劉 毅，尹旻臻，徐 濤，段海燕，程銘恩

(1. 安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，安徽 安慶 246052；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012)

葛根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，來源于豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.) Ohwi的干燥根，具有解肌退熱、透疹、生津止渴等功效[1-2]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，葛根中含有豐富的異黃酮類化合物[3-4]，具有很好的擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，降低心肌耗氧量等藥理活性[4-8]。安徽省是葛根的主產(chǎn)區(qū)之一[9]，尤以大別山區(qū)和皖南山區(qū)產(chǎn)量大[10]。有文獻(xiàn)報(bào)道不同產(chǎn)地的葛根品質(zhì)存在較大差異[11-13]，其中安徽省不同產(chǎn)地的葛根中異黃酮化合物含量差異也較大。在產(chǎn)地調(diào)查過程中，發(fā)現(xiàn)葛根存在兩種類型。一種葛的根系龐大，塊根扭曲，形狀不規(guī)則，纖維較多，藥農(nóng)稱之為“柴性葛”；另一種葛的塊根分枝少，常呈紡錘形，粉性較強(qiáng)，藥農(nóng)稱之為“粉性葛”[14]。其中“粉性葛”并非是粉葛，而是野葛中粉性較強(qiáng)的類型。藥農(nóng)認(rèn)為“粉性根”質(zhì)量較差，而葛根的性狀與其質(zhì)量的相關(guān)性尚不清楚，有必要對“粉性葛”與“柴性葛”進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)。

本研究采用高效液相色譜法同時(shí)測定葛根中3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元的含量，比較安徽省“粉性葛”與“柴性葛”中這6種成分的含量，為安徽地區(qū)葛根品質(zhì)評價(jià)和資源利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀(真空脫氣裝置、二元泵、ALS、TCC、DAD和Chemstation 工作站)：Agilent公司；Agilent Zorbax XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，3.5 μm)：美國Agilent公司；BP211D電子天平：德國Startorius公司；恒溫烘箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；杰瑞爾HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：浙江金壇市杰瑞爾電器有限公司；Milli-Q超純水儀：美國Merck Millipore公司。

1.2 試藥 3′-羥基葛根素(批號 CFN90236，純度≥98%)、葛根素(批號 CFN99169，純度≥98%)、3′-甲氧基葛根素(批號 CFN90780，純度≥98%)、大豆苷(批號 CFN99101，純度≥98%)、大豆苷元(批號 CFN98774，純度≥98%)：武漢天植生物技術(shù)有限公司；葛根素芹菜糖苷(批號 G-021-161019，純度≥98%)：成都瑞芬斯生物科技有限公司；甲醇(色譜純)：美國TEDIA公司。

葛根藥材于2016年12月采集，共26批樣品，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)彭華勝教授鑒定為豆科植物野葛[Puerarialobata(Willd.) Ohwi]的根。選取采挖葛根的粗大部位，45 ℃烘干至恒質(zhì)量，粉碎，過3號篩，干燥保存。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Agilent Zorbax XDB-C18(250 mm×4.6 mm，3.5 μm)色譜柱，柱溫30 ℃，以甲醇(A)-0.2%醋酸水(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～25 min，23% A；25～35 min，23% A→40% A；35～48 min，40% A→65% A；48～50 min，65% A→23% A)，流速0.8 mL/min；檢測波長250 nm，進(jìn)樣量10 μL。對照品與樣品色譜峰見圖1。

注:1. 3′-羥基葛根素;2.葛根素;3. 3′-甲氧基葛根素;4.葛根素芹菜糖苷;5.大豆苷;6.大豆苷元圖1 樣品(A)和對照品(B)的高效液相色譜圖

2.2 對照品及供試品溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 以50%甲醇制備3′-羥基葛根素0.080 mg/mL、葛根素0.16 mg/mL、3′-甲氧基葛根素0.040 mg/mL、葛根素芹菜糖苷0.040 mg/mL、大豆苷0.040 mg/mL、大豆苷元0.005 mg/mL混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取葛根樣品粉末0.1 g，加30%乙醇25 mL，靜置30 min，稱量，加熱回流30 min，冷卻至室溫，再次稱質(zhì)量，用30%乙醇水溶液補(bǔ)足減失的量，取上清液，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 取“2.2.1”項(xiàng)下各混合對照品溶液，以50%甲醇分別稀釋成1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256濃度混合對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)分別進(jìn)樣30 μL注入液相色譜儀，測定其峰面積。分別以3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元的濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(ρ)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(A)，構(gòu)建峰面積與含量的關(guān)系，得線性回歸方程見表1。

表1 各成分的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣分析6次，進(jìn)樣量10 μL，記錄色譜圖。測得3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元峰面積的RSD分別為1.40%、0.22%、1.84%、0.66%、0.53%、1.79%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2”項(xiàng)方法制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL；測得3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元的平均含量分別為1.60、8.95、1.59、1.94、1.84、0.09 mg/g，含量的RSD分別為1.98%、1.55%、1.65%、1.54%、1.84%、2.05%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按“2.2”項(xiàng)方法制備1份供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL，測得3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元峰面積值RSD分別為0.28%、0.43%、0.52%、0.14%、0.33%、1.23%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的葛根樣品粉末(3′-羥基葛根素1.79%、葛根素4.83%、3′-甲氧基葛根素2.28%、葛根素芹菜糖苷1.31%、大豆苷1.32%、大豆苷元0.02%)0.1 g，平行稱取6份，加入一定量的混合對照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法測定，分別計(jì)算各組分加樣回收率[回收率=(實(shí)際測得含量-樣品中含量)/對照品加入量×100%]，并計(jì)算平均值。3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元平均回收率分別為98.6%、103.4%、98.5%、102.1%、105.9%、100.7%，表明該實(shí)驗(yàn)方法具有良好的加樣回收率。

2.4 樣品含量測定 取不同性狀的葛根樣品粉末0.1 g，精密稱定，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，測定混合對照品溶液和供試品溶液，分別記錄3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元的峰面積，運(yùn)用外標(biāo)法計(jì)算其干燥品中含量。結(jié)果見表2。

表2 “粉性葛”與“柴性葛”中6種異黃酮含量測定結(jié)果

注：“*”表示粉性葛根，空白單元格表示未測出含量

2.5 主成分分析 運(yùn)用IBM SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，對不同性狀葛根中6種異黃酮化合物做主成分分析。分析結(jié)果表明，主成分1特征值為4.20，方差貢獻(xiàn)率為59.99%，主成分2特征值為1.17，方差貢獻(xiàn)率為16.72%，主成分1與主成分2累計(jì)貢獻(xiàn)率為75.25%，表明主成分1和主成分2代表了15個(gè)產(chǎn)地的大部分信息。以兩個(gè)主成分得分做散點(diǎn)圖，見圖2。結(jié)果顯示主成分分析能分別將AHNG-2、AHQY、AHNG-3、ANTL、AHNG-1、AHTH-1、AHTH-2、AHSS、AHWJ等聚為一類。

2.6 聚類分析 運(yùn)用IBM SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，“粉性葛”與“柴性葛”樣品中6種異黃酮化合物的含量運(yùn)用歐式距離平方計(jì)算樣品間相似系數(shù)，運(yùn)用Ward法聚類分析，建立系統(tǒng)聚類樹。由圖3可知，當(dāng)距離介于12.50～25.00時(shí)，可以將26個(gè)批次分為2類，AHNG-2、AHQY、AHNG-3、ANTL、AHNG-1、AHTH-1、AHTH-2、AHSS、AHWJ為第一類，AHDZ-3、AHYXQ-2、AHYXQ-1、AHYX、AHST-1、AHST-2、AHZY、AHDZ-1、AHQM-2、AHHS-2、AHQM-1、AHGM-2、AHGM-3、AHDZ-2、AHTC、AHJX、AHMG-1為第二類。因此2類得以區(qū)分。從聚類分析結(jié)果可以看出其與主成分分析結(jié)果具有一致性。

圖2 “粉性葛”與“柴性葛”中6種異黃酮含量主成分分析圖

圖3 聚類分析樹狀圖

3 討論

3.1 提取條件的優(yōu)化 本研究對超聲波提取法與加熱回流提取法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明加熱回流提取法所得的異黃酮類成分提取率較高，故選用加熱回流提取法。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了不同提取溶劑、不同料液比、不同提取時(shí)間，發(fā)現(xiàn)以30%乙醇溶液為提取溶劑，采用250倍量，加熱回流30 min，可充分將異黃酮類成分提取，說明該提取條件簡便、合理、可行。

3.2 檢測波長的選擇 取3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元的對照品溶液，用紫外分光光度計(jì)測定，于190～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果6種異黃酮成分在250 nm處有最大吸收。因此，將檢測波長設(shè)定為250 nm。

3.3 流動(dòng)相的選擇 對甲醇-0.1%醋酸水、甲醇-0.2%醋酸水、甲醇-0.5%醋酸水的流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行考察，結(jié)果表明，甲醇-0.2%醋酸水能達(dá)到分離度的要求，分離時(shí)間合適，最后確定流動(dòng)相為甲醇(A)-0.2%醋酸水(B)，梯度洗脫(0～25 min，23% A；25～35 min，23% A→40% A；35～48 min，40% A→65% A；48～50 min，65% A～23% A)。

3.4 樣品測定結(jié)果分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，安徽省不同產(chǎn)地之間葛根中各成分含量差異較大。實(shí)驗(yàn)中所測定的15個(gè)產(chǎn)地的葛根樣品存在兩種性狀類型：一種纖維性較強(qiáng)，當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)稱之為“柴性葛”；另一種粉性較強(qiáng)，當(dāng)?shù)胤Q之為“粉性葛”。“柴性葛”與“粉性葛”均來自豆科植物野葛[Puerarialobata(Willd.) Ohwi]，僅在根的粉性強(qiáng)弱上有差異?！胺坌愿稹钡姆坌悦黠@較“柴性葛”高，且多為短粗的紡錘形，性狀上易與“柴性葛”區(qū)分。

安徽省15個(gè)產(chǎn)地中，產(chǎn)于安徽寧國、青陽、太湖、銅陵、望江、宿松的葛根為“粉性葛”類型，異黃酮類成分含量較低，其葛根素含量低于《中華人民共和國藥典》規(guī)定的2.40%。同為“柴性葛”的類型中，其不同產(chǎn)地“柴性葛”異黃酮含量亦有明顯差異，如安徽明光地區(qū)的葛根中葛根素含量約8.11%，而安徽宿松地區(qū)的葛根中葛根素含量約0.52%，其差異可能受產(chǎn)地因素影響。基于含量測定結(jié)果，采用主成分分析和聚類分析對“粉性葛”與“柴性葛”進(jìn)行分析，結(jié)果表明“粉性葛”與“柴性葛”可以在含量成分上進(jìn)行區(qū)分。因此在臨床用藥時(shí)除了需要關(guān)注葛根的產(chǎn)地，同時(shí)需要關(guān)注葛根的性狀。

葛根為藥食兩用中藥，由于葛根的需求量巨大，野生資源逐漸減少?？紤]到“柴性葛”與“粉性葛”不僅粉性上有差異，其所含的異黃酮化合物含量也有明顯差異。因此建議食用葛根時(shí)應(yīng)選“粉性葛”，以合理利用其根中豐富的淀粉[15]，而藥用的葛根應(yīng)選用“柴性葛”，以充分利用其豐富的異黃酮化合物含量。