■劉玉梅 張家俊 吳 浪 胡美忠 郁建生

（銅仁職業(yè)技術學院中獸藥國家民委重點開放實驗室，貴州銅仁554300）

目前，工業(yè)化動物養(yǎng)殖為人們提供了大量廉價動物蛋白，與此同時也造成了嚴重的環(huán)境污染問題，抗生素通過食物鏈進入人體造成人體抗生素殘留問題以及耐藥菌產(chǎn)生等問題。因此，尋找一系列安全、高效且價格低廉的能夠在工業(yè)化動物養(yǎng)殖中替代抗生素的藥物就顯得越來越重要。黃酮類化合物是一類廣泛存在于種子、根、莖、葉等植物組織中的生物活性小分子化合物，有很強的藥理作用且毒副作用小。近年來，有研究者發(fā)現(xiàn)天然黃酮類化合物能顯著提高動物對糖、蛋白質(zhì)和脂肪的代謝，促進營養(yǎng)成分的轉化，增強機體蛋白質(zhì)的合成能力，進而使動物的生產(chǎn)性能提高[1-5]；因黃酮類化合物結構與雌二醇相似，其還具有一定的雌激素樣活性，能提高奶牛生長激素、催乳素及雌二醇水平[6]；此外黃酮類化合物還具有抗氧化[7]、免疫調(diào)節(jié)等[8]作用。

天然黃酮類化合物的產(chǎn)量、藥效與提取工藝都有很大的關系?，F(xiàn)階段，用于天然黃酮類化合物的提取方法主要有有機溶劑提取法、微波輔助提取法、二氧化碳超臨界提取法、超聲波輔助提取法、酶解法等。其中超聲波提取法在實驗室被廣為使用，其優(yōu)點在于設備要求低、提取時間短、操作簡便；酶解法也因可提高有效成分的提取率而受到越來越多的關注。香椿子是香椿的干燥成熟果實，一些研究者發(fā)現(xiàn)其含有豐富的黃酮類化合物[9-11]，且香椿黃酮具有抗氧化[12]、抑菌[13]、降糖[14-15]、降尿酸[16]等藥理作用。但將酶解結合超聲波對香椿子總黃酮進行提取的方法還未見報道。本文將超聲波技術與酶解技術相結合，應用單因素、正交試驗方法，為香椿子總黃酮的提取提供了一種高效的提取方法，以期為后續(xù)香椿子總黃酮在綠色飼料添加劑中的開發(fā)應用提供技術支撐，進而為安全、健康、可持續(xù)發(fā)展的工業(yè)化動物養(yǎng)殖做一定的貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 香椿子

香椿子采自銅仁市萬山區(qū)謝橋街道石竹村，60 ℃烘箱干燥2 h，粉碎后過60目篩，陰涼干燥處密閉保存待用。

1.1.2 主要試劑

蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，含有量大于98%)。無水乙醇、甲醇、石油醚、三氯化鋁、醋酸鈉、冰醋酸、鹽酸、氫氧化鈉為市售分析純；果膠酶(5×104U/g)購自南寧龐博生物工程有限公司；水為超純水。

1.1.3 主要儀器

TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；New human power Ⅰ純水儀(韓國Human公司)；CPA225D 型電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]；CP153型電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]；SB5200D型超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；雷磁PHS-25型pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；TDZ4-WS型臺式低速離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）；DHG-9030A型鼓風干燥箱( 上海慧泰儀器制造有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的繪制

精密稱取蘆丁對照品10 mg，置于50 ml 容量瓶中，以50%甲醇溶解，定容，充分振蕩混勻得0.2 mg/ml蘆丁標準溶液。用移液管分別精密移取0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 ml蘆丁標準溶液于50 ml容量瓶中，分別加入2 ml 0.5 mol/l AlCl3溶液，搖勻，靜置15 min，用pH值為5.8的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液定容，搖勻后超聲震蕩5 min，得6個濃度的蘆丁測定液。

取其中一個濃度的蘆丁測定液在TU-1901 型雙光束紫外可見分光光度計上進行光譜掃描，確定最大吸收波長。于最大吸收波長處依次測定6個濃度的蘆丁測定液的吸光度，用濃度校正法繪制蘆丁標準曲線。

1.2.2 香椿子總黃酮提取及含量測定

100 g粉碎過篩后的香椿子粉末置于1 000 ml平底燒瓶中，加入500 ml石油醚回流提取1 h，提取兩次，合并濾液后減壓濃縮得香椿子油脂。濾渣于通風櫥中揮干石油醚后60 ℃烘干，陰涼干燥處密閉保存?zhèn)溆谩?/p>

精密稱取石油醚脫脂后的香椿子粉末0.2 g，置于20 ml具塞玻璃管中，加入提取液（N ml），在設定條件下進行酶解提取。提取結束后用相應的乙醇溶液補足失重后將濾液轉移至10 ml離心管中4 000 r/min離心10 min，上清液用移液器轉移到離心管中備用。移取1 ml 濾液，加入2 ml 0.5 mol/l AlCl3溶液，搖勻，靜置15 min，用pH 值為5.8 的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液定容至10 ml，搖勻后超聲震蕩5 min，在416 nm 處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算該溶液中總黃酮濃度C(mg/ml)。最終計算香椿子總黃酮含有量，公式為：總黃酮含量=(C×N×10)/0.2（mg/g）。

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 酶解pH值

精密稱取5份石油醚脫脂后的香椿子粉末0.2 g，分別置20 ml具塞玻璃管中，編號后加入含果膠酶（果膠酶濃度為每100 ml乙醇溶液0.5 g果膠酶）的75% 乙醇溶液10 ml，用HCl和NaOH將pH值分別調(diào)至2.5、3.5、4.5、5.5、6.5，在50 ℃下超聲提取20 min。按1.2.2節(jié)方法處理樣品并測定吸光度，計算香椿子總黃酮的含量。

1.2.3.2 酶解溫度

精密稱取5份石油醚脫脂后的香椿子粉末0.2 g，分別置20 ml具塞玻璃管中，編號后加入含果膠酶（果膠酶濃度為每100 ml 乙醇溶液0.5 g 果膠酶）的75%乙醇溶液10 ml，pH值調(diào)至3.5，分別在35、40、45、50 、55 ℃下超聲提取20 min。按1.2.2節(jié)方法處理樣品并測定吸光度，計算香椿子總黃酮的含量。

1.2.3.3 酶解時間

精密稱取5份石油醚脫脂后的香椿子粉末0.2 g，分別置20 ml具塞玻璃管中，編號后加入含果膠酶（果膠酶濃度為每100 ml 乙醇溶液0.5 g 果膠酶）的75%乙醇溶液10 ml，pH值調(diào)至3.5，在50 ℃下分別超聲提取10、20、30、40、50 min。按1.2.2 節(jié)方法處理樣品并測定吸光度，計算香椿子總黃酮的含量。

1.2.3.4 乙醇濃度

精密稱取5份石油醚脫脂后的香椿子粉末0.2 g，分別置20 ml具塞玻璃管中，編號后分別加入含果膠酶（果膠酶濃度為每100 ml乙醇溶液0.5 g果膠酶）的乙醇溶液10 ml（乙醇濃度分別為55%、65%、75%、85%、95%），pH值調(diào)至3.5，在50 ℃下超聲提取20 min。按1.2.2節(jié)方法處理樣品并測定吸光度，計算香椿子總黃酮的含量。

1.2.3.5 液料比

精密稱取5份石油醚脫脂后的香椿子粉末0.2 g，分別置20 ml 具塞玻璃管中，編號后分別加入含果膠酶（果膠酶濃度為每100 ml 乙醇溶液0.5 g 果膠酶，記為0.50%）的75%乙醇溶液10 ml（液料比50:1）、8 ml（液料比40:1）、6 ml（液料比30:1）、4 ml（液料比20:1）、2 ml（液料比10:1），pH 值調(diào)至3.5，在50 ℃下超聲提取20 min。按1.2.2節(jié)方法處理樣品并測定吸光度，計算香椿子總黃酮的含量。

1.2.3.6 酶用量

精密稱取5份石油醚脫脂后的香椿子粉末0.2 g，分別置20 ml 具塞玻璃管中，編號后分別加入含果膠酶（0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%）的75%乙醇溶液10 ml。pH 值調(diào)至3.5，在50 ℃下超聲提取20 min。按1.2.2節(jié)方法處理樣品并測定吸光度，計算香椿子總黃酮的含量。

1.2.4 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選用酶用量(A)、乙醇濃度(B)、液料比(C)、酶解時間（D）進行正交試驗，正交因素水平見表1。稱取脫脂后的樣品0.2 g，共9份，以總黃酮含量為評價指標，優(yōu)化提取工藝。

表1 正交試驗因素水平

1.2.5 驗證試驗

精密稱取石油醚脫脂后香椿子粉末6 份，每份0.2 g，其中3份按優(yōu)選的工藝進行酶解提?。涣?份不加酶直接提取，分別測定總黃酮提取率。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

黃酮類化合物經(jīng)AlCl3顯色后，與鋁離子形成穩(wěn)定的絡合物，苯甲?；糠忠鸬奈諑?300～400 nm)紅移，吸光度明顯增大且專屬性提高[17]。蘆丁經(jīng)AlCl3顯色后，其365 nm 處吸收峰紅移至416 nm，且吸光度有所增加，見圖1。

圖1 蘆丁顯色前、后紫外可見光譜

在最大吸收波長416 nm 處，按照1.2.1 節(jié)方法繪制蘆丁標準曲線，為C=31.7A-1.05，R=0.999 9，在2.0～20.0 μg/ml范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2 酶解提取方法

2.2.1 單因素試驗結果

酶只有在特定的pH 值、溫度下才能達到最大的活性，果膠酶的作用pH 值為2.5～6.0，作用溫度為15～55 ℃。在香椿子總黃酮的酶解提取試驗中，最佳酶解pH 值為3.5，最佳作用溫度為50 ℃，見圖2A、2B。后續(xù)試驗中，為達到最佳的提取效果，我們將pH值調(diào)至3.5，溫度控制在50 ℃。

酶解時間對總黃酮提取率的影響見圖2C，從圖2C可以看出，當酶解時間延長至20 min 以后，香椿子中總黃酮提取率沒有明顯變化，說明20 min 時酶解反應已基本完成。故選10、20、30 min進行正交試驗。

提取液中乙醇濃度對香椿子總黃酮提取率的影響見圖2D，從圖2D 可以明顯看出，乙醇濃度對香椿子總黃酮提取率的影響非常大，隨著乙醇濃度的增加，總黃酮提取率逐漸增加，當乙醇濃度達到75%以后，提取率的增加速度明顯變緩。故選取65%、75%、85%乙醇進行正交試驗。

液料比對提取率的影響見圖2E，從圖2E 可以看出，隨著液料比的增加，提取率逐漸增加，當液料比達到40:1以后，提取率的增加已經(jīng)不明顯了。因此選液料比30:1，40:1，50:1進行正交試驗。

圖2 單因素試驗結果

酶用量對總黃酮提取率的影響見圖2F，酶的加入，使植物中的細胞壁被破壞，其中果膠等高分子化合物被分解為小分子物質(zhì)，有效減小黃酮等小分子化合物的溶出阻力，以達到提高總黃酮的提取率的效果。因此酶的用量對總黃酮的提取率的影響非常關鍵。從圖2F可以看出，隨著酶用量的增大，香椿子總黃酮提取率逐漸升高，當用量達到1.00% 時，香椿子總黃酮提取率出現(xiàn)峰值，隨后隨著酶用量的增大總黃酮提取率略有下降，可能原因是當酶過量時，香椿子粉末將會被大量的酶包裹，導致提取不徹底。所以我們選用酶用量為0.75%、1.00%、1.25%進行正交試驗。

2.2.2 正交試驗結果

根據(jù)單因素試驗結果，采用正交試驗設計對最佳酶解工藝進行優(yōu)化，結果見表2。各因素對香椿子總黃酮提取率的影響順序為B＞D＞A＞C，即乙醇濃度＞酶解時間＞酶用量＞液料比。乙醇濃度對提取率的影響最大，其次是酶解時間，酶濃度及液料比，最佳酶解提取工藝為A3B3C2D3，即酶用量1.25%，乙醇濃度85%，液料比40:1，酶解時間30 min。

表2 正交試驗結果

2.2.3 驗證試驗結果

按照最佳工藝條件A3B3C2D3進行重復性試驗3次，香椿子總黃酮的平均提取率為26.41 mg/g，RSD為0.27%，說明該提取工藝穩(wěn)定。為比較酶解輔助提取的優(yōu)勢，按照不加酶的最佳提取條進行重復性試驗3次，香椿子總黃酮的平均提取率為22.39 mg/g，RSD為0.61%。酶解法與未經(jīng)酶解法相比，總黃酮的提取率提升了17.95%。

3 討論與結果

近年來，酶解法在提高植物有效成分的提取率方面的研究、應用越來越多[18-21]。其主要原因是酶能使植物體內(nèi)大分子化合物如果膠、纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)等分解為小分子，從而減小其對植物體內(nèi)生物小分子化合物的束縛力，進而提高植物有效成分的提取率。不同的植物、植物部位以及不同的目標化合物所需要的酶是不同的，本實驗考察了果膠酶、纖維素酶及果膠酶與纖維素酶的復合酶對香椿子總黃酮提取率的影響，發(fā)現(xiàn)果膠酶能使香椿子總黃酮的提取率達到最大，所以我們選擇果膠酶對香椿子進行酶解。

本試驗探討了果膠酶酶解協(xié)同超聲提取香椿子中總黃酮的工藝條件，采用單因素試驗和正交試驗考察了酶解時間、乙醇濃度、液料比、酶用量等因素對提取率的影響，同時通過驗證試驗對最佳工藝進行分析。研究結果表明在果膠酶的最佳作用pH 值（3.5）和最佳作用溫度（50 ℃）下，香椿子總黃酮果膠酶協(xié)同超聲波法的最佳提取條件為：酶用量1.25%，乙醇濃度85%，液料比40:1，酶解時間30 min，在此條件下，香椿子總黃酮提取率為26.41 mg/g，與同等條件下不加酶提取相比，總黃酮的提取率提升了17.95%。說明該提取方法具有顯著的優(yōu)勢，為進一步開展香椿子總黃酮的應用研究奠定了基礎。