何畏 陳晴 黃濤 黃曉秋 吳桂輝

肺外結(jié)核在國(guó)際上定義為發(fā)生在肺實(shí)質(zhì)以外其他組織或器官的結(jié)核[1]，國(guó)內(nèi)2017年最新標(biāo)準(zhǔn)定義其為發(fā)生在肺組織、氣管、支氣管和胸膜以外器官的結(jié)核[2]。近年來(lái)，肺外結(jié)核在結(jié)核病中的占比越來(lái)越大[3-5]，2017年全球新發(fā)及復(fù)發(fā)肺外結(jié)核患者占新發(fā)肺結(jié)核患者數(shù)的14%[1]，且由于肺外結(jié)核診斷相對(duì)困難[6]，故更易漏診、延遲診斷及治療，導(dǎo)致死亡率升高。然而，目前肺外結(jié)核的發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis，PTB)不同[7]。既往研究報(bào)道，在結(jié)核病并發(fā)HIV感染的患者中，當(dāng)CD4低于100個(gè)/μl時(shí)，肺外結(jié)核的發(fā)生率更高，原因可能與T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答遭到破壞相關(guān)[8-9]；兒童可能因?yàn)槊庖呦到y(tǒng)未發(fā)育完善，更易發(fā)生肺外結(jié)核[10-11]。以上研究提示肺外結(jié)核的發(fā)病機(jī)制與T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答存在一定關(guān)聯(lián)。此外，25%的肺結(jié)核患者并發(fā)肺外結(jié)核[12]，在此類(lèi)患者中，免疫系統(tǒng)無(wú)法將結(jié)核分枝桿菌限制在肺內(nèi)而造成肺外播散，其中的機(jī)制也尚不明確[13]，故將肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核與單純肺結(jié)核患者進(jìn)行比較可能更有助于探索結(jié)核分枝桿菌肺外播散與免疫系統(tǒng)的關(guān)系。

本研究探討了單純肺結(jié)核、肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核及單純肺外結(jié)核患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞亞群及CD4+/CD8+比值的變化，嘗試尋找肺外結(jié)核與T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答之間的關(guān)聯(lián)，為了解肺外結(jié)核的發(fā)生機(jī)制提供一定理論依據(jù)。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象

1.一般情況：選取2017年11月至2019年1月在成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心結(jié)核病區(qū)住院的147例患者，其中包括63例肺結(jié)核，60例肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核患者和24例肺外結(jié)核患者，年齡范圍14～82歲，各組年齡、性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H值和χ2值分別為0.790和0.604，P值均>0.05)。在60例肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核患者中，最常見(jiàn)的是腹盆腔結(jié)核(48.3%)，其次是結(jié)核性心包炎(36.7%)、骨關(guān)節(jié)結(jié)核(13.3%)及結(jié)核性腦膜炎(13.3%)；在24例肺外結(jié)核患者中，腹盆腔結(jié)核仍最常見(jiàn)(50.0%)，其次為泌尿生殖結(jié)核(25.0%)及骨關(guān)節(jié)結(jié)核(25.0%)，具體見(jiàn)表1。

表1 147例肺結(jié)核、肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核、肺外結(jié)核患者的臨床特征

2.診斷標(biāo)準(zhǔn)：肺結(jié)核診斷參考2017年《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(肺結(jié)核診斷)》。本研究初治患者納入標(biāo)準(zhǔn)：從未因結(jié)核病應(yīng)用過(guò)抗結(jié)核藥物治療的患者；本研究復(fù)治患者納入標(biāo)準(zhǔn)：符合下列情況之一：因結(jié)核病不合理或不規(guī)則用抗結(jié)核藥物治療≥1個(gè)月的患者、初治失敗和首次復(fù)發(fā)患者。肺外結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)按照2017年《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(結(jié)核病分類(lèi))》定義，即結(jié)核病變發(fā)生在肺以外的器官和部位，如淋巴結(jié)(除外胸內(nèi)淋巴結(jié))、骨、關(guān)節(jié)、泌尿生殖系統(tǒng)、消化道系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等部位，肺外結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)。

3.排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)并發(fā)糖尿病、免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病、腫瘤、營(yíng)養(yǎng)不良以及服用免疫抑制藥物的患者；(2)HIV感染、病毒性肝炎患者；(3)其他肺內(nèi)及肺外感染、慢性阻塞性肺氣腫、哮喘、支氣管擴(kuò)張患者；(4)孕婦或哺乳期婦女；(5)痰培養(yǎng)結(jié)果為非結(jié)核分枝桿菌的患者。

4.分組：根據(jù)診斷將患者分為肺結(jié)核組、肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核組和肺外結(jié)核組。

二、方法

1.標(biāo)本采集：所有患者均于入院第二天清晨空腹時(shí)采集外周靜脈血1～3 ml于乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)抗凝管中，運(yùn)輸過(guò)程中保持溫度在20～25 ℃，24 h內(nèi)完成檢測(cè)。

2.試劑與儀器：流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼公司，Cytomics FC 500 MCL型號(hào))及配套的四色淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)試劑盒(美國(guó)貝克曼公司，CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5)。

3.檢測(cè)方法：用已知總數(shù)的熒光微球(Beads)作為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參加入血中，再加入相應(yīng)的熒光抗體，使用流式細(xì)胞儀中的獲取和分析軟件，計(jì)算出外周血T淋巴細(xì)胞亞群的絕對(duì)計(jì)數(shù)，即細(xì)胞(/μl)=(獲取細(xì)胞數(shù)×Beads總量)/Beads獲取數(shù)。具體操作步驟：吸取5 μl 四色試劑加入上樣管底部；準(zhǔn)確吸取50 μl均勻混合的抗凝全血加于試管底部；室溫(20～25 ℃)避光孵育15 min；加入500 μl的溶血素，室溫(20～25 ℃)避光孵育15 min；加入500 μl生理鹽水，室溫(20～25 ℃)避光孵育5 min，加入50 μl熒光微球充分混勻，2 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，采用流式細(xì)胞儀的CXP軟件，使用獲取軟件獲取樣本數(shù)據(jù)，運(yùn)行潛在語(yǔ)義分析(latent semantic analysis, LSA)算法進(jìn)行分析，可得出CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)及CD4+/CD8+比值(T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)的正常值范圍：CD3+：770～2041個(gè)/μl；CD4+：414～1123個(gè)/μl；CD8+：238～874個(gè)/μl)。

4.臨床資料收集方法：收集入選患者的人口學(xué)特征、治療史(初/復(fù)治)、肺外結(jié)核情況、外周血T淋巴細(xì)胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及CD4+/CD8+比值)檢測(cè)結(jié)果等，所有患者血液檢測(cè)結(jié)果均采用入院時(shí)首次檢查結(jié)果。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

肺結(jié)核、肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核、肺外結(jié)核患者T淋巴細(xì)胞亞群分布見(jiàn)表2。3組患者的CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核患者外周血CD3+、CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)低于肺結(jié)核患者(圖1)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.507，P=0.012；Z=-2.431，P=0.015)；肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核患者CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)及CD4+/CD8+比值也較肺結(jié)核患者降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.892,P=0.058;Z=-0.546,P=0.585)；肺外結(jié)核患者外周血CD3+、CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)低于肺結(jié)核患者(圖1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.089，P=0.037；Z=-2.460，P=0.014)。單純肺外結(jié)核患者外周血的CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)及CD4+/CD8+T細(xì)胞比值與單純肺結(jié)核患者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.315,P=0.188;Z=-1.429,P=0.153)。

討 論

結(jié)核病的發(fā)生與免疫系統(tǒng)應(yīng)答紊亂密切相關(guān)，在機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌時(shí)，機(jī)體的保護(hù)性免疫應(yīng)答以T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫為主。CD3分子可在所有成熟T細(xì)胞上表達(dá)，與T細(xì)胞受體(T cell recepter，TCR)形成TCR-CD3復(fù)合體，通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)TCR識(shí)別抗原所產(chǎn)生的活化信號(hào)激活T細(xì)胞。CD4和CD8主要表達(dá)于不同成熟T細(xì)胞，也可輔助TCR識(shí)別抗原及參與活化信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。其中，初始CD4+T細(xì)胞為輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)0細(xì)胞，可分化為T(mén)h1、Th2、Th9、Th17、Th22、Tfh等細(xì)胞，Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2等細(xì)胞因子，介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在結(jié)核分枝桿菌感染中起關(guān)鍵作用[14-16]；CD8+T細(xì)胞可產(chǎn)生CTL及分泌IFN-γ和TNF-α，在結(jié)核保護(hù)免疫應(yīng)答中也起到一定作用[17-18]。

表2 三組患者CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和CD4+/CD8+比值的分布情況

圖1 肺結(jié)核、肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核、肺外結(jié)核患者CD3+、CD4+、CD8+ T 淋巴細(xì)胞亞群和CD4+/CD8+比值的分布情況(PTB組：肺結(jié)核組；PTB并發(fā)EPTB組：肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核組；EPTB組：肺外結(jié)核組)

本研究發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核組、單純肺外結(jié)核組的CD8+T淋巴細(xì)胞與三組患者的CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均較正常值降低。肺外結(jié)核患者外周血CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞較肺結(jié)核患者更低，提示T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答可能與肺外結(jié)核的發(fā)生相關(guān)，本研究還觀察到CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和CD4+/CD8+比值的均數(shù)從肺結(jié)核到并發(fā)肺外結(jié)核再到肺外結(jié)核組呈遞減趨勢(shì)，同時(shí)未觀察到CD8+T淋巴細(xì)胞的明顯變化。國(guó)外多個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道，在肺結(jié)核并發(fā)HIV感染的患者中，CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)越低，肺外結(jié)核的發(fā)生率越高[8-9]；未感染HIV既往有肺外結(jié)核病史的患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞較有肺結(jié)核病史或結(jié)核分枝桿菌潛伏性感染者要低[19]，以上研究結(jié)論與本研究結(jié)果類(lèi)似。此外，有研究報(bào)道17例活動(dòng)性結(jié)核性葡萄膜炎患者的外周血CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Tregs)較18例因其他玻璃體視網(wǎng)膜疾病需進(jìn)行睫狀體玻璃體切除術(shù)的患者明顯降低[20]，提示CD4+Treg可能也與肺外結(jié)核發(fā)生相關(guān)；腎結(jié)核的患者外周血IFN-γ、TNF-α及IL-12較健康對(duì)照組低[21]，提示腎結(jié)核的發(fā)生可能與Th1介導(dǎo)的免疫應(yīng)答不足相關(guān)，以上研究結(jié)論與本研究結(jié)果也有一致性。還有研究比較了初治結(jié)核病患者的T淋巴細(xì)胞亞群，發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者的CD4+/CD8+比值高于肺外結(jié)核患者[22]，本研究也觀察到肺結(jié)核組CD4+/CD8+比值的均數(shù)高于肺外結(jié)核組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，未來(lái)可加大樣本量進(jìn)一步探索。然而，也有國(guó)內(nèi)研究未觀察到肺結(jié)核與肺外結(jié)核患者的外周血T淋巴細(xì)胞亞群百分比的差異[23-24]，原因可能與入組排除標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)定和檢測(cè)技術(shù)的差異相關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核患者外周血CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)較單純肺結(jié)核患者降低，提示在肺結(jié)核患者中，隨著外周血CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，結(jié)核分枝桿菌可能更易播散至肺外。一項(xiàng)動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)耗盡CD4+T淋巴細(xì)胞的獼猴在感染肺結(jié)核后容易出現(xiàn)極早期的胸外結(jié)核播散，且CD4+T淋巴細(xì)胞對(duì)維持CD8+T淋巴細(xì)胞的多種效應(yīng)功能至關(guān)重要[25]，提示CD4+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答在肺結(jié)核感染早期可能牽制肺外結(jié)核的播散，與本研究的結(jié)論一致，但具體作用機(jī)制尚不明確，仍待進(jìn)一步探討。研究還觀察到外周血CD8+T淋巴細(xì)胞及CD4+/CD8+比值的均值在初治肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核組中較初治肺結(jié)核組要低，提示CD8+T淋巴細(xì)胞的減少可能與初治肺結(jié)核患者出現(xiàn)結(jié)核肺外播散相關(guān)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，未來(lái)需加大樣本量繼續(xù)探討。

綜上所述，肺外結(jié)核的發(fā)生可能與T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答減少相關(guān)。外周血CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞可能與肺外結(jié)核的發(fā)生機(jī)制相關(guān)；隨著肺結(jié)核患者外周血CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的逐步降低，結(jié)核分枝桿菌可能更易播散至肺外；外周血CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及CD4+/CD8+比值在肺外結(jié)核發(fā)生機(jī)制中的作用尚待進(jìn)一步探討。在肺結(jié)核患者中，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群變化，及早進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)治療可能對(duì)減少肺外結(jié)核的發(fā)生有一定意義。但由于條件所限，本研究?jī)H進(jìn)行了細(xì)胞層面的分析，未涉及外周血及肺外結(jié)核病灶處的細(xì)胞因子相關(guān)研究，對(duì)分子機(jī)制的探討尚有不足，今后有待進(jìn)行大規(guī)模樣本研究對(duì)肺外結(jié)核的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行深層次的探討。