作為對照組，其中男8例，女11例，年齡18 ～ 65（39.7 ± 10.9）歲。本研究方案已通過山西省人民醫(yī)院倫理委員會審核［（2017）省醫(yī)倫審字19號］，所有入組志愿者均簽署知情同意書。

二、方法

1.外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的分離：清晨空腹留取外周血20 ml，EDTA 抗凝。使用Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液（美國Sigma 公司），采用密度梯度離心法分離PBMC，凍存于液氮中備用。

2.流式細(xì)胞儀檢測CD14+細(xì)胞TIM-3的表達(dá)和IL-12的分泌：每例受試者取106個PBMC，設(shè)立2個復(fù)孔，每個復(fù)孔中加入5 × 105個PBMC，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，其中1 個復(fù)孔加入Toll 樣受體4（Tolllike receptor 4，TLR4）配體脂多糖（lipopolysaccharide，LPS；美國 Invivogen 公司，終濃度為 5 mg/L）和TLR7/8 配體 R848（美國 Invivogen 公司，終濃度為5 mg/L）刺激培養(yǎng)12 h，在刺激培養(yǎng)的后6 h加入布雷非德菌素A（美國BD公司，終濃度為10 mg/L）抑制蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，另1個復(fù)孔不加刺激因子。培養(yǎng)后收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)入FACS 管中，加入抗CD14-APC（美國eBioscience 公司）和抗 TIM-3-FITC（美國eBioscience公司）進(jìn)行細(xì)胞表面染色，加入抗IL-12-PE（美國eBioscience 公司）進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色。使用FACS AriaⅡ流式細(xì)胞儀檢測，CellQuest Pro軟件獲取細(xì)胞，F(xiàn)lowJo Version 8.7.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3.角質(zhì)形成細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：取10 例尋常型銀屑病患者皮損標(biāo)本置于預(yù)冷的0.2%胰酶中冷消化12 h，然后37 ℃熱消化30 min，待真表皮分離時轉(zhuǎn)入裝有含10%胎牛血清的RMPI 1640 培養(yǎng)液無菌平皿中沖洗，分離表皮，放入離心管中反復(fù)吹打，過100目尼龍篩，獲取細(xì)胞，然后以105/cm2的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后，強(qiáng)力沖洗去除未貼壁細(xì)胞，然后消化貼壁細(xì)胞，收集并計數(shù)。

4.CD14+單核細(xì)胞分選：復(fù)蘇凍存的PBMC，于4 ℃、300×g離心10 min，收集細(xì)胞，加入分離緩沖液重懸細(xì)胞，并加入CD14 Microbeads（德國美天旎公司），4 ℃避光孵育15 min。將使用分離緩沖液預(yù)處理的分離柱置于分離架上，將上述細(xì)胞懸液加入分離柱中，CD14+細(xì)胞吸附于分離柱內(nèi)，從分離架上取下分離柱，加入分離緩沖液，收集CD14+單核細(xì)胞并計數(shù)。

5.CD14+單核細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的建立：取純化的CD14+單核細(xì)胞，加入抗TIM-3抗體（美國R&D 公司，終濃度為10 mg/L）刺激培養(yǎng)12 h，對照組加入對照抗體IgG（美國R&D 公司，終濃度為10 mg/L）培養(yǎng)12 h，洗滌細(xì)胞后，取5×105個CD14+單核細(xì)胞，與同一患者分離的105個角質(zhì)形成細(xì)胞直接混合共培養(yǎng)，向培養(yǎng)液中加入LPS 和R848刺激培養(yǎng)12 h，在刺激培養(yǎng)的后6 h加入布雷非德菌素A 抑制蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，收集CD14+單核細(xì)胞進(jìn)行TIM-3和IL-12的流式細(xì)胞檢測。

6.Western 印跡檢測細(xì)胞因子信號抑制物1（suppressor of cytokine signaling-1，SOCS-1）表達(dá)和抗信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1（signaling transducers and activators of transcription-1，STAT-1）磷酸化：取抗TIM-3刺激后的CD14+單核細(xì)胞，加入50 μl 細(xì)胞裂解液，冰上裂解15 min 后于95 ℃孵育10 min，收集上清液，加入等量的2×SDS-PAGE 緩沖液，取 30 μl 標(biāo)本加入 SDS-PAGE 電泳濃縮膠孔中電泳至分離膠后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用封閉緩沖液封閉轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜后，加入抗SOCS-1抗體（1∶1 000稀釋）、抗STAT-1抗體（1∶1 000稀釋）、抗磷酸化STAT-1抗體（1∶1 000稀釋）或抗GADPH抗體（1∶2 000稀釋），4 ℃孵育過夜。洗滌后加入抗兔IgG-HRP（1∶2 000 稀釋），室溫孵育2 h。所有抗體均購自美國Abcam 公司。洗滌后利用化學(xué)發(fā)光法顯影。使用ImageJ軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度檢測。

7.統(tǒng)計學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0軟件處理，先進(jìn)行正態(tài)性檢測，符合正態(tài)分布，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PBMC中CD14+單核細(xì)胞表面TIM-3的表達(dá)

在無TLR 配體刺激狀態(tài)下，銀屑病組CD14+TIM-3+細(xì)胞比例（12.20% ± 2.83%）高于對照組（9.91% ± 1.77%），t= 3.27，P＜ 0.01。TLR 配體刺激后，與刺激前比較，CD14+TIM-3+細(xì)胞比例在銀屑病組（6.80% ± 1.11%）和對照組（4.85% ± 1.37%）均顯著降低（t=9.86 和12.17，均P＜ 0.01），但銀屑病組仍高于對照組（t=6.06，P＜ 0.01）。見圖1。

二、PBMC中CD14+單核細(xì)胞分泌IL-12的水平

在無TLR 配體刺激的狀態(tài)下，銀屑病組CD14+IL-12+細(xì)胞比例（0.80%±0.13%）和對照組（0.82%±0.19%）均較低，兩組比較，t= 0.453，P= 0.652。TLR 配體刺激后，與刺激前比較，CD14+IL-12+細(xì)胞比例在銀屑病組（13.49% ± 2.80%）和對照組（28.97% ± 8.97%）均增加（t=13.68 和t=30.99，均P＜ 0.01），但銀屑病組低于對照組（t= 10.71，P＜0.01）。見圖2。

三、CD14+單核細(xì)胞TIM-3表達(dá)與IL-12分泌呈負(fù)相關(guān)

LPS+R848刺激后兩組CD14+單核細(xì)胞TIM-3表達(dá)與IL-12 的分泌均呈顯著負(fù)相關(guān)，對照組r=-0.47，P=0.039；銀屑病組r=-0.37，P=0.010。見圖3。

四、封閉TIM-3通路對銀屑病患者CD14+單核細(xì)胞分泌IL-12的影響

圖1 對照組和銀屑病組外周血單個核細(xì)胞中CD14+TIM-3+比例 1A：兩組刺激前后CD14+單核細(xì)胞表達(dá)TIM-3 的流式散點(diǎn)圖；1B：兩組CD14+TIM-3+細(xì)胞比例比較。TIM-3：T 細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白3

圖2 對照組和銀屑病組外周血單個核細(xì)胞中CD14+單核細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素12（IL-12）水平比較 2A：兩組刺激前后CD14+單核細(xì)胞表達(dá)分泌IL-12 的流式散點(diǎn)圖；2B：兩組CD14+IL-12+細(xì)胞比例比較

使用抗TIM-3 抗體封閉TIM-3 通路可降低CD14+單核細(xì)胞 SOCS-1 的表達(dá)，IgG 對照組為0.54±0.12，抗TIM-3抗體組為0.08±0.02，t=7.14，P＜0.01；STAT-1磷酸化水平則顯著升高，IgG對照組為0.34±0.08，抗TIM-3抗體組為0.89±0.10，t=8.96，P＜ 0.01。見圖4A。

圖3 對照組和銀屑病組CD14+單核細(xì)胞T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白3（TIM-3）表達(dá)與白細(xì)胞介素12（IL-12）分泌的相關(guān)性分析 3A：對照組；3B：銀屑病組

圖4 抑制TIM-3對10例銀屑病患者CD14+單核細(xì)胞下游信號分子和IL-12分泌的影響 4A：SOCS-1、磷酸化STAT-1、總STAT-1的典型Western印跡檢測；4B：CD14+單核細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)及與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中的IL-12+細(xì)胞比例。TIM-3：T細(xì)胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白3；IL-12：白細(xì)胞介素12；SOCS-1：細(xì)胞因子信號抑制物1；STAT-1：信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1

取10 例銀屑病患者CD14+單核細(xì)胞，加入抗TIM-3 抗體或?qū)φ湛贵wIgG 培養(yǎng)，單獨(dú)培養(yǎng)或建立與角質(zhì)形成細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)。在CD14+單核細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)系統(tǒng)中，CD14+IL-12+細(xì)胞比例在抗TIM-3 抗體處理組（18.63% ± 4.36%）和IgG 處理組（15.33% ± 5.91%）間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t= 1.42，P=0.17，圖4B）；在CD14+單核細(xì)胞與自體角質(zhì)形成細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)中，抗TIM-3 處理組CD14+IL-12+細(xì)胞比例（35.02%±10.91%）則顯著高于IgG處理組（23.03% ± 8.55%），t= 2.73，P= 0.014，圖4B。共培養(yǎng)系統(tǒng)中，抗TIM-3 抗體組與對照組CD14+IL-12+細(xì)胞比例均顯著高于單獨(dú)培養(yǎng)系統(tǒng)組（t=4.41和2.34，P=0.0003和0.031，圖4B）。

討 論

TIM-3 作為一種T 細(xì)胞表面抑制性因子，主要抑制CD4+和CD8+T 細(xì)胞，降低促炎細(xì)胞因子的分泌，發(fā)揮免疫抑制功能［8］。在銀屑病患者中，活化Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞表面TIM-3表達(dá)顯著降低，后者使Th1 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞逃避了由TIM-3 介導(dǎo)的負(fù)性免疫調(diào)控，促進(jìn)銀屑病的發(fā)生發(fā)展［9］。而新近的研究亦發(fā)現(xiàn)，TIM-3還可調(diào)控單核巨噬細(xì)胞的功能活性。在胃癌［10］、自發(fā)性腦出血［11］、瘧疾［12］等疾病過程中，CD14+單核細(xì)胞中TIM-3 的表達(dá)均顯著升高，且與疾病進(jìn)程密切相關(guān)。在慢性乙型肝炎患者中，單核細(xì)胞的TIM-3高表達(dá)可增加促炎細(xì)胞因子的分泌和Th17 細(xì)胞的應(yīng)答，促進(jìn)機(jī)體炎癥應(yīng)答［13］。而在慢性丙型肝炎患者中，高表達(dá)TIM-3的單核細(xì)胞可通過抑制IL-12的分泌發(fā)揮負(fù)性調(diào)控免疫應(yīng)答的功能［5，14］。

本研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者CD14+單核細(xì)胞表面TIM-3的表達(dá)顯著高于對照組。但是，應(yīng)用TLR配體活化單核細(xì)胞后，無論在對照組還是銀屑病組，CD14+單核細(xì)胞表面TIM-3 的表達(dá)均降低，但銀屑病組中CD14+TIM-3+的比例仍高于對照組，這與在慢性丙型肝炎中的發(fā)現(xiàn)相一致［14］。更為重要的是，TLR配體可誘導(dǎo)CD14+單核細(xì)胞分泌IL-12，而銀屑病組單核細(xì)胞分泌IL-12 的水平較對照組顯著降低，且與TIM-3的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這提示在銀屑病中，無論在靜息還是活化狀態(tài)下，CD14+單核細(xì)胞中高表達(dá)的TIM-3都可能發(fā)揮負(fù)性免疫調(diào)控作用，通過降低IL-12 的分泌發(fā)揮抑制單核細(xì)胞功能的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞可誘導(dǎo)CD14+單核細(xì)胞表達(dá)IL-12，而封閉TIM-3通路可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞誘導(dǎo)的CD14+單核細(xì)胞分泌IL-12水平進(jìn)一步升高，但其中的分子機(jī)制尚未闡明。TIM-3 通路在不同疾病狀態(tài)下存在不同甚至完全相反的調(diào)控效應(yīng)。在慢性丙型肝炎患者中，TIM-3可與CD14+單核細(xì)胞中的SOCS-1相互作用，通過抑制STAT-1 的磷酸化發(fā)揮負(fù)性免疫調(diào)控作用，促進(jìn)感染慢性化［14］。相反，在腫瘤小鼠模型中，TIM-3可通過抑制STAT-1/miR-155 軸，上調(diào)SOCS-1 的表達(dá)，增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞M2 方向的極化［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，使用抗TIM-3 抗體封閉銀屑病患者CD14+單核細(xì)胞中的TIM-3 通路促進(jìn)STAT-1 的磷酸化，而SOCS-1 表達(dá)下降，這與在慢性丙型肝炎中的研究結(jié)果［14］相一致。基于倫理原因，本研究未納入正常人的角質(zhì)形成細(xì)胞，因此，TIM-3 對正常人角質(zhì)形成細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌的影響尚不清楚。但本研究結(jié)果仍提示TIM-3可直接調(diào)控CD14+單核細(xì)胞的功能，參與機(jī)體固有免疫應(yīng)答。

總之，在銀屑病患者皮損中，角質(zhì)形成細(xì)胞可誘導(dǎo)銀屑病CD14+單核細(xì)胞TIM-3 表達(dá)升高，從而負(fù)性調(diào)控CD14+單核細(xì)胞介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突