倪珊珊,薛冠華,李少麗,閆 超,孫紅妹

肺炎支原體是柔膜體綱的一種非典型病原體,是社區(qū)獲得性肺炎的重要致病原。肺炎支原體對宿主細(xì)胞的黏附是其致病的前提條件。肺炎支原體在通過飛沫傳染侵入呼吸道后,借助黏附細(xì)胞器(attchment organelle)牢固黏附于呼吸道上皮細(xì)胞的表面受體。黏附細(xì)胞器又被稱為尖端結(jié)構(gòu)(tip structure)或末端細(xì)胞器(terminal organelle),可分為表面結(jié)構(gòu)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)兩部分。其中,內(nèi)部結(jié)構(gòu)分為半透明區(qū)和核心結(jié)構(gòu),而核心結(jié)構(gòu)又分為終端按鈕(terminal button)、成對板(paired plates)、碗狀/輪狀復(fù)合體(bowl/wheel complex)[1]。

根據(jù)單克隆抗體和增強(qiáng)型黃色熒光蛋白(EYFP)可以確定黏附細(xì)胞器15個(gè)組成蛋白質(zhì)的定位[2],如圖1所示[1]。

圖1 肺炎支原體黏附細(xì)胞器結(jié)構(gòu)示意圖[1]Fig.1 Schematic diagram of M.pneumoniae attachment organelle

1 表面結(jié)構(gòu)

表面結(jié)構(gòu)負(fù)責(zé)肺炎支原體與宿主細(xì)胞表面的結(jié)合,包括P1黏附素、P30黏附素、P40蛋白、P90蛋白[1]。

1.1 P1黏附素(MPN141) P1黏附素由1 627個(gè)氨基酸殘基組成,大小為176kDa,是一個(gè)可溶性蛋白質(zhì)[2]。加工后,其長度縮短到1 568個(gè)氨基酸殘基,大小為170kDa。

P1黏附素的作用包括兩方面:一方面參與肺炎支原體與細(xì)胞表面受體的結(jié)合,另一方面參與肺炎支原體在細(xì)胞表面的滑動(dòng)[1]。P1二聚體與P90二聚體形成異源二聚體復(fù)合物,即P1黏附復(fù)合體。后者被認(rèn)為是滑動(dòng)機(jī)制的支柱,因?yàn)橹гw的滑動(dòng)速度在P1黏附蛋白單克隆抗體存在時(shí)降低。

1.2 P30黏附素(MPN453) P30黏附素由274個(gè)氨基酸殘基組成,大小為30kDa,是一種膜結(jié)合蛋白,可分為4個(gè)結(jié)構(gòu)域——前導(dǎo)肽區(qū)、胞內(nèi)段(結(jié)構(gòu)域I)、跨膜區(qū)及胞外區(qū)(包括結(jié)構(gòu)域II和結(jié)構(gòu)域III)。

Chang HY等[3]構(gòu)建了缺失P30不同結(jié)構(gòu)域的多個(gè)肺炎支原體轉(zhuǎn)化株以比對P30各個(gè)片段的功能,結(jié)果顯示,結(jié)構(gòu)域II的缺失、結(jié)構(gòu)域III的受損以及跨膜區(qū)特定部位氨基酸的突變嚴(yán)重影響了蛋白的穩(wěn)定性和功能。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域I的缺失雖然不影響P30的穩(wěn)定性、定位能力及P65的穩(wěn)定性,但其黏附能力仍然很差。這些缺失還影響了信號(hào)肽的形成過程。Marotta和Nicole[4]發(fā)現(xiàn)P30胞外區(qū)有一串富脯氨酸重復(fù)序列(PRRs),該序列的改變降低P30的穩(wěn)定性以及肺炎支原體的滑動(dòng)速度。

Chang HY等[5]發(fā)現(xiàn)P30翻譯后修飾的信號(hào)肽切割部位可能在52-53氨基酸位點(diǎn)之間。翻譯后修飾缺陷株的滑行速率和黏附能力均下降,提示翻譯后修飾對形成有功能的成熟P30黏附素是必要的,推測翻譯后修飾引發(fā)了胞外結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象改變或使得胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域中某一結(jié)合位點(diǎn)暴露,最終促成P30黏附素與受體的結(jié)合。

Layh-Schmitt G等[6]進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)的研究表明,P30黏附素和P1黏附素之間距離很接近,這使P30與P1在致病方面表現(xiàn)出相似的功能和協(xié)同作用。Krause DC等[7]發(fā)現(xiàn)P30基因的突變導(dǎo)致尖端結(jié)構(gòu)上P1黏附復(fù)合體的密度降低,說明P30是P1黏附復(fù)合體的輔助蛋白。

Hasselbring BM等[8]發(fā)現(xiàn)P30突變株(II-3R)的第2個(gè)移碼突變導(dǎo)致P30黏附素改變,導(dǎo)致肺炎支原體具有黏附功能卻不具備移動(dòng)功能。以上實(shí)驗(yàn)說明P30黏附素在肺炎支原體的滑動(dòng)和黏附上起作用。

1.3 P40(MPN142) P40由454個(gè)氨基酸殘基組成,大小為48kDa,是一種可溶性蛋白。P40由MPN142蛋白上的6個(gè)肽段分割而成,氨基酸序列范圍是43-397。其信號(hào)序列具有一部分N端跨膜結(jié)構(gòu)域[9]。

P40基因的非同義突變導(dǎo)致尖端結(jié)構(gòu)表面P1黏附復(fù)合體數(shù)量下降,說明P40是P1黏附復(fù)合體的輔助蛋白。P1蛋白插入細(xì)胞膜的過程很大程度依賴于P40[8]。

1.4 P90(MPN142) P90由764個(gè)氨基酸殘基組成,83kDa,也是一種可溶性蛋白。P90由MPN142蛋白上的15個(gè)肽段分割而成,氨基酸序列范圍是456-1158。其信號(hào)序列具有一部分N端跨膜結(jié)構(gòu)域。P90二聚體與P1二聚體形成異源二聚體復(fù)合物,即P1黏附復(fù)合體[9]。

2 內(nèi)部結(jié)構(gòu)

內(nèi)部結(jié)構(gòu)分為半透明區(qū)和核心結(jié)構(gòu),其作用包括細(xì)胞器的形成、維持以及力的產(chǎn)生和傳遞。半透明區(qū)被剛性、不擴(kuò)散的電子透明物質(zhì)占據(jù),作用是將碗狀/輪狀復(fù)合體產(chǎn)生的力傳遞至成對板[10]。核心結(jié)構(gòu)在斷層圖像中也被稱為“電子致密核”,因?yàn)榕c細(xì)胞的其他部分相比,它具有較高的電子密度。核心結(jié)構(gòu)可進(jìn)一步分為3個(gè)部分:終端按鈕、成對板和碗狀/輪狀復(fù)合體。

2.1 終端按鈕(terminal button) 終端按鈕由HMW3和P65蛋白構(gòu)成,參與確定肺炎支原體的滑動(dòng)方向的改變。

2.1.1 HMW3(MPN452) HMW3由672個(gè)氨基酸殘基組成,大小為74kDa,是一種骨架蛋白。HMW3具有2個(gè)大的酸性富脯氨酸結(jié)構(gòu)域(APR)。

HMW 3濃度相對豐富,似乎以聚合絲的形式存在,圍繞著核心結(jié)構(gòu)的近胞膜側(cè)。

HMW 3的丟失伴隨著p65水平的降低,顯著影響尖端結(jié)構(gòu)功能,造成細(xì)胞黏附性差、肺炎支原體失去滑動(dòng)能力以及P1黏附素在尖端結(jié)構(gòu)的定位改變。Krause DC等[7]認(rèn)為終端按鈕在缺少HMW3的情況下會(huì)不斷改變亞結(jié)構(gòu)或失去亞結(jié)構(gòu)。在沒有HMW 3的情況下,野生型肺炎支原體的核心結(jié)構(gòu)在復(fù)制后從終端按鈕分離的過程似乎也受到了損害[10]。這些觀察表明,HMW 3在尖端結(jié)構(gòu)組裝和功能中起到空間組織作用。

2.1.2 P65(MPN309) P65蛋白由405個(gè)氨基酸殘基組成,大小為47kDa,其氨基酸序列的特點(diǎn)是存在兩個(gè)長度為40個(gè)氨基酸殘基的重復(fù)區(qū),分別位于第57～96氨基酸殘基和第122～161氨基酸殘基。P65形成一個(gè)由直徑30 nm的中心球和由約10 nm凸出細(xì)絲組成的多聚體[11]。

HasselbringBM等[12]發(fā)現(xiàn)P65蛋白與P30蛋白在黏附復(fù)合體形成的過程中幾乎同時(shí)移動(dòng)。在采用轉(zhuǎn)座子插入而構(gòu)建的P65蛋白功能缺失的突變株中,P30的穩(wěn)定性下降。將p65突變株進(jìn)行回補(bǔ)后,P65和P30的穩(wěn)定性都得到了恢復(fù)?？紤]到P30和P65之間密切的空間和功能關(guān)系,P65可能與P30內(nèi)部結(jié)構(gòu)域有交互作用。終端按鈕與膜前側(cè)的緊密結(jié)合可以通過這種相互作用來實(shí)現(xiàn)。此外,P65還可以通過修改附著器相對于細(xì)胞軸角度確定滑動(dòng)方向。

2.2 成對板(paired plates) 成對板由間隔7 nm的成對分隔板組成,即薄板和厚板。薄板的特色是具備一個(gè)規(guī)律的六角形晶格排列,可能由HMW1和CpsG組成。厚板長軸具有間隔為8 nm的條紋結(jié)構(gòu)[10]。成對板可能作為附著器形成的支架,在滑動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。

2.2.1 HMW1(MPN447) HMW1由1 018個(gè)氨基酸殘基組成,大小為112kDa,是一種骨架蛋白。其氨基酸序列可被分為3個(gè)結(jié)構(gòu):N端的170個(gè)氨基酸殘基組成具有豐富芳香族氨基酸殘基和甘氨酸殘基(EAGR)的模體;中間171～522殘基部分是富含酸性氨基酸和脯氨酸(APR)的區(qū)域;C端的523～1018殘基以兩個(gè)卷曲螺旋區(qū)為特點(diǎn)。EAGR模體和卷曲螺旋可能參與薄板的六角形晶格排列的形成,因?yàn)樗麄兣c其他蛋白有交互作用[13]。

Seto等[14]報(bào)道,HMW1或HMW2的非同義突變導(dǎo)致電鏡圖中沒有電子密度核。熒光融合蛋白的顯微鏡觀測顯示HMW1定位在成對板的中心部分,暗示薄板包含 HMW1[2]。Krause DC等[15]認(rèn)為,HMW1作為黏附細(xì)胞器的一個(gè)早期裝配蛋白,對于黏附細(xì)胞器其他蛋白的穩(wěn)定和定位、以及黏附細(xì)胞器的形成、黏附和移動(dòng)很重要。HMW1與HMW2的穩(wěn)定性是相互依賴的。Page CA和Krause DC等[16]研究發(fā)現(xiàn)HMW1蛋白通過絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶被磷酸化,HMW1缺失突變株M6的P1蛋白磷酸化水平上升,出現(xiàn)截短的P30蛋白。

2.2.2 HMW2(MPN310) HMW2由1 818個(gè)氨基酸殘基組成,大小為216kDa,是厚板一種特異的骨架蛋白[2]。

HMW2的N端和C端分布定位在成對板的前后端。其氨基酸序列中由1 257個(gè)殘基組成的11個(gè)卷曲螺旋區(qū)域[17]構(gòu)成厚板的條紋,因?yàn)楹癜宓臈l紋數(shù)目范圍在10～12條之間。

HMW2的丟失或截?cái)鄷?huì)影響蛋白質(zhì)HMW 1、HMW 3、P65、P41、P30和P24的合成或穩(wěn)定性。這很可能是HMW2突變菌株在X線斷層影像中缺少核心結(jié)構(gòu)的原因。

HMW2與HMW1的穩(wěn)定性存在一定關(guān)聯(lián)。

2.2.3 CpsG(MPN066) CpsG 位于薄板,由544個(gè)氨基酸殘基組成,大小為63kDa。它具有321個(gè)肽段,等電點(diǎn)為8。CpsG蛋白是manB基因編碼的一種磷酸甘露糖變位酶,可將α-D-甘露糖-1-磷酸轉(zhuǎn)化為D-甘露糖-6-磷酸。該酶具有1個(gè)活性部位和4個(gè)離子結(jié)合位點(diǎn),其輔因子為Mg2＋。Li P[18]等在野生型沙門氏菌和減毒的ΔcyaΔcrp疫苗株中引入了(Δcpsg)缺失突變。突變株出現(xiàn)糖類合成的缺陷,導(dǎo)致其毒力減弱。口服接種突變株的小鼠比其親本菌株誘導(dǎo)的小鼠抗鼠傷寒血清IgG水平更高?？诜臃N突變株的小鼠完全免受野生型鼠傷寒沙門菌的攻擊,部分免受野生型腸炎沙門氏菌的攻擊。這些結(jié)果表明,Cpsg的缺失在疫苗制備上是有用的突變,可以進(jìn)一步應(yīng)用在肺炎支原體的預(yù)防研究上。

2.3 碗狀/輪狀復(fù)合體(bowl/wheel complex) 碗狀/輪狀復(fù)合體由P24、P41、P200、TopJ、Lon、MPN387組成,連接黏附細(xì)胞器和肺炎支原體的其余部分,可能負(fù)責(zé)力的產(chǎn)生或傳遞。

2.3.1 P24(MPN312) P24由218個(gè)氨基酸殘基組成,大小為24kDa。

Hasselbring BM等[19]應(yīng)用P30-cyan熒光蛋白(CFP)和相位對比度/熒光顯微鏡觀察野生型肺炎支原體尖端結(jié)構(gòu)的兩極和側(cè)面,發(fā)現(xiàn)大部分P24與P30配對。在沒有P24的情況下,未與P30配對的P41數(shù)目減少兩倍,肺炎支原體滑行頻率的降低和尖端結(jié)構(gòu)的形成降低是相似的,因此推測預(yù)先定位的P24(即與現(xiàn)有的尖端結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián))可以促進(jìn)P41在新尖端結(jié)構(gòu)形成中的初始凝聚,P24在尖端結(jié)構(gòu)組裝過程中起著守門人的作用。

此外,單獨(dú)增添P24并不足以使突變型肺炎支原體的滑動(dòng)頻率恢復(fù)到野生型肺炎支原體水平,說明P24功能依賴P41。當(dāng)缺乏P41時(shí),P24呈現(xiàn)一個(gè)動(dòng)態(tài)定位的模式。這說明P24需要P41來定位在尖端細(xì)胞器上。P24在細(xì)胞分裂時(shí)段初始尖端結(jié)構(gòu)裝配的亦始起作用,還用于調(diào)節(jié)滑動(dòng)馬達(dá)的活動(dòng)。

2.3.2 P41(MPN311) P41由357個(gè)氨基酸殘基組成,大小為41kDa,屬于細(xì)胞骨架蛋白,與肺炎支原體的滑行有關(guān)。

P41突變菌株滑動(dòng)速度和頻率僅為野生株水平的10%～30%。

P41突變菌株缺乏輪狀/碗狀復(fù)合體,呈現(xiàn)黏附細(xì)胞器與菌體分離的表型,這表明P41在輪狀/碗狀復(fù)合體的裝配和穩(wěn)定上是必需的。

新生黏附細(xì)胞器合適的空間定位也需要P41蛋白。P41使新生黏附細(xì)胞器在已存在的結(jié)構(gòu)附近生成。P41在裝配過程起到的空間定位作用,可能通過至少兩個(gè)機(jī)制完成。首先,P41可能識(shí)別并結(jié)合已存在尖端細(xì)胞器的一個(gè)蛋白成分。其次,模式原核生物中有越來越多的證據(jù)表明,細(xì)菌染色體具有更高的有序結(jié)構(gòu),即起點(diǎn)和末端始終位于細(xì)胞內(nèi)的特定位置。因此支原體染色體可能為P41結(jié)合以及黏附細(xì)胞器的正確定位提供框架,從而使黏附細(xì)胞器的功能與細(xì)胞分裂協(xié)同。

此外,P41還可以穩(wěn)定P28蛋白[20]。

2.3.3 P200(MPN567) P200由1 036個(gè)氨基酸殘基組成,大小為117kDa,包含酸性、富含輔氨酸的結(jié)構(gòu)域,具有6個(gè)EAGR盒(富含芳香和甘氨酸殘留物),后者是與肺炎支原體緊密相關(guān)的生殖支原體中的蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域,可能介導(dǎo)裝配高級(jí)復(fù)合體。

P200突變的肺炎支原體黏附水平與野生株一致,但滑動(dòng)速度下降[2]。這說明P200在肺炎支原體的滑動(dòng)上起作用。Jordan JL等[21]也認(rèn)為,P200對于M129的滑動(dòng)速度和頻率是必需的,對于黏附是非必需的。

Feng M等[22]通過研究運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn),只有P200隨著培養(yǎng)時(shí)間延長,穩(wěn)態(tài)水平下降。P200在接種后72 h后穩(wěn)態(tài)水平下降。他們認(rèn)為P200的丟失可能與細(xì)胞成熟有關(guān)。

2.3.4 TopJ(MPN119) TopJ由910個(gè)氨基酸殘基組成,大小為100kDa。它具有一個(gè)J-結(jié)構(gòu)域、2個(gè)黏附細(xì)胞器特有的結(jié)構(gòu)域:富含酸性氨基酸和脯氨酸結(jié)構(gòu)域(APR)和C端結(jié)構(gòu)域。學(xué)者Cloward和Krause[22]通過對TopJΔAPR、TopJΔC突變株的免疫熒光電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)富含酸性氨基酸和脯氨酸結(jié)構(gòu)域(APR)和C端結(jié)構(gòu)域是TopJ定位到黏附細(xì)胞器的關(guān)鍵。因?yàn)镴結(jié)構(gòu)域可以促進(jìn)肽的結(jié)合以及蛋白正確裝配,因此可認(rèn)為TopJ是一種促進(jìn)黏附細(xì)胞器成熟的分子伴侶。Feng M[23]認(rèn)為TopJ在黏附細(xì)胞器組裝后期起作用。另外,當(dāng)Top J缺失,P1會(huì)呈現(xiàn)為異常的、抗胰蛋白酶的構(gòu)象,影響肺炎支原體的黏附能力,可認(rèn)為TopJ影響肺炎支原體的黏附功能。

2.3.5 Lon(MPN332) Lon由795個(gè)氨基酸殘基組成,大小為90kDa。Lon蛋白是一種可溶性蛋白,共有548肽段,被標(biāo)注為ATP依賴的絲氨酸蛋白酶,以雙鏈、位點(diǎn)特異性的方式與DNA結(jié)合。Lon可將被tmRNA標(biāo)記的突變蛋白、異常蛋白質(zhì)以及特定短期調(diào)節(jié)蛋白選擇性降解為5-10個(gè)氨基酸的短肽片段,在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)上起重要作用,可使細(xì)胞從應(yīng)激產(chǎn)生的DNA損傷和發(fā)育改變中存活,故可被熱休克誘導(dǎo)表達(dá)[24]。

2.3.6 MPN387 MPN387由358個(gè)氨基酸殘基組成,大小為43kDa,是一種可溶性蛋白。2個(gè)MPN387通過卷曲螺旋的相互作用形成平行的同型二聚體,呈啞鈴形,長42.7 nm、直徑9.1 nm,包括一個(gè)長24.5 nm的中心平行卷曲螺旋部分。

MPN387在力的產(chǎn)生是必要的,在黏附上是非必需的[2]。產(chǎn)生自碗狀復(fù)合體的力可能通過MPN387傳播至成對板。

MPN387突變株黏附功能保留,但黏附細(xì)胞器的一些成分蛋白量減少,這說明MPN387還具有其他未知的功能[25]。

3 結(jié) 論

迄今為止,支原體學(xué)家通過人工構(gòu)建各種蛋白缺陷型的肺炎支原體突變株,并結(jié)合免疫熒光電鏡、斷層攝影等技術(shù),對肺炎支原體黏附細(xì)胞器及其成分蛋白的結(jié)構(gòu)與功能有了初步的了解,為肺炎支原體感染的檢測、治療、預(yù)防相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。例如,CpsG蛋白在傷寒沙門菌的免疫預(yù)防上有作用,或許有助于抑制肺炎支原體感染。Lon蛋白在維持肺炎支原體穩(wěn)態(tài)方面起到重要作用,破壞其結(jié)構(gòu)能否有助于人體清除肺炎支原體?黏附細(xì)胞器表面蛋白的免疫原性與抗原性如何,是否可以應(yīng)用在血清學(xué)檢測與疫苗制備上?當(dāng)然,肺炎支原體黏附細(xì)胞器還有很多未解之謎。蛋白水平上,黏附細(xì)胞器蛋白的合成、運(yùn)輸以及能量代謝過程、各蛋白之間相互作用尚未研究透徹;肺炎支原體黏附細(xì)胞器的成分蛋白各自參與了哪些信號(hào)通路,是否具有潛在的促炎活性,激活機(jī)體體液免疫、細(xì)胞免疫?細(xì)胞水平上,黏附細(xì)胞器在肺炎支原體內(nèi)的裝配過程、黏附細(xì)胞器上的P1黏附復(fù)合體與人體呼吸道黏膜上皮細(xì)胞哪類受體結(jié)合、這一過程依賴什么供能、P1黏附復(fù)合體存在怎樣的構(gòu)象改變均不清楚。對上述科學(xué)問題的進(jìn)一步探索將有助于認(rèn)識(shí)肺炎支原體,并改善肺炎支原體感染的檢測、治療及預(yù)防水平。

利益沖突:無

引用本文格式:倪珊珊,薛冠華,李少麗,等.肺炎支原體黏附細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)與功能[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào),2019,35(9):831-836.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.097