■韓 晴 李軍國(guó)，2 楊 瑩 王 興 郭麗麗 葛春雨 張嘉琦 李 俊，2*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京100081；2.農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100081；3.云南省獸藥飼料檢測(cè)所，云南昆明650201；4.青海省獸藥飼料監(jiān)察所，青海西寧810001）

2017 年我國(guó)大豆消費(fèi)量超過(guò)1.1 億噸，位居世界 首位[1]。大豆制品加工過(guò)程會(huì)產(chǎn)生大量的大豆加工副產(chǎn)物，如大豆皮[2]等。大豆皮約占整粒大豆總重的8%，主要由纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和果膠類(lèi)物質(zhì)組成，是重要的大豆加工副產(chǎn)物[3]。大豆皮由于其高能量和高纖維的特性，常作為反芻動(dòng)物的粗飼料[3]。然而，大豆皮中存在的抗?fàn)I養(yǎng)因子會(huì)阻礙動(dòng)物機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，影響動(dòng)物健康及生產(chǎn)性能，因此添加量受限[4]。目前，除作為粗飼料飼喂動(dòng)物外，絕大多數(shù)大豆皮會(huì)被當(dāng)作廢料直接棄掉，這種來(lái)源廣泛的大豆加工副產(chǎn)物并沒(méi)有得到充分的開(kāi)發(fā)利用。

大豆皮富含纖維素及其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[5]，其中的纖維素是很好的糖源，通過(guò)一定的提取工藝可以制備出具有優(yōu)良特性的多糖[6-7]。研究表明，多糖具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、降血脂、降血糖、抗衰老等功效[8-13]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于大豆皮多糖的研究主要集中在多糖的提取、改性和基本理化性質(zhì)的分析[14-16]，并沒(méi)有研究對(duì)不同分子量大豆皮多糖的結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)進(jìn)行對(duì)比分析。根據(jù)鮑素華等[17]對(duì)多糖結(jié)構(gòu)、分子量大小對(duì)其生物活性影響的研究可知，多糖分子量大小與其生物活性具有顯著的相關(guān)性。因此，對(duì)不同分子量大豆皮多糖基本結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的研究對(duì)于大豆皮多糖的針對(duì)性開(kāi)發(fā)利用是至關(guān)重要的。

本文以大豆皮為原料，通過(guò)將熱水浸提法得到的大豆皮多糖進(jìn)行膜分離得到不同分子量的大豆皮多糖。對(duì)大豆皮多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步鑒定，并對(duì)其功能性質(zhì)包括抗氧化性、乳化性和起泡性進(jìn)行分析研究，旨在為充分利用大豆加工副產(chǎn)物，更好地開(kāi)發(fā)和利用大豆皮中的多糖組分提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆皮山東藍(lán)山股份有限公司（粗蛋白質(zhì)15.1%、粗脂肪4.0%、總膳食纖維60.1%、水分6.4%），充分粉碎過(guò)40目篩后備用。

1,1-二苯基-2-苦味基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH），北京Coolaber有限公司提供；標(biāo)準(zhǔn)品葡聚糖Dextran系列（分子量分別為5 000、10 000、70 000、500 000、2 000 000 U），上海Pharmacia 有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PowerWave XS2 酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTex 公司；LC-15C高效液相色譜儀（配有島津RID-10A示差檢測(cè)器），日本島津公司；LGJ-12冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；CR22G高速離心機(jī)，日本Hitachi 公司；RE-2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮有限公司；Leica DM2500生物顯微鏡，德國(guó)萊卡公司；TENSOR 37傅里葉變換紅外光譜，德國(guó)Bruker 公司；5 kU 和1 000 kU超濾膜，天津膜天膜科技股份有限公司；BT00-100W蠕動(dòng)泵，保定蘭格恒流泵有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆皮多糖的提取

稱取大豆皮粉末500 g，加入20 倍體積蒸餾水，攪勻，室溫下浸泡攪拌14 h。鹽酸調(diào)節(jié)浸泡液pH 值至4.5，將浸泡好的樣品放入高壓滅菌鍋中，在120 ℃下提取2 h。過(guò)濾除去不溶物，將提取液減壓濃縮至原體積的20%，加入4 倍體積80%的乙醇溶液進(jìn)行醇沉，離心收集不溶物，冷凍干燥得到大豆皮多糖SHP。

1.3.2 大豆皮多糖分子量的測(cè)定

大豆皮多糖分子量測(cè)定采用高效凝膠滲透色譜法。色譜條件：TSK-gel G-5000PWXL 柱（7.8 mm×300 mm；MW 分離極限：7 000 kU; Tosoh），島津LC-15C高效液相色譜儀；流動(dòng)相：超純水，流速：0.6 ml/min，進(jìn)樣量：50 μl，柱溫：35 ℃。測(cè)定方法：取Dextran 對(duì)照品（分子量分別為5 000、10 000、70 000、500 000、2 000 000 U），超純水溶解，制成1 mg/ml 的對(duì)照品溶液，過(guò)濾后，在上述色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜峰保留時(shí)間（tR），以相對(duì)分子量的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，以tR為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品分別以超純水制成1 mg/ml的溶液，在同樣色譜條件下進(jìn)樣，記錄樣品保留時(shí)間，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品分子量。

1.3.3 不同分子量大豆皮多糖的分離

不同分子量大豆皮多糖的分離采用超濾法。根據(jù)大豆皮多糖的分子質(zhì)量，選用截留分子量為5 kU和1 000 kU的兩種超濾膜，控制超濾壓力為0.1 MPa，蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速為60 r/min，超濾速度為2 L/h。收集分離液，經(jīng)加熱蒸發(fā)濃縮后，冷凍干燥制得高分子量大豆皮多糖SHP-H和低分子量大豆皮多糖SHP-L。

1.3.4 大豆皮多糖紅外光譜的測(cè)定

稱取大豆皮多糖樣品1.5 mg，置于瑪瑙研缽中，按照1:50～100 的比例加入干燥的KBr 粉末，充分研磨混合，壓片后在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描，記錄中紅外光譜結(jié)果。

1.3.5 大豆皮多糖抗氧化性分析

1.3.5.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定[18]

精密稱取DPPH 粉末4.5 mg，用無(wú)水乙醇配制0.08 mol/l 的DPPH 溶液于棕色容量瓶中，避光保存，備用。將2.0 ml 不同濃度的大豆皮多糖樣品溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/ml）與3.0 ml的DPPH溶液混合，室溫避光反應(yīng)30 min。以蒸餾水為空白，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。以下列公式計(jì)算DPPH清除率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

DPPH清除能力（%）=[A0-（As-Ac）]/A0×100

式中：A0——2.0 ml蒸餾水+3.0 ml DPPH溶液吸光度;

As——2.0 ml樣品溶液+3.0 ml DPPH溶液吸光度;

Ac——2.0 ml樣品溶液+3.0 ml蒸餾水吸光度。

1.3.5.2 還原力的測(cè)定[19]

量取2.0 ml 不同濃度的大豆皮多糖樣品溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/ml），加入2.5 ml磷酸鹽緩沖液（0.2 M，pH值6.6）和2.5 ml 1%的鐵氰化鉀溶液，充分混合后于50 ℃水浴保溫20 min。隨后加入2.5 ml 10%的三氯乙酸溶液，混合液3 000 r/min離心10 min。準(zhǔn)確吸取上清液2.5 ml，加入2.5 ml 的蒸餾水和0.5 ml 0.1%的三氯化鐵溶液，以蒸餾水為空白，在700 nm處測(cè)吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5.3 清除羥自由基活性的測(cè)定[20]

將1.0 ml濃度為9.0 mmol/l的FeSO4溶液與1.0 ml濃度為10.0 mmol/l水楊酸-乙醇溶液充分混合，再分別加入1.0 ml不同濃度的大豆皮多糖溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/ml），加入2.0 ml蒸餾水及1.0 ml 6.0 mmol/l H2O2溶液，37 ℃水浴保溫10 min，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度?？瞻讓?duì)照組以相同體積蒸餾水替代樣品。以下列公式計(jì)算羥自由基清除率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

羥基自由基清除率（%）=[A0-(As-Ac)]/Ao×100；式中：A0——空白對(duì)照液吸光度值，只加入硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇、過(guò)氧化氫、不加入大豆皮多糖溶液的吸光度值；

As——加入硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇、過(guò)氧化氫、大豆多糖溶液的吸光度值；

Ac——加入硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇、大豆多糖溶液、不加過(guò)氧化氫引發(fā)反應(yīng)的吸光度值。

1.3.6 大豆皮多糖乳化性測(cè)定

1.3.6.1 乳化液的制備

乳化液由大豆皮多糖、大豆油和磷酸鹽緩沖溶液（10 mmol/l、pH值7.0）配制而成。向緩沖液中加入適量多糖，充分溶解后，緩慢倒入大豆油，加入0.4 g/l的疊氮化鈉作為防腐劑，用均質(zhì)機(jī)（10 000 r/min）均質(zhì)乳化3 min。最終乳化液中多糖含量為0.5%（m/V），大豆油含量3.5%（m/V）。

1.3.6.2 乳化活性的測(cè)定

乳化液形成后，用磷酸鹽緩沖溶液稀釋10 倍后在500 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，用相應(yīng)乳化液的吸光度值表示其乳化活性。

1.3.6.3 乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

將乳化液室溫放置22 h后，用磷酸鹽緩沖溶液稀釋10 倍，并在500 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值。以下列公式計(jì)算乳化穩(wěn)定性（ESI），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

ESI=1-(A1-A2)/A1

式中：A1——乳化液形成時(shí)的吸光度值；

A2——乳化液室溫放置22 h后的吸光度值。

1.3.6.4 乳化液微觀結(jié)構(gòu)觀察

制備好的乳化液用磷酸鹽緩沖液稀釋5倍后，取適量制備玻片，使用Leica DM2500 生物顯微鏡觀察液滴分布情況，采集圖像。

1.3.7 大豆皮多糖起泡性測(cè)定[21]

1.3.7.1 起泡性測(cè)定

準(zhǔn)確稱取2.000 g 多糖樣品溶于100 ml 蒸餾水中，調(diào)節(jié)溶液pH 值為7。測(cè)定溶液的初體積，勻漿機(jī)攪拌1 min，迅速轉(zhuǎn)移至500 ml量筒中，測(cè)定溶液和泡沫的總體積，起泡性用起泡率來(lái)表示。

起泡率(%)=（攪打后溶液和泡沫的總體積-溶液的初體積）/溶液的初體積×100

1.3.7.2 泡沫持久性

分別記錄攪拌停止10、30、60、90、120 min后泡沫和溶液的總體積，用穩(wěn)定系數(shù)衡量泡沫的持久性。

穩(wěn)定系數(shù)=一定時(shí)間段泡沫和溶液的總體積/溶液的初體積

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆皮多糖分子量測(cè)定

利用高效凝膠色譜測(cè)定SHP、SHP-L 及SHP-H的相對(duì)分子量分布，結(jié)果見(jiàn)圖1，根據(jù)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品得到回歸方程：lgMw=-0.326 3tR+9.512 2(R2=0.982)。根據(jù)保留時(shí)間計(jì)算出SHP 的相對(duì)分子量主要分布在8.6×104U和2.5×106U兩個(gè)部分。SHP-L的相對(duì)分子量分布在1.4×105U 左右，SHP-H 的相對(duì)分子量分布在2.3×106U 左右。試驗(yàn)結(jié)果表明，超濾法可以較好的將SHP不同的分子量組分進(jìn)行分離。

2.2 大豆皮多糖紅外光譜測(cè)定

SHP、SHP-L 及SHP-H 在3 500～800 cm-1范圍內(nèi)的FTIR圖譜如圖2所示。1 000～3 500 cm-1區(qū)域的FTIR光譜包括三種多糖組分中的主要化學(xué)官能團(tuán)，這段區(qū)域通常用于鑒定多糖[22]。3 400～3 500 cm-1之間的吸收峰來(lái)自羥基。2 800～3 000 cm-1和1 400～1 450 cm-1之間的吸收峰是由烷基引起的。1 000～1 200 cm-1之間的區(qū)域表明存在羧基。同時(shí)，F(xiàn)TIR圖譜表明SHP與SHP-H 在特征官能團(tuán)方面無(wú)顯著差異。SHP-L 與SHP 及SHP-H 相比出現(xiàn)了部分吸收峰的缺失。SHP及SHP-H在1 726 cm-1和1 743 cm-1處出現(xiàn)吸收峰帶，表明SHP和SHP-H存在糖醛酸[22]。而SHP-L和SHPH在868 cm-1均失去了吸收峰，表明經(jīng)過(guò)超濾分離后，兩種不同分子量組分失去了原始多糖的β構(gòu)型[23]。

2.3 大豆皮多糖抗氧化性分析

圖1 （A）SHP、（B）SHP-L和（C）SHP-H 在TSK-凝膠G-5000 PWXL柱上的凝膠過(guò)濾色譜

SHP、SHP-L及SHP-H抗氧化性分析結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3A 為SHP、SHP-L 及SHP-H 的DPPH 清 除 率 結(jié)果。清除穩(wěn)定的DPPH 自由基被廣泛用于評(píng)估天然化合物的抗氧化性[24]。由圖3A 可知，在指定濃度范圍內(nèi)，三者DPPH 自由基清除能力大小順序?yàn)镾HP＞SHP-L＞SHP-H，無(wú)論是高分子量大豆皮多糖還是低分子量大豆皮多糖均對(duì)DPPH自由基具有清除活性，尤其是低分子量大豆皮多糖SHP-L，該結(jié)果與前人研究結(jié)果吻合，即小分子量多糖的DPPH清除能力較強(qiáng)[25]。研究表明，DPPH 清除能力取決于良好的疏水性和在反應(yīng)介質(zhì)中良好的擴(kuò)散性[26]。本試驗(yàn)中，SHPL在溶解度方面要明顯好于SHP-H，可以很快溶解在反應(yīng)介質(zhì)中，這將有效提高SHP-L的DPPH自由基清除能力。此外，SHP的DPPH清除能力最強(qiáng)，可能與未分離的多酚和小分子色素有關(guān)。

SHP、SHP-L及SHP-H羥基自由基清除能力效果見(jiàn)圖3B。羥基自由基的化學(xué)性質(zhì)活潑，可損傷蛋白質(zhì)、核酸之類(lèi)等生物大分子[27]。由圖可知，SHP、SHPL 及SHP-H 三者中羥基自由基清除能力最強(qiáng)的為SHP-L，SHP及SHP-H的清除能力無(wú)較大差異。與前人結(jié)果相同，大豆皮多糖的羥基自由基清除能力會(huì)隨著多糖分子量的降低而增強(qiáng)[28]。這可能是因?yàn)镾HPH 的滲透能力相對(duì)較差，而SHP-L 水溶性強(qiáng)，滲透能力強(qiáng)，生物活性高。

圖2 SHP、SHP-H及SHP-L的FTIR圖譜

圖3C 為SHP、SHP-L 及SHP-H 還原力結(jié)果。物質(zhì)的還原能力與其抗氧化性有著明顯的相關(guān)性，還原力的高低可以間接反映抗氧化能力的強(qiáng)弱[29]。三者中，SHP-L 的還原力最強(qiáng)，在較低濃度時(shí)，SHP-H 的還原力要大于SHP，但隨著濃度的增大，SHP 的還原力逐漸增強(qiáng)超過(guò)SHP-H。

圖3 SHP、SHP-L及SHP-H抗氧化性結(jié)果

綜合DPPH清除率、羥基自由基清除率和還原力的結(jié)果可知，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，大豆皮多糖的抗氧化能力與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)增長(zhǎng)趨勢(shì)。此外，多糖的抗氧化能力與相對(duì)分子量有關(guān)，分子量越低抗氧化能力越強(qiáng)。

2.4 大豆皮多糖乳化性測(cè)定

圖4 SHP、SHP-L及SHP-H乳化活性及乳化穩(wěn)定性

SHP、SHP-L 及SHP-H 乳化性見(jiàn)圖4。在乳化活性方面，SHP-H 的乳化活性最強(qiáng)，SHP 次之，SHP-L的乳化活性較低。圖5 的乳化液滴分布情況也同樣顯示了SHP、SHP-L 及SHP-H 的乳化能力，由SHPH 制備的乳化液油滴分布較多也較均勻，SHP-L 制備的乳化液油滴分布不均勻，油滴形態(tài)大小不一。在乳化穩(wěn)定性方面，SHP 的乳化穩(wěn)定性最好，SHP-H次之，最差是SHP-L，但三者之間無(wú)較大差異。根據(jù)Li[30]，殼聚糖的乳化活性隨著相對(duì)分子量的增加而增加。因此，高分子量級(jí)的大豆皮多糖與低分子量相比具有更強(qiáng)的乳化性。多糖的乳化活性取決于多糖的組成和乳化液體的類(lèi)型[31]。因此，需要進(jìn)一步研究來(lái)解釋不同因素對(duì)大豆皮多糖乳化性的綜合影響。

圖5 SHP、SHP-L及SHP-H乳化液液滴分布

2.5 大豆皮多糖起泡性測(cè)定

一種具有較好起泡性能的物質(zhì)是很好的表面活性劑。多糖具有良好的溶解性、親水性、親油性和極性基團(tuán)，因此具有一定的起泡能力和泡沫穩(wěn)定能力。SHP、SHP-L及SHP-H的起泡性見(jiàn)圖6及圖7。由圖6可知，SHP 和SHP-H 的發(fā)泡率無(wú)差異，但要明顯好于SHPL。圖7顯示了SHP、SHP-L及SHP-H的泡沫穩(wěn)定性，由圖可知，SHP-H 具有較好的泡沫穩(wěn)定能力，其次是SHP，而SHP-L的泡沫穩(wěn)定能力最差。研究表明，隨著溶液黏度的增大，液膜的表面強(qiáng)度也增加，液膜排液速度降低，液膜強(qiáng)度更大，泡沫的穩(wěn)定性也越好[32]。計(jì)曉曼等[33]對(duì)普蘭多糖的黏度性質(zhì)的研究表明，相對(duì)分子量的增大會(huì)使多糖溶液的黏度增加，因此，本試驗(yàn)中，SHP-H溶液較高黏度可能有助于提高其泡沫穩(wěn)定性。

圖6 SHP、SHP-L及SHP-H發(fā)泡率

圖7 SHP、SHP-L及SHP-H泡沫穩(wěn)定性

3 結(jié)論

利用熱水浸提法和超濾法對(duì)大豆皮多糖進(jìn)行了提取和分離，得到大豆皮多糖SHP及不同分子量大豆皮多糖組分SHP-L 及SHP-H，并對(duì)三種不同分子量分布的多糖進(jìn)行了基本結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)的分析。HPLC 的結(jié)果表明，SHP 的相對(duì)分子量主要分布在8.6×104U及2.5×106U附近，SHP-L及SHP-H的相對(duì)分子量分別分布在1.4×105U 和2.3×106U 左右。FTIR 圖譜結(jié)果表明，SHP-H 與SHP 無(wú)特征官能團(tuán)上的差異，而SHP-L與多糖原液相比出現(xiàn)了部分吸收峰的缺失。抗氧化結(jié)果表明，三種多糖組分均具有抗氧化能力，小分子量的SHP-L抗氧化性最強(qiáng)。而乳化性和起泡性的結(jié)果表明，大分子量的SHP-H 具有比SHPL 及SHP 更好的乳化性和起泡性。本研究可為大豆皮多糖進(jìn)一步研究及開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

4 展望

大豆皮作為大豆加工過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間里并沒(méi)有得到充分利用。利用大豆皮提取大豆皮多糖可以有效的實(shí)現(xiàn)大豆加工副產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)再利用。研究適合我國(guó)國(guó)情的大豆皮多糖制品，不僅可以解決大豆皮引起的環(huán)境問(wèn)題和商業(yè)難題，還可以帶動(dòng)相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展。如果能對(duì)大豆皮多糖的利用和開(kāi)發(fā)進(jìn)行深入研究，將進(jìn)一步提升豆皮和大豆皮多糖的利用價(jià)值。