郭 彥,陳月紅,何 雷,李 沛,李江凡,孫世惠,趙光宇,周育森

鼠疫是一種由鼠疫耶爾森氏菌(簡稱鼠疫菌)引起的人獸共患烈性傳染病,能在人群中進(jìn)行傳播,其傳染性強(qiáng),死亡率高,也是制造生物恐怖的重要傳染病原之一。疫苗接種是防護(hù)疾病侵襲的有效方法[1-2],目前的鼠疫疫苗主要有滅活全菌苗、減毒活疫苗、重組亞單位疫苗等,但這些疫苗接種程序復(fù)雜,并要求冷藏運(yùn)輸,同時添加了佐劑,不利于進(jìn)行長時間保存。因此,研究者一直致力于尋求一種能接種簡易、耐熱穩(wěn)定、使用安全的疫苗研究新途徑。

枯草芽孢桿菌是一種益生菌,在高溫、酸堿等惡劣條件時能轉(zhuǎn)化成芽孢形態(tài)以抵抗不利環(huán)境。因此選擇合適的疫苗抗原并利用枯草桿菌芽孢發(fā)展為芽孢呈遞型疫苗,對疫苗生產(chǎn)條件要求低、易于大規(guī)模生產(chǎn)運(yùn)輸、可以口服免疫、使用安全等優(yōu)勢,可作為一種發(fā)展新型疫苗的重要方式。F1抗原是鼠疫菌的莢膜抗原,也是其主要的毒力因子之一,能夠介導(dǎo)鼠疫菌抵抗宿主吞噬細(xì)胞吞噬及抗補(bǔ)體的作用。F1抗體能夠通過結(jié)合F1蛋白,從而阻斷F1蛋白的抗吞噬作用,使機(jī)體針對鼠疫的攻擊能產(chǎn)生免疫保護(hù)作用。

因此,本研究針對鼠疫菌F1抗原,構(gòu)建和制備了表面展示F1抗原蛋白的重組枯草桿菌芽孢,采用無佐劑直接口服方式,評價重組芽孢對機(jī)體的免疫應(yīng)答。

1 材料與方法

1.1 材料 pDG1664質(zhì)粒,枯草芽孢桿菌PY-79株,鼠疫疫苗株EV76為本室保存。HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自Santa Cruze公司。鼠抗F1抗原多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存。芽孢染色試劑A/B購自Sigma公司。引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。BALB/c雌性小鼠,5～6周齡購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 重組質(zhì)粒pDG1664-CotB質(zhì)粒的構(gòu)建 按照TaKaRA基因組提取試劑盒說明書提取PY-79野生株基因組作為擴(kuò)增CotB片段的模板。根據(jù)序列設(shè)計(jì)并合成 PCR 引物(5′-3′)CotB-F:GAGATCTACGGATTAGGCCGTTTGTC,CotB-R:TGGATCCGGATGATTGATTGATCATCTGAAG。將擴(kuò)增的CotB片段與經(jīng)同樣酶切的載體pDG1664質(zhì)粒連接,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)PCR、酶切鑒定,獲得重組質(zhì)粒pDG1664-CotB,并送北京天一輝遠(yuǎn)有限公司測序鑒定。

1.3 目的基因F1片段的擴(kuò)增及純化 LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)鼠疫疫苗株EV76,然后提取基因組作為擴(kuò)增F1抗原片段的模板。根據(jù)序列設(shè)計(jì)并合成PCR引物(5′-3′)F1-F:CGG ATC CAA AAA AAT CAG TTC CGT T,F1-R:AGA ATT CTC ATT ATT GGT TAG ATA CGG TTA C;將擴(kuò)增的F1片段PCR產(chǎn)物用BamHI、EcoRI雙酶切,并回收目的片段,與經(jīng)同樣酶切的pDG1664-CotB連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pDG1664-CotB-F1。

1.4 重組枯草桿菌RCotB-F1的構(gòu)建PstⅠ酶切線性化重組質(zhì)粒pDG1664-CotB-F1,將已經(jīng)制備好的枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞靜置于冰浴融化,加入純化的DNA線性化產(chǎn)物,充分混勻后冰浴30 min,再轉(zhuǎn)入0.2 cm無菌電擊杯中,電轉(zhuǎn)電壓為2 500 V,電轉(zhuǎn)時間為5 ms,次數(shù)1次。電擊完成后立刻加入800μL RM培養(yǎng)基,放置于37℃搖床中200 r/min振搖復(fù)蘇約3 h,涂于含有紅霉素抗性的LB平板,37℃孵箱倒置培養(yǎng)過夜。挑選克隆提取重組菌株基因組,同時以PY-79作為對照。以基因組為模板,用同源臂引物(5′-3′)thr C-F:GAAGGGAACGGTTGGAGC,thrC-R:CGGGAACAGTGACAGAGAAC擴(kuò)增鑒定。將陽性克隆命名為RCotB-F1。

1.5 重組枯草桿菌芽孢的制備及形態(tài)學(xué)鑒定 將鑒定正確的重組菌株RCotB-F1單克隆在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng),再以1∶400轉(zhuǎn)接入DSM培養(yǎng)基,繼續(xù)37℃,200 r/min培養(yǎng)72 h。取各時間段菌液,采用經(jīng)典的Scharffer-Fulton法對枯草芽孢桿菌染色。

1.6 重組芽孢16S rRNA基因序列測定 提取過夜培養(yǎng)的PY-79與RCotB-F1菌液的基因組。再利用TaKaRA 16S rDNA Bacterial Identification Kit說明書的反應(yīng)條件及反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,并切膠回收,將PCR產(chǎn)物送至北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測序。利用同源序列分析軟件MAGE5中將所獲結(jié)果進(jìn)行比較。用生物軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.7 SDS-PAGE及 Western blot鑒定重組菌株表面表達(dá)蛋白 收集經(jīng)60 h培養(yǎng)后的重組芽孢,用終濃度為4 mg/mL的溶菌酶37℃處理15 min,再8 000 r/min離心10 min,棄上清;用1 mL ST buffer重懸菌體,將沉淀均勻混合后靜置于70℃水浴30 min,再8 000 r/min離心10 min。上清即為芽孢的衣殼蛋白溶液。吸取上清進(jìn)行Western Blot鑒定。

1.8 免疫熒光及流式方法鑒定重組菌 收集培養(yǎng)好的重組菌株RCotB-F1及PY-79的芽孢,用PBS洗2次,與本室保存的鼠抗F1抗原多克隆抗體室溫孵育1 h,再8 000 r/min離心1 min,棄上清,用PBST洗芽孢3次,再用PBS重懸芽孢,加入FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG,室溫避光反應(yīng)1 h,再離心收集芽孢,用PBST清洗3次后涂玻片,利用熒光顯微鏡觀察芽孢表面的熒光情況,并同時用流式細(xì)胞儀檢測芽孢的熒光強(qiáng)度。

1.9 ELISA檢測血清抗體水平 將BALB/c小鼠隨機(jī)分為2組,分別為實(shí)驗(yàn)組RCotB-F1和陰性對照組PY-79。按前面步驟離心收集芽孢并純化、計(jì)數(shù)芽孢。每次免疫1.5×1010個芽孢,采取灌胃方式,先連續(xù)免疫3 d,待首次免疫24 d、25 d及26 d后再連續(xù)免疫3 d,之后于距首次免疫第49,50,51 d連續(xù)免疫3 d。分別在免疫前及首次免疫后23 d,48 d,68 d,尾靜脈采血并分離血清備用。用純化的鼠疫F1抗原蛋白4℃過夜包被96孔ELISA板,利用ELISA方法檢測特異性抗體水平。

2 結(jié) 果

2.1 重組菌株RCotB-F1的構(gòu)建 以枯草桿菌PY-79基因組DNA為模板,利用引物CotB-F、CotB-R通過PCR擴(kuò)增的CotB基因,同時以EV76菌的基因組為模板,擴(kuò)增目的基因片段F1;構(gòu)建重組質(zhì)粒pDG1664-CotB-F1,具體構(gòu)建示意圖見圖1。經(jīng)測序證實(shí)序列正確的重組質(zhì)粒pDG1664-CotB-F1經(jīng)PstI酶切,通過電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)入PY-79感受態(tài),利用紅霉素抗性篩選出的重組菌株,提取基因組DNA作為模板,以thr C-F/thr C-R為引物進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果表明,PCR擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的條帶(圖2)。將重組菌株命名為RCotB-F1。

2.2 重組枯草桿菌芽孢的制備及形態(tài)學(xué)鑒定 將重組株RCotB-F1在DSM培養(yǎng)基中37℃200 r/min振搖培養(yǎng)。根據(jù)本研究室前期研究結(jié)果,分別在0 h、24 h、48 h和60 h各時間段取菌液,按照經(jīng)典的Scharffer-Fulton法染色,桿菌染成紅色,成熟芽孢染成綠色。結(jié)果顯示:重組芽孢在60 h時基本全部形成芽孢,形態(tài)特征與野生株基本一致(圖3)。

2.3 重組芽孢16S rRNA基因序列測定 提取重組菌RCotB-F1及PY-79的基因組,擴(kuò)增16S rRNA的全長基因,將PCR回收產(chǎn)物送公司測序,得到部分16S rRNA基因序列,用MAGE5同源序列比較及聚類分析,結(jié)果表明,按照細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹進(jìn)行分類,重組菌株及野生型PY-79菌株都可以歸屬枯草芽孢桿菌屬(見圖4)。研究結(jié)果證實(shí)目的基因F1抗原是通過基因重組的方式整合到枯草桿菌基因組上。

圖1 重組質(zhì)粒pDG1664-CotB-F1構(gòu)建示意圖Fig.1 Constructing sketch map of recombinant plasmid pDG1664-CotB-F1

圖2 重組菌RcotB-F1的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of RCotB-F1

2.4 Western Blot鑒定重組菌株表面表達(dá)蛋白收集并純化重組枯草桿菌芽孢RCotB-F1,用F1抗原特異性多克隆抗體對其進(jìn)行Western Blot鑒定,以PY-79芽孢蛋白為對照,結(jié)果顯示重組芽孢RCotB-F1在預(yù)期條帶處有陽性條帶,而PY-79無條帶(圖5)。表明重組芽孢成功表達(dá)鼠疫F1抗原蛋白。

2.5 免疫熒光及流式方法鑒定重組枯草桿菌芽孢將重組菌RCotB-F1及PY-79芽孢分別與F1抗原特異性多克隆抗體在室溫下反應(yīng)1 h,PBST洗后加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG再孵育1 h,PBST洗3次涂玻片,離心重懸后涂于載玻片上,用在熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示,重組菌在顯微鏡視野可見綠色熒光,而對照組PY-79野生株在熒光顯微鏡視野中不可見綠色熒光(圖6A),同時對經(jīng)免疫熒光標(biāo)記的芽孢進(jìn)行流式檢測,結(jié)果顯示重組芽孢將外源蛋白F1抗原表達(dá)于芽孢表面(圖6B)。

圖3 各時間段枯草桿菌芽胞染色觀察結(jié)果Fig.3 Staining shape of Bacillus subtilis with electron microscopy

圖4 16S rRNA基因序列分析Fig.4 Analysis of Phylogenetie tree based on16S rRNA sequence

2.6 ELISA檢測血清抗體水平 將純化的重組芽孢RcotB-F1及PY-79分別以灌胃的方式免疫BALB/c小鼠,按時間點(diǎn)采集血清并利用ELISA檢測免疫小鼠中產(chǎn)生的抗體IgG滴度。結(jié)果顯示,與PY-79對照組相比,重組芽孢能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度的特異性抗體IgG,具有良好的免疫原性,見圖7。

圖5 重組菌RcotB-F1的Western Blot鑒定Fig.5 Western Blo test of RcotB-F1 protei

圖6A 熒光免疫檢測結(jié)果Fig.6A Immunofluorescence microscope(×200)

圖6B 流式檢測熒光結(jié)果Fig.6B Flow Results of fluorescence

圖7 免疫小鼠血清特異性IgG抗體滴度Fig.7 Detection of IgG antibody titer after immunization

3 討 論

目前疫苗的形式主要分為滅活疫苗、減毒活疫苗以及重組亞單位疫苗等,這些形式的疫苗均要求低溫冷藏運(yùn)輸及保存,使用成本較高,并且由于添加了佐劑不適合長期儲備。因此,探索接種簡單方便、耐熱穩(wěn)定、常溫儲存、使用安全的疫苗是目前疫苗研究的新熱點(diǎn)。

枯草芽孢桿菌的形態(tài)在不同培養(yǎng)條件下可在桿菌及芽孢之間轉(zhuǎn)換,其芽孢可抵抗高溫、酸堿等多種不利環(huán)境。已有文獻(xiàn)證實(shí)利用枯草桿菌芽孢免疫機(jī)體,可刺激機(jī)體局部及全身性的免疫應(yīng)答,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)[3-4]。此外,枯草桿菌芽孢本身具有佐劑活性,無需再添加佐劑成分即可口服免疫。2001年Isticato等[5]首次利用芽孢表面展示破傷風(fēng)毒素片段融合蛋白,直接將重組芽孢口服免疫小鼠,結(jié)果顯示可誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體,說明枯草桿菌芽孢可作為新型疫苗載體誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。此后有文獻(xiàn)報道,將表達(dá)破傷風(fēng)毒素C片段的重組枯草桿菌芽孢凍干,然后長時間保存在常溫條件下,用該疫苗免疫小鼠,仍可使小鼠機(jī)體抵抗致死劑量破傷毒素的攻擊[6]。Ducle H等人[2]用重組CotC-TIFC芽孢注射免疫小鼠,證實(shí)重組CotCTIFC芽孢同時誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的IgG1、IgG2a抗體。國內(nèi)也有關(guān)于基于芽孢CotC防御人華支睪吸蟲病疫苗的研究報道[7-8]。本研究室前期研究結(jié)果也顯示,針對流感病毒M2e保守性抗原建立的枯草桿菌芽孢免疫小鼠不僅誘導(dǎo)產(chǎn)生了有效的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng),也產(chǎn)生了粘膜免疫反應(yīng);并能使免疫小鼠對病毒的感染產(chǎn)生完全的保護(hù)作用[9]。近年來,隨著研究的進(jìn)一步深入,以枯草桿菌芽孢載體為基礎(chǔ)的呈遞型疫苗已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。

枯草桿菌芽孢由芽孢衣、內(nèi)核、皮層及外壁組成,外層的芽孢衣是雙層的包膜結(jié)構(gòu),外層蛋白主要有CotB、CotC、CotG和CotF[10]。研究證實(shí)這些衣蛋白(如CotB、CotC)的缺乏不會引起芽孢性狀明顯的改變,不影響芽孢的形成與出芽[11]。其中CotB基因編碼一個46kD的多肽,CotC是一個分子量僅有8.8kD的小分子量蛋白,而CotG的蛋白由9個富含編碼Lys、Ser、Arg串聯(lián)重復(fù)序列組成[12]?？紤]到蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和基因簡短性,CotB常作為錨定蛋白,將目的抗原展示在枯草桿菌芽孢表面[13]?？莶輻U菌芽孢表面呈遞技術(shù)是將外源抗原基因與芽孢的錨定蛋白通過基因重組的方式融合表達(dá),使融合蛋白展示在芽孢的表面。重組芽孢可通過口服進(jìn)入體內(nèi),誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。

鼠疫是由鼠疫菌引起的自然疫源性烈性傳染病,也是重要的生物恐怖劑及生物戰(zhàn)劑,傳染性強(qiáng),致死率高,在一些地區(qū)可能發(fā)生在動物間及人間存在傳播擴(kuò)大的風(fēng)險[14]。因此,鼠疫疫苗的研究對疾病的預(yù)防起著重要作用[15]。但目前的鼠疫疫苗在保存條件、使用安全性等方面仍然存在一些問題,研究者也一直致力于開發(fā)各種新型疫苗[16]。F1抗原是鼠疫菌主要的毒力因子之一,也是目前已經(jīng)明確的鼠疫保護(hù)性抗原[17],含有多個抗原決定簇,具有較強(qiáng)的抗原性,也是鼠疫疫苗研究設(shè)計(jì)中常用的候選靶抗原之一[18-19],因此F1抗原對鼠疫疫苗的研究有著重要意義。文獻(xiàn)報道,利用F1抗原制備的鼠疫疫苗能有刺激機(jī)體免疫應(yīng)答,有效保護(hù)小鼠抵抗鼠疫菌的攻擊[20-21]。因此,F1抗原常作為鼠疫疫苗研究的免疫靶點(diǎn)。

本研究利用枯草桿菌衣殼蛋白CotB與鼠疫菌F1抗原融合表達(dá)構(gòu)建重組質(zhì)粒;通過同源臂交換基因重組的方式將外源基因整合到PY-79枯草桿菌的基因組上,制備表面展示F1抗原蛋白的重組枯草桿菌芽孢。16S rRNA鑒定重組枯草芽孢桿菌與野生株P(guān)Y-79同樣歸屬枯草芽孢桿菌屬,免疫熒光的結(jié)果顯示呈遞在芽孢表面的融合蛋白仍具有活性。同時,本研究結(jié)果顯示將重組芽孢無佐劑口服免疫小鼠能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的IgG抗體,血清中IgG效價與PY-79對照組相比有顯著的升高。

總之,本研究利用枯草桿菌芽孢為載體,探索發(fā)展了一種耐熱穩(wěn)定、無佐劑口服免疫的新型疫苗技術(shù),該技術(shù)為發(fā)展口服鼠疫疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

利益沖突:無

引用本文格式:郭彥,陳月紅,何 雷,等.表達(dá)鼠疫菌F1抗原的重組芽孢的制備及口服免疫效果觀察[J].中國人獸共患病學(xué)報,2019,35(9):785-790.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.098