遲廣俊，柴國(guó)璧，李小斌，張啟東，劉俊輝，毛 健，史清照，王丁眾，姬凌波，李希強(qiáng)，寧 偉，韓國(guó)陽(yáng)，趙新玉，毛 華，范 武*

1.紅塔遼寧煙草有限責(zé)任公司，沈陽(yáng)市和平北大街26 號(hào) 110001

2.中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)楓楊街2 號(hào) 450001

3.陜西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，陜西省寶雞市高新大道100 號(hào) 721013

吲哚和3-甲基吲哚是一類具有復(fù)雜氣息的苯并吡咯類化合物，在香味化學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的用途。調(diào)香師常用吲哚和3-甲基吲哚展示人類嗅覺(jué)系統(tǒng)奇妙的運(yùn)行機(jī)制：純的或高濃度的吲哚及3-甲基吲哚帶有強(qiáng)烈的糞臭氣息，當(dāng)濃度低于某一臨界值時(shí)，二者的嗅覺(jué)特征開(kāi)始發(fā)生轉(zhuǎn)變，吲哚表現(xiàn)出接近茉莉花香的香氣，3-甲基吲哚則展現(xiàn)出花香和大靈貓香樣的動(dòng)物香，該臨界值也即吲哚和3-甲基吲哚的嗅覺(jué)特征轉(zhuǎn)變濃度。吲哚和3-甲基吲哚在自然界分布廣泛，在茉莉花精油［1］、茶葉［2-4］、咖啡豆［5-7］、黃油［8］、奶酪［9］、白酒窖泥［10］、白酒［11］、肉類［12-14］等具有完全不同嗅覺(jué)特征的體系中，均發(fā)現(xiàn)了吲哚或3-甲基吲哚。由于基質(zhì)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)、嗅覺(jué)特征轉(zhuǎn)變濃度以及與其他成分之間可能存在的協(xié)同作用等因素影響，吲哚和3-甲基吲哚在某些體系中被認(rèn)為是重要的致香成分［1-4］，而在另一些體系中則被認(rèn)為會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的感官缺陷［11-14］。

吲哚和3-甲基吲哚在煙葉［15-18］及卷煙煙氣［19］中也普遍存在，但對(duì)其在卷煙中的感官作用卻有不同的研究報(bào)道。王玉華等［15］認(rèn)為烤煙自然醇化過(guò)程中所產(chǎn)生的吲哚，對(duì)卷煙的余味和刺激性產(chǎn)生了顯著正面影響；許春平等［16］認(rèn)為添加以3-甲基吲哚等為特征致香成分的煙草浸膏可以明顯提升卷煙的整體品質(zhì)；劉善民等［17］認(rèn)為曬紅煙中的吲哚對(duì)雜氣有正面效應(yīng)；而于建軍等［18］卻認(rèn)為吲哚對(duì)烤煙煙氣的香氣質(zhì)、香氣量均有顯著的負(fù)面影響。目前，對(duì)于吲哚、3-甲基吲哚在卷煙中的香味作用仍無(wú)定論，且大多數(shù)研究主要采用統(tǒng)計(jì)分析方式獲得煙葉中吲哚、3-甲基吲哚質(zhì)量分?jǐn)?shù)與評(píng)吸結(jié)果的相關(guān)性，鮮見(jiàn)針對(duì)二者在卷煙煙氣中濃度與香氣特征關(guān)系的直接分析。卷煙的感官品質(zhì)主要取決于煙氣中的香味物質(zhì)，食品感官組學(xué)領(lǐng)域通常利用香味物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和閾值之比，即香氣活性值（Odor activity value，OAV）判定其對(duì)產(chǎn)品香味特征的貢獻(xiàn)程度［20］。鑒于此，本研究中系統(tǒng)測(cè)定了不同卷煙主流煙氣粒相物中吲哚和3-甲基吲哚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，測(cè)定其在兩種不同極性溶劑中的嗅覺(jué)閾值和嗅覺(jué)特征轉(zhuǎn)變濃度，計(jì)算相應(yīng)的香氣活性值，并討論其對(duì)卷煙煙氣香氣特征的作用，旨在為改進(jìn)卷煙調(diào)香技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)用卷煙樣品為14 個(gè)市售品牌成品卷煙；煙草添加劑安全性評(píng)估參比卷煙（上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司）。

吲哚（99%）、3-甲基吲哚（96%）（百靈威科技有限公司）；四甲基吡嗪［＞98%，Alfa Aesar（中國(guó)）化學(xué)有限公司］。

5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent 公司）；SM450 型20 孔道吸煙機(jī)（英國(guó)Cerulean 公司）；CP224S 型分析天平（感量0.000 1 g，德國(guó)Sartorius 公司）44 mm 劍橋?yàn)V片（英國(guó)Whatman公司）；HY-5 型振蕩器（浙江金壇中大儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 主流煙氣粒相物收集和樣品準(zhǔn)備

挑選質(zhì)量范圍為（0.864±0.020）g、吸阻范圍為（1 080±50）Pa的卷煙，保持環(huán)境溫度為（22±1）℃，相對(duì)濕度為（60±2）%，平衡48 h。按ISO3308［21］和GB/T 19609—2004［22］的方法抽吸煙支，每一濾片收集5 支煙的主流煙氣粒相物。將兩張已收集煙氣粒相物的濾片置于50 mL 具塞錐形瓶中，加入20 mL 內(nèi)標(biāo)溶液（1 μg/mL 四甲基吡嗪的乙醇溶液），室溫振蕩30 min。取1 mL 上清液進(jìn)行GC/MS分析，每個(gè)樣品測(cè)定2 次，取平均值。分析條件：

色譜柱：DB-WAXetr（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣：He；柱流量：1 mL/min；分流模式：不分流；程序升溫：50 ℃（0 min）傳輸線溫度：250 ℃；電離方式：EI；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；掃描模式：選擇離子掃描。待測(cè)化合物保留時(shí)間、定性及定量離子的參數(shù)選擇見(jiàn)表1。

表1 吲哚和3-甲基吲哚的保留時(shí)間和選擇離子表Tab.1 Retention times and selected ion parameters of indole and 3-methylindole

1.2.2 嗅覺(jué)閾值和嗅覺(jué)特征轉(zhuǎn)變濃度的測(cè)定

按照GB/T 22366—2008［23］中針對(duì)最優(yōu)估計(jì)閾值（Best estimate threshold，BET）法測(cè)定風(fēng)味物質(zhì)閾值的方法，選擇10 位身體健康、無(wú)任何感官方面缺陷、無(wú)明顯體味的人員，采用三點(diǎn)選配法（3-AFC）分別測(cè)定待測(cè)物在乙醇和三乙酸甘油酯中的嗅覺(jué)閾值。將吲哚、3-甲基吲哚分別配制成1 mg/mL 的乙醇和三乙酸甘油酯溶液，并逐級(jí)等比例稀釋20 次，稀釋因子為2，分別獲得兩種溶劑中二者濃度等比例降低的系列溶液；對(duì)于每個(gè)濃度的溶液，均要求評(píng)價(jià)人員從1 個(gè)溶液和2 個(gè)空白中辨識(shí)出該溶液，并描述所識(shí)別出的溶液的嗅覺(jué)特征。對(duì)每一個(gè)待測(cè)物質(zhì)，以每位評(píng)價(jià)人員辨識(shí)錯(cuò)誤的最高濃度和其緊鄰的更高一級(jí)濃度的幾何平均值作為該評(píng)價(jià)人員評(píng)價(jià)該物質(zhì)的BET 值；再分別計(jì)算10 位評(píng)價(jià)人員對(duì)每個(gè)待測(cè)物BET 值的幾何平均值，將其作為待測(cè)物的嗅覺(jué)閾值。

對(duì)每一個(gè)待測(cè)物，將每位評(píng)價(jià)人員描述為糞臭的最低濃度和描述為花香的最高濃度作為該評(píng)價(jià)人員評(píng)價(jià)該物質(zhì)嗅覺(jué)特征發(fā)生轉(zhuǎn)變的濃度范圍，從10 個(gè)描述為糞臭的最低濃度中選取一個(gè)最大值，從10 個(gè)描述為花香的最高濃度中選取一個(gè)最小值，以此作為待測(cè)物的嗅覺(jué)特征轉(zhuǎn)變濃度范圍。目前并沒(méi)有測(cè)定某一物質(zhì)嗅覺(jué)特征轉(zhuǎn)變濃度的標(biāo)準(zhǔn)方法，因此本研究中選取上述的濃度范圍，從而保證吲哚和3-甲基吲哚的轉(zhuǎn)變濃度在上述方法測(cè)定的濃度范圍內(nèi)。事實(shí)上，以煙氣粒相物中吲哚和3-甲基吲哚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為依據(jù)，配制成同樣質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙醇和三乙酸甘油酯溶液，經(jīng)評(píng)價(jià)人員嗅聞后，確認(rèn)二者皆為明顯糞臭氣息，說(shuō)明該方法適用于本研究。

1.2.3 卷煙樣品中待測(cè)物的香氣活性值

以14 種卷煙樣品主流煙氣粒相物中待測(cè)物在粒相物中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與其嗅覺(jué)閾值的比值，作為該物質(zhì)的OAV 值［20］。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的建立

分別考察了DB-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）、DB-WAXetr（60 m×0.25 mm×0.25 μm）兩種色譜柱對(duì)待測(cè)物的分離效果。結(jié)果表明，使用DB-WAXetr 色譜柱，在標(biāo)準(zhǔn)溶液及煙氣樣品中，2種待測(cè)物的GC/MS 基線可實(shí)現(xiàn)分離，且峰型較好，整個(gè)分析過(guò)程可在19 min 內(nèi)結(jié)束；而使用DB-5MS 色譜柱時(shí)峰形較差。

2.2 定量分析方法的驗(yàn)證結(jié)果

本研究中采用內(nèi)標(biāo)法定量，以各待測(cè)物的濃度與內(nèi)標(biāo)濃度之比為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，2 種待測(cè)組分的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。在相同條件下對(duì)參比卷煙煙氣樣品平行測(cè)定6 次，計(jì)算2 種物質(zhì)測(cè)定的RSD。將最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定6次，以其3 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為方法的檢測(cè)限、10 倍作為方法的定量限。結(jié)果表明，方法的線性回歸系數(shù)均大于0.999，各測(cè)定值的RSD 均小于10%，線性和重復(fù)性良好，適合進(jìn)行定量分析。2 種待測(cè)物3 水平的加標(biāo)回收率見(jiàn)表3，目標(biāo)物的回收率在100%～110%之間，說(shuō)明本方法的測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確。

表2 兩種待測(cè)物的工作曲線、檢測(cè)限、定量限及RSDTab.2 Working curves,limits of detection,limits of quantification and RSDs for 2 analytes

表3 兩種待測(cè)物的回收率和RSDTab.3 Spiked recoveries and RSDs for 2 analytes

2.3 主流煙氣粒相物中待測(cè)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)

采用本方法分別檢測(cè)了14 種成品卷煙煙氣中吲哚和3-甲基吲哚的釋放量，表4 為兩種待測(cè)物的單支卷煙煙氣釋放量和在主流煙氣粒相物中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。從表4 中的檢測(cè)結(jié)果可以看出，吲哚和3-甲基吲哚在部分混合型卷煙中的單支釋放量和主流煙氣粒相物中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，且明顯高于其他卷煙。

煙氣中含氮化合物不僅種類和數(shù)量豐富，而且由于堿性的強(qiáng)弱，其可能會(huì)呈現(xiàn)出多種形態(tài)，從而對(duì)卷煙感官品質(zhì)產(chǎn)生影響。例如，煙堿可與質(zhì)子結(jié)合，以游離態(tài)和單質(zhì)子態(tài)分布在煙氣中，其中煙氣游離煙堿與卷煙勁頭密切相關(guān)，游離煙堿釋放越高，勁頭越大［24］?？紤]到吲哚和3-甲基吲哚均具有烯胺結(jié)構(gòu)，其3-位碳可在酸性環(huán)境中發(fā)生質(zhì)子化［25］。在HClO4溶液中，質(zhì)子化吲哚的pKa值約為-3.6［26］，質(zhì)子化3-甲基吲哚的pKa值約為-4.55［26］。由此可見(jiàn)，吲哚和3-甲基吲哚是一類堿性極弱的氮雜環(huán)化合物，在相對(duì)弱酸性的煙氣環(huán)境中處于游離狀態(tài)。因此兩種物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果較為真實(shí)地反映了煙氣中二者的實(shí)際釋放量水平。

表4 兩種待測(cè)物在14 種卷煙樣品主流煙氣中的釋放量分布Tab.4 Releases of 2 analytes in mainstream smoke of 14 cigarette samples

2.4 嗅覺(jué)閾值測(cè)定和OAV 計(jì)算結(jié)果

在不同極性的介質(zhì)中，香氣成分往往具有不同的嗅覺(jué)閾值。卷煙煙氣粒相物成分復(fù)雜，僅使用一種介質(zhì)很難模擬其極性。煙氣粒相物中的水溶性成分（極性較強(qiáng)）約占1/3，剩下的部分則為油溶性成分（極性較弱）［27］?？紤]到介質(zhì)的安全性以及避免閾值測(cè)定中介質(zhì)自身感官特征所帶來(lái)的干擾，分別以乙醇和三乙酸甘油酯作為不同極性介質(zhì)的代表，以獲得待測(cè)物在強(qiáng)、弱兩種極性介質(zhì)中的嗅覺(jué)閾值。鑒于吲哚、3-甲基吲哚的嗅覺(jué)特征隨其濃度的變化而有所不同，本研究中進(jìn)一步評(píng)價(jià)了兩種物質(zhì)在上述介質(zhì)中的嗅覺(jué)特征。如表5所示，無(wú)論是在乙醇還是三乙酸甘油酯中，3-甲基吲哚的嗅覺(jué)閾值均明顯低于吲哚；兩種物質(zhì)在乙醇中的嗅覺(jué)閾值均低于各自在三乙酸甘油酯中的閾值。此外，當(dāng)吲哚在乙醇、三乙酸甘油酯中的濃度分別介于3.45～6.90 μg/g 和13.81～27.63 μg/g 時(shí)，嗅覺(jué)特征開(kāi)始由花香向糞臭氣息轉(zhuǎn)變，隨著濃度的升高糞臭氣息愈發(fā)明顯而無(wú)花香；相比之下，3-甲基吲哚在兩種介質(zhì)中的嗅覺(jué)轉(zhuǎn)變濃度均更低。

表5 兩種待測(cè)物在乙醇和三乙酸甘油酯中的嗅覺(jué)閾值及嗅覺(jué)特征轉(zhuǎn)變濃度Tab.5 Olfactory thresholds and critical concentrations at which olfactory characteristics changed for 2 analytes in ethanol and triacetin solutions

根據(jù)吲哚、3-甲基吲哚在卷煙煙氣粒相物中質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其在兩種介質(zhì)中的嗅覺(jué)閾值，分別計(jì)算兩種物質(zhì)在14 種卷煙樣品煙氣中的OAV（表6）?？梢钥闯觯瑹o(wú)論是以強(qiáng)極性或是弱極性溶劑為介質(zhì)，吲哚和3-甲基吲哚的OAV 均大于1，且后者的OAV 遠(yuǎn)高于前者。根據(jù)OAV 的定義，可以推測(cè)吲哚和3-甲基吲哚均能影響卷煙煙氣的香氣特征，且3-甲基吲哚的作用更加顯著。不考慮在卷煙煙氣氣相部分的分布量，兩種成分僅在主流煙氣粒相物中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（表4）已遠(yuǎn)高于各自的嗅覺(jué)特征轉(zhuǎn)變濃度（表5），因此二者在煙氣中應(yīng)當(dāng)表現(xiàn)為糞臭氣息。然而在卷煙燃吸過(guò)程中，吲哚、3-甲基吲哚所固有的糞臭氣息在煙氣中并不容易被消費(fèi)者感受到，其原因可能是由于煙熏香氣可以有效掩蓋糞臭氣息［28］，而煙熏香也是卷煙煙氣中的一種十分強(qiáng)烈的香韻［29］。事實(shí)上，利用煙熏香掩蓋吲哚、3-甲基吲哚所帶來(lái)的不良?xì)庀⑹鞘称氛{(diào)香中的常用方法。例如，3-甲基吲哚通常被認(rèn)為是豬肉膻味的主要來(lái)源，可對(duì)豬肉風(fēng)味產(chǎn)生不利影響，而利用煙熏香技術(shù)則可以有效控制豬肉膻味。有研究報(bào)道，脂肪中3-甲基吲哚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)0.4 mg/kg 和0.89 mg/kg 的豬肉和香腸的膻味，可以使用液體煙熏劑掩蓋［30-31］。由于煙氣中的煙熏香成分多為酚類物質(zhì)［29］，在口腔中容易通過(guò)氫鍵作用與蛋白結(jié)合［32］，這可能導(dǎo)致其失去掩蓋不良?xì)庀⒌哪芰?。因此認(rèn)為吲哚和3-甲基吲哚在口腔內(nèi)的累積可能是造成卷煙長(zhǎng)期消費(fèi)者口腔具有異味的重要原因。

表6 14 種卷煙樣品主流煙氣中兩種待測(cè)物的香氣活性值Tab.6 OAVs of 2 analytes in mainstream smoke of 14 cigarette samples

3 結(jié)論

①3-甲基吲哚在乙醇和三乙酸甘油酯中的嗅覺(jué)閾值遠(yuǎn)低于吲哚；隨著濃度的升高，二者的嗅覺(jué)特征由花香轉(zhuǎn)變?yōu)榧S臭氣息。②從吲哚和3-甲基吲哚的單支卷煙煙氣釋放量及在煙氣粒相物中質(zhì)量分?jǐn)?shù)來(lái)看，混合型卷煙明顯高于烤煙型卷煙。③通過(guò)OAV 值反映出吲哚和3-甲基吲哚對(duì)煙氣香氣皆有影響，且以3-甲基吲哚作用更明顯。④分別比較吲哚、3-甲基吲哚在煙氣粒相物中質(zhì)量分?jǐn)?shù)與其在兩種介質(zhì)中的嗅覺(jué)特征轉(zhuǎn)變濃度可知，其在煙氣中表現(xiàn)為糞臭氣息，但由于煙熏香的掩蓋作用，二者的糞臭氣息并不易被卷煙消費(fèi)者感受到，然而其在口腔內(nèi)的累積可能是造成卷煙長(zhǎng)期消費(fèi)者口腔具有異味的重要原因。