張輝果， 董志巧， 王曉利， 陳團(tuán)營， 田新磊

（河南省中醫(yī)院兒科，河南 鄭州450009）

肺炎鏈球菌Streptococcus pneumoniae 是引起兒童社區(qū)獲得性肺炎最常見主要的細(xì)菌病原體［1-3］，以往臨床治療以抗生素為主，但隨著耐大環(huán)內(nèi)酯類、萬古霉素類細(xì)菌的出現(xiàn)［4］，給治療帶來了嚴(yán)峻考驗(yàn)。麻杏石甘湯是《傷寒論》 經(jīng)典方劑［5］，由麻黃（去節(jié)） 四兩（9 g）、杏仁（去皮尖） 五十個(gè)（9 g）、甘草（灸） 二兩（6 g）、石膏（碎、綿裹） 半斤（18 g） 組成，加減結(jié)合中醫(yī)定向透藥治療小兒支氣管肺炎療效顯著，能顯著改善肺炎喘嗽風(fēng)熱犯肺證患兒臨床癥狀，優(yōu)于阿奇霉素與利巴韋林聯(lián)合治療［6］，但尚無對(duì)其作用機(jī)制的研究。近年來研究發(fā)現(xiàn)，凋亡蛋白與肺炎小鼠肺組織炎癥、肺泡壁增厚、肺泡上皮細(xì)胞破壞、細(xì)胞浸潤等特征的變化密切相關(guān)［7-9］，故本實(shí)驗(yàn)考察不含麻黃、杏仁、石膏、甘草的麻杏石甘湯拆方及其全方對(duì)肺炎鏈球菌致肺炎小鼠Bax、Bcl-2、caspase-3 凋亡蛋白表達(dá)的影響，研究該方作用機(jī)制，并初步考證其在治療肺炎鏈球菌D39 感染所致肺炎方面的臨床配伍是否科學(xué)合理。

1 材料

1.1 試藥 麻黃、杏仁、甘草、石膏均由河南省中醫(yī)院門診中藥房提供，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室董成明教授鑒定為正品。肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株（D39）購于中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，經(jīng)血平板培養(yǎng)18 h 后用無菌生理鹽水稀釋至6×108CFU／mL（2 麥?zhǔn)蠁挝唬?。頭孢羥氨芐片（清遠(yuǎn)華能制藥有限公司，250 mg／片，國藥準(zhǔn)字H44023670，批號(hào)171003）。兔抗小鼠Bcl-2 多抗（批號(hào)196542）、兔抗小鼠caspase-3 單抗（批號(hào)ZP4126BP26）、兔免疫球蛋白（IgG） -免疫組化試劑盒 （批號(hào)12I09 A）、兔抗小鼠Bax 單抗（批號(hào)13CM395 A）、BCA蛋白定量試劑盒、DAB 試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動(dòng)物 昆明種無特定病原體級(jí)（SPF） 健康小鼠320 只，雌雄各半，5 ～6 周齡， 體質(zhì)量18 ～22 g，購于河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （豫） 2010-0001， 動(dòng) 物 質(zhì) 量 合 格 證 號(hào)41003100001519。動(dòng)物飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心， 使用許可證編號(hào)SYXK （豫） 2010-0001，溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，自由攝食進(jìn)水。

1.3 儀器 SW-CJ-1F 超凈工作臺(tái)（鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司）；Ion GeneStudio S5 Series DNA 測(cè)序儀、低溫高速離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；DU-600 蛋白-核酸分析儀（美國Bechman 公司）； ABI 2720 型PCR 儀 （美國ABI 公司）；H-600 電子顯微鏡、H-7650 透射電鏡（日本日立公司）；IX83 倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；UC7 超薄切片（德國Leica 公司）；LCⅡ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 儀（美國羅氏公司）；iMark 酶標(biāo)儀、Experion 電泳儀、全自動(dòng)凝膠分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 供試品制備

2.1.1 全方提取物 按麻杏石甘湯全方組成比例（麻黃9 g、杏仁9 g、石膏18 g、甘草6 g） 混合藥材，粉碎，過20 目篩，取210 g（5 倍處方量），8倍量蒸餾水回流提取2 次，每次3 h，濾過，合并濾液，50 ℃下減壓濃縮，干燥，即得，蒸餾水配制成生藥量1 g／mL 的溶液。提取物稱定質(zhì)量，計(jì)算出膏率，HPLC 法測(cè)定麻黃堿、苦杏仁苷、甘草酸含有量，化學(xué)滴定法測(cè)定Ca2＋含有量。

2.1.2 拆方提取物 按杏仁9 g、石膏18 g、甘草6 g 的比例混合，粉碎，過20 目篩，取165 g（5倍拆方量），按“2.1.1” 項(xiàng)下方法處理，作為拆方Ⅰ；按麻黃9 g、石膏18 g、甘草6 g 的比例混合，粉碎，過20 目篩，取165 g（5 倍拆方量），按“2.1.1” 項(xiàng)下方法處理，作為拆方Ⅱ；按麻黃9 g、杏仁9 g、甘草6 g 的比例混合，粉碎，過20目篩，取120 g（5 倍拆方量），按“2.1.1” 項(xiàng)下方法處理，作為拆方Ⅲ；按麻黃9 g、杏仁9 g、石膏18 g 的比例混合，粉碎，過20 目篩，取180 g（5 倍拆方量），按“2.1.1” 項(xiàng)下方法處理，作為拆方Ⅳ。蒸餾水配制成生藥量1 g／mL 的溶液。

2.2 分組、造模及給藥 320 只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成正常對(duì)照組、陽性對(duì)照組、模型組及麻杏石甘湯全方組、拆方Ⅰ組、拆方Ⅱ組、拆方Ⅲ組、拆方Ⅳ組，每組40 只。除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠均在乙醚輕度麻醉下鼻內(nèi)接種6×108CFU／mL肺炎鏈球菌D39 標(biāo)準(zhǔn)菌株溶液，每只0.1 mL，接種后呈45°保持30 s 以利于溶液充分吸入，連續(xù)接種3 d；正常對(duì)照組小鼠與其他組隔離飼養(yǎng)在同等條件下的房間，接種等量生理鹽水。接種后，觀察各組小鼠大便、體質(zhì)量、活動(dòng)度、進(jìn)食等情況。

滴鼻造模1 h 后開始給藥，根據(jù)小鼠體質(zhì)量按成人1 d 劑量折算，麻杏石甘湯全方組為5.5 g／kg，拆方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組分別為4.71、3.14、4.32、4.32 g／kg。肺炎鏈球菌感染后1 h，麻杏石甘湯全方組小鼠按臨床等效劑量的3 倍（16.5 g／kg） 灌胃 給 藥， 拆 方Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ、 Ⅳ組 小 鼠 分 別 按14.14、9.43、12.96、12.96 g／kg 劑量灌胃，每天2次；正常對(duì)照組、模型組小鼠灌胃給予等劑量生理鹽水，每天2 次，連續(xù)14 d；陽性對(duì)照組小鼠灌胃給予頭孢羥氨芐片藥液（10 mg／mL）0.15 g／kg，每天1 次，連續(xù)3 d，之后停藥4 d，2 個(gè)循環(huán)，停藥期間灌胃給予等量蒸餾水。

2.3 組織樣本采集 于給藥后的第3、7、11、14天采集（最后1 次給藥后先禁水禁食4 h，再采集）。各組隨機(jī)取10 只小鼠，雌雄各半，脫頸椎處死，取出肺臟，4%多聚甲醛固定左肺，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度5 μm，備用；右肺保存于-80 ℃冰箱中，備用。

2.4 小鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)觀察 取各組小鼠給藥第3、7、11、14 天采集的右肺樣本，取其上葉組織，2.5%戊二醛預(yù)固定，1%鋨酸固定，環(huán)氧樹脂浸透和包埋，切片，乙酸雙氧鈾、枸櫞酸鉛雙層染色，透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)變化。

2.5 小鼠肺組織Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達(dá)檢測(cè) 取“2.3” 項(xiàng)下小鼠肺組織石蠟切片，免疫組化法檢測(cè)Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達(dá)，分別滴加相應(yīng)一抗（1 ∶500、1 ∶300、1 ∶500），以PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照，DAB 染色液顯色，測(cè)定平均吸光度，進(jìn)行半定量分析。

然后，Western blot 法繼續(xù)檢測(cè)三者蛋白表達(dá)。稱取“2.3” 項(xiàng)下各組小鼠肺組織，提取總蛋白，BCA 試劑盒進(jìn)行定量。各取25 μg，電泳分離，半干電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%奶粉液封閉2 h，加入相應(yīng)一抗（稀釋倍數(shù)同免疫組化法），4 ℃冰箱中放置過夜，再加入相應(yīng)二抗（1 ∶5 000） 孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯色。以GAPDH 為內(nèi)參，Quantity One軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量分析，計(jì)算各組樣品目的蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH 條帶灰度的比值，作為相對(duì)表達(dá)量。

2.6 小鼠肺組織Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 實(shí)時(shí)定量PCR 法檢測(cè)Bax、 Bcl-2、caspase-3 mRNA 表達(dá)，所用引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。取各組小鼠肺組織，制成細(xì)胞懸液，提取RNA，分析其純度及完整性，質(zhì)量合格后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以其產(chǎn)物為模板，分別加入相應(yīng)引物，以GAPHD 為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢 測(cè)。 引 物 序 列： Bax 正 向 5′-GTGAGGATAGACGTCACACAG-3′， 反 向 5′-TATAGAGAGTGAAGTGGCACGAG-3′； Bcl-2 正 向 5′-CAGTCCTCACGCATCTCTAC-3′， 反 向 5′-AGCTCAGTCACTCTCGCGATA-3′； caspase-3 正 向5′-TCTCTAGACGTACGGGCGTGG-3′， 反 向 5′-AGAGACCGGCGGTAGAATGC-3′。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 17.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（） 表示，組間差異比較采用單因素方差分析，各時(shí)間點(diǎn)差異比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠肺臟超微結(jié)構(gòu) 圖1 顯示，正常對(duì)照組小鼠肺泡壁完整，游離面可見少量微絨毛，細(xì)胞胞質(zhì)均勻，核膜完整；模型組小鼠細(xì)胞膜膨出，異染色體凝聚在膨出的細(xì)胞膜周邊，Ⅱ型肺泡細(xì)胞突起膨大，出現(xiàn)凋亡特征；麻杏石甘湯全方組小鼠Ⅱ型肺泡細(xì)胞形態(tài)較正常，細(xì)胞板層小體增多，異質(zhì)染色體聚集，肺泡細(xì)胞表面有微絨毛存在，可見脫落，間質(zhì)內(nèi)可見膠原纖維少許；拆方Ⅰ組小鼠Ⅱ型肺泡細(xì)胞減少，細(xì)胞核凸起，細(xì)胞核內(nèi)異質(zhì)染色體聚集為粗塊，細(xì)胞表面有少許微絨毛存在，血管腫脹，可見細(xì)胞間堆積質(zhì)膠原纖維；拆方Ⅱ組小鼠Ⅱ型肺泡細(xì)胞減少，細(xì)胞核形狀規(guī)則，染色質(zhì)聚集，板層小體數(shù)量減少，肺泡之間間隔較小，有少許細(xì)胞微絨毛存在，有大量的血管腫脹可見；拆方Ⅲ組小鼠Ⅱ型肺泡細(xì)胞減少較多，細(xì)胞核凸起嚴(yán)重，染色質(zhì)聚集成塊，板層小體數(shù)量減少較多，肺泡之間有一定間隔，有微量細(xì)胞微絨毛存在，血管腫脹清晰可見；拆方Ⅳ組小鼠Ⅱ型肺泡細(xì)胞急劇減少，細(xì)胞核凸起變形，染色質(zhì)聚集成團(tuán)塊，板層小體數(shù)量大量減少，肺泡之間間隔較大，細(xì)胞微絨毛不易察覺，血管腫脹嚴(yán)重；陽性對(duì)照組小鼠Ⅱ型肺泡細(xì)胞有所增多，細(xì)胞核及其核仁外形均完整，Ⅱ型肺泡細(xì)胞內(nèi)板層小體的形態(tài)規(guī)整，細(xì)胞游離面微絨毛較豐富，細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)有膠原纖維可見。

圖1 各組小鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)變化Fig.1 Ultrastructure changes of mouse lung tissues in various groups

3.2 Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達(dá) 首先，采用免疫組化法進(jìn)行檢測(cè)。表1 顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達(dá)極顯著升高（P＜0.01），在不同時(shí)間點(diǎn)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，麻杏石甘湯全方組第3 天三者蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），第7天Bax、 Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著降低 （P ＜0.05），caspase-3 蛋白表達(dá)極顯著降低（P＜0.01），第11、14 天三者蛋白表達(dá)極顯著降低（P＜0.01）；拆方Ⅰ組各時(shí)間點(diǎn)三者蛋白表達(dá)無顯著差異 （P ＞0.05）；拆方Ⅱ組第7、11、14 天Bax 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），第14 天Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），第11、14 天caspase-3 蛋白表達(dá)顯著降低 （P ＜0.05）； 拆方Ⅲ組各時(shí)間點(diǎn)Bax、caspase-3 蛋白表達(dá)無顯著差異（P＞0.05），第7、11、14 天Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；拆方Ⅳ組各時(shí)間點(diǎn)Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），第11、14 天caspase-3 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

表1 各組Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達(dá)比較（免疫組化，n＝10）Tab.1 Comparison of Bax，Bcl-2 and caspase-3 protein expressions among various groups（immunohistochemistry，，n＝10）

表1 各組Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達(dá)比較（免疫組化，n＝10）Tab.1 Comparison of Bax，Bcl-2 and caspase-3 protein expressions among various groups（immunohistochemistry，，n＝10）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與麻杏石甘湯全方組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1） 時(shí)間 Bax Bcl-2 Caspase-3正常對(duì)照組 — 第3 天 0.163±0.003 0.178±0.004 0.174±0.001第7 天 0.165±0.004 0.177±0.003 0.175±0.002第11 天 0.164±0.003 0.178±0.004 0.174±0.001第14 天 0.167±0.004 0.176±0.003 0.174±0.002模型組 — 第3 天 0.196±0.005** 0.204±0.003** 0.199±0.002**第7 天 0.197±0.006** 0.202±0.003** 0.198±0.001**第11 天 0.195±0.005** 0.203±0.002** 0.199±0.002**第14 天 0.194±0.004** 0.202±0.002** 0.199±0.001**麻杏石甘湯全方組 16.5 第3 天 0.184±0.003△ 0.185±0.002△ 0.186±0.002△第7 天 0.181±0.004△ 0.184±0.002△ 0.175±0.001△△第11 天 0.175±0.003△△ 0.175±0.003△△ 0.176±0.002△△第14 天 0.175±0.004△△ 0.174±0.002△△ 0.175±0.001△△麻杏石甘湯拆方Ⅰ組 14.14 第3 天 0.192±0.006＃ 0.201±0.002＃＃ 0.197±0.002第7 天 0.191±0.005＃ 0.201±0.001＃＃ 0.196±0.003＃第11 天 0.191±0.005＃＃ 0.199±0.002＃＃ 0.196±0.002＃＃第14 天 0.190±0.006＃＃ 0.198±0.001＃＃ 0.195±0.003＃＃麻杏石甘湯拆方Ⅱ組 9.43 第3 天 0.186±0.003 0.196±0.001＃ 0.193±0.002＃第7 天 0.185±0.004△ 0.195±0.001＃ 0.190±0.001＃＃第11 天 0.184±0.005△＃ 0.193±0.001＃＃ 0.183±0.003△＃第14 天 0.185±0.003△＃ 0.192±0.000△＃＃ 0.181±0.001△＃麻杏石甘湯拆方Ⅲ組 12.96 第3 天 0.188±0.005 0.194±0.002＃ 0.194±0.002＃第7 天 0.187±0.004 0.191±0.001△＃ 0.191±0.001＃＃第11 天 0.187±0.005＃ 0.187±0.001△＃ 0.189±0.003＃＃第14 天 0.186±0.004＃ 0.188±0.002△＃ 0.190±0.002＃＃麻杏石甘湯拆方Ⅳ組 12.96 第3 天 0.184±0.005△ 0.190±0.002△＃ 0.191±0.001＃第7 天 0.182±0.004△ 0.192±0.001△＃ 0.190±0.002＃＃第11 天 0.178±0.003△ 0.187±0.001△＃ 0.185±0.001△＃第14 天 0.178±0.004△ 0.186±0.001△＃ 0.182±0.002△＃陽性對(duì)照組 0.15 第3 天 0.185±0.003△ 0.188±0.002△ 0.183±0.002△第7 天 0.169±0.004△△＃ 0.179±0.001△△ 0.177±0.001△△第11 天 0.168±0.003△△＃ 0.176±0.002△△ 0.176±0.003△△第14 天 0.168±0.003△△＃ 0.176±0.001△△ 0.176±0.002△△

然后，采用Western blot 法進(jìn)行檢測(cè)第7 天肺組織蛋白表達(dá)。表2 顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達(dá)極顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，麻杏石甘湯全方組三者蛋白表達(dá)極顯著降低（P＜0.01），拆方Ⅱ組、Ⅳ組三者蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），拆方Ⅲ組Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。與全方組比較，拆方Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組Bax、caspase-3蛋白表達(dá)極顯著升高（P＜0.01）；Ⅲ組、Ⅳ組Bcl-2 蛋白表達(dá)極顯著升高（P＜0.01），而Ⅰ組、Ⅱ組其蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。

表2 各組Bax、Bcl-2、caspase-3、Bcl-2／Bax 蛋白表達(dá)比較（Western blot，，n＝10）Tab.2 Comparison of Bax，Bcl-2，caspase-3 and Bcl-2／Bax protein expressions among various groups（Western blot，n＝10）

表2 各組Bax、Bcl-2、caspase-3、Bcl-2／Bax 蛋白表達(dá)比較（Western blot，，n＝10）Tab.2 Comparison of Bax，Bcl-2，caspase-3 and Bcl-2／Bax protein expressions among various groups（Western blot，n＝10）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與麻杏石甘湯全方組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1） Bax Bcl-2 caspase-3 Bcl-2／Bax正常對(duì)照組 — 0.61±0.04 0.76±0.05 0.68±0.04 1.25±0.06模型組 — 1.21±0.06** 1.03±0.07** 1.19±0.05** 0.85±0.04**麻杏石甘湯全方組 16.5 0.57±0.04△△ 0.75±0.06△△ 0.62±0.05△△ 1.32±0.06△△麻杏石甘湯拆方Ⅰ組 14.14 1.16±0.05＃＃ 0.94±0.06＃ 1.13±0.04＃＃ 0.81±0.05＃＃麻杏石甘湯拆方Ⅱ組 9.43 1.03±0.04△＃＃ 0.86±0.05△＃ 0.91±0.05△＃＃ 0.83±0.05＃＃麻杏石甘湯拆方Ⅲ組 12.96 1.05±0.06＃＃ 1.01±0.06△＃＃ 1.02±0.04＃＃ 0.96±0.05△＃＃麻杏石甘湯拆方Ⅳ組 12.96 0.93±0.05△＃＃ 0.95±0.04△＃＃ 0.89±0.04△＃＃ 1.03±0.05△△＃陽性對(duì)照組 0.15 0.53±0.04△△ 0.69±0.04△△ 0.58±0.03△△ 1.30±0.04△△

綜上所述，麻杏石甘湯全方組可極顯著下調(diào)Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達(dá)（P＜0.01），而各拆方組的調(diào)節(jié)作用明顯較弱，依次為Ⅳ＞Ⅱ＞Ⅲ＞Ⅰ。由此推定，麻杏石甘湯中4 味藥材在方中的作用程度依次為麻黃＞石膏＞杏仁＞甘草。

3.3 Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA 表達(dá) 表3 顯示，與正常對(duì)照組比較， 模型組Bax、 caspase-3 mRNA 表達(dá)極顯著升高（P ＜0.01），Bcl-2 mRNA表達(dá)極顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，麻杏石甘湯全方組第7 天Bax、caspase-3 mRNA 表達(dá)極顯著降低（P＜0.01），Bcl-2 mRNA 表達(dá)極顯著升高（P＜0.01），第11、14 天Bax、caspase-3 mRNA表達(dá)極顯著降低（P＜0.01），Bcl-2 mRNA 表達(dá)極顯著升高 （P ＜0.01）； 拆方Ⅳ組第7 天Bax、caspase-3 mRNA 表達(dá)極顯著降低（P＜0.01），Bcl-2 mRNA 表達(dá)極顯著升高（P＜0.01）；拆方Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組各時(shí)間點(diǎn)三者mRNA 表達(dá)無顯著差異（P＞0.05）。

表3 各組Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA 表達(dá)比較（n＝10）Tab.3 Comparison of Bax，Bcl-2 and caspase-3 mRMA expressions among various groups（n＝10）

表3 各組Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA 表達(dá)比較（n＝10）Tab.3 Comparison of Bax，Bcl-2 and caspase-3 mRMA expressions among various groups（n＝10）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與麻杏石甘湯全方組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1） 時(shí)間 caspase-3 Bcl-2 Bax正常對(duì)照組 — 第3 天 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00第7 天 0.99±0.02 1.01±0.01 1.00±0.02第11 天 1.01±0.01 1.00±0.02 1.01±0.01第14 天 1.00±0.01 0.98±0.03 0.99±0.02模型組 — 第3 天 7.31±0.11** 4.61±0.07** 6.12±0.11**第7 天 7.84±0.12** 4.42±0.08** 6.14±0.12**第11 天 7.53±0.10** 4.43±0.08** 6.17±0.15**第14 天 7.46±0.09** 4.45±0.09** 6.15±0.12**麻杏石甘湯全方組 16.5 第3 天 6.17±0.07 3.53±0.11 5.36±0.12第7 天 4.44±0.06△ 1.57±0.08△ 1.67±0.05△△第11 天 3.79±0.05△△ 1.37±0.07△△ 1.62±0.04△△第14 天 3.52±0.05△△ 1.24±0.06△△ 1.61±0.06△△麻杏石甘湯拆方Ⅰ組 14.14 第3 天 7.13±0.13＃ 4.13±0.10＃ 5.64±0.13第7 天 7.02±0.10＃ 4.29±0.11＃＃ 5.28±0.12＃＃第11 天 6.84±0.08＃＃ 4.33±0.12＃＃ 5.35±0.12＃＃第14 天 6.69±0.09＃＃ 4.36±0.14＃＃ 5.42±0.14＃＃麻杏石甘湯拆方Ⅱ組 9.43 第3 天 7.05±0.12 4.01±0.11＃ 4.68±0.11＃第7 天 6.76±0.13△ 4.12±0.11＃ 4.36±0.09＃＃第11 天 6.41±0.13△＃＃ 4.21±0.12＃＃ 4.27±0.13△＃＃第14 天 6.46±0.14△＃＃ 4.24±0.10△＃＃ 4.28±0.11△＃＃麻杏石甘湯拆方Ⅲ組 12.96 第3 天 7.08±0.12 3.52±0.08＃ 5.35±0.12第7 天 6.95±0.14＃＃ 2.91±0.07△＃＃ 5.21±0.12＃＃第11 天 6.68±0.14＃＃ 2.95±0.09△＃＃ 5.12±0.11＃＃第14 天 6.54±0.15＃＃ 2.98±008△＃＃ 5.14±0.10＃＃麻杏石甘湯拆方Ⅳ組 12.96 第3 天 7.01±0.005 2.22±0.07△＃ 3.66±0.07△△＃第7 天 6.39±0.004△ 2.53±0.09△＃ 3.32±0.09△△＃＃第11 天 5.84±0.003△＃ 2.74±0.06△＃ 3.29±0.08△△＃第14 天 5.61±0.004△＃ 2.76±0.10△＃ 3.41±0.10△△＃陽性對(duì)照組 0.15 第3 天 5.49±0.003△＃ 1.34±0.05△△＃＃ 1.67±0.09△△＃＃第7 天 5.07±0.004△△＃ 1.63±0.08△△ 1.33±0.06△△第11 天 4.73±0.003△△＃ 1.71±0.09△△＃ 1.34±0.07△△第14 天 4.67±0.003△△＃ 1.82±0.09△△＃ 1.33±0.08△△

4 討論

肺炎鏈球菌是引起肺炎的首要病原菌［10］，而小兒肺炎是臨床上常見的呼吸系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重時(shí)伴有心力衰竭、呼吸衰竭等感染并發(fā)癥， 危及生命［11］，該細(xì)菌引起肺炎感染后，可直接或間接誘導(dǎo)體內(nèi)細(xì)胞凋亡，也可能是生物機(jī)體利用細(xì)胞凋亡的方式清除病原微生物，是一種犧牲少數(shù)細(xì)胞而保護(hù)機(jī)體的重要防衛(wèi)機(jī)制［12］。

凋亡主要受細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白的調(diào)控，機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的蛋白分為抗凋亡蛋、促凋亡兩類，Bax、Bcl-2 為同源相關(guān)蛋白，其水平與細(xì)胞凋亡調(diào)控密切相關(guān)，其中前者為促凋亡蛋白，后者為抗凋亡蛋白，并且Bcl-2／Bax 異二聚體也起到抗凋亡作用。兩者在正常細(xì)胞內(nèi)的比例相對(duì)恒定，但當(dāng)細(xì)胞受到外界凋亡信號(hào)刺激后，各蛋白表達(dá)發(fā)生變化，從而影響細(xì)胞周期［13］。caspase-3 是caspase 家族中最重要的效應(yīng)型，其表達(dá)與肺炎小鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)，也是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，文獻(xiàn)［14］報(bào)道支原體肺炎與caspase-3 蛋白表達(dá)關(guān)系密切。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小鼠感染肺炎鏈球菌后肺泡上皮細(xì)胞遭到破壞，細(xì)胞有增生情況，血管及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有腫脹向管腔突出，肺泡細(xì)胞核質(zhì)脫落，板層小體排空，空泡化，有凋亡特征結(jié)構(gòu)特征發(fā)生，肺組織中Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達(dá)明顯升高，而Bcl-2／Bax 下降明顯；與模型組比較，麻杏石甘湯全方組、拆方Ⅱ組、拆方Ⅳ組Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達(dá)均有所下降，以全方組更明顯，而且Bax、 caspase-3 mRNA 表達(dá)明顯降低，Bcl-2 mRNA 表達(dá)明顯升高。

另外，對(duì)麻杏石甘湯拆方進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，各藥材作用強(qiáng)度由大到小依次為麻黃、石膏、杏仁、甘草，方中麻黃為君藥，開瀉肺熱，取“火郁發(fā)之” 之意；石膏味辛、甘，性大寒，清瀉肺熱；杏仁降肺氣，佐麻黃、石膏清肺平喘；炙甘草益氣和中，調(diào)和諸藥［15］。由此推測(cè)，這些清除肺熱的藥材在麻杏石甘湯治療肺炎鏈球菌所致肺炎小鼠中可能起到了主要作用。