余 壘，朱新儒，曾 穎，李 雄，張海德

（海南大學(xué)食品學(xué)院，海南海口570228）

離子液體（ILs）是一種完全由離子組成，在室溫或者接近室溫下呈液體狀態(tài)的低溫熔融鹽，是一類新型的綠色溶劑，近年來已在化工反應(yīng)、環(huán)境保護(hù)、制備新型材料等方面獲得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展［1］，但常見的咪唑型、吡啶型離子液體昂貴的價格在一定程度上也限制了它們的應(yīng)用范圍，而價格較低的季銨型離子液體具有制備簡單、電導(dǎo)率高、熔點(diǎn)低、熱穩(wěn)定性和電化學(xué)穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，越來越得到廣大研究者的關(guān)注［2-3］。

聚乙二醇（PEG）具有很高的生物降解性、低毒、低熔點(diǎn)、低成本等優(yōu)點(diǎn)，通常被用作雙水相系統(tǒng)中的一種成相劑［4］，但是，富含PEG的一相較低的極性及PEG本身只能通過改變相對分子質(zhì)量或分子結(jié)構(gòu)的這種特點(diǎn)限制了它的應(yīng)用范圍［5］。為突破這種局限，R.C.S de Sousa 等［6］研究了不同離子液體作為助劑對PEG-鹽雙水相系統(tǒng)分離生物分子分配行為的影響，得出離子液體作為助劑能改變共存相的特性和生物分子的分配行為，且更適合于分離疏水性較高的生物分子；S.Hamzehzadeh等［7］研究了1-丁基3-甲基咪唑溴化物離子液體作為輔助劑對PEG-磷酸鹽成相面積的影響，得出添加5%的離子液體為輔助劑增大了PEG400-磷酸鹽和PEG600-磷酸鹽雙水相的成相面積，且得出離子液體與富含PEG的上相具有更好的親和性的結(jié)論；R.L.de Souza等［8］研究了使用離子液體作為助劑萃取分離兩種探針染料，增加了雙水相區(qū)域的面積，離子液體的存在改變了染料在雙水相體系的分配系數(shù)，使得探針染料富集于PEG相，并得出離子液體與疏水相間存在更強(qiáng)烈的相互作用的結(jié)論；I.V.Lucena等［9］通過添加5%質(zhì)子型離子液體為PEG-硫酸銨雙水相系統(tǒng)的輔助劑，大大增加了辣根過氧化酶的純化效果；S.Hamzehzadeh 等［10］通過在 PEG400-檸檬酸鉀雙水相體系中加入5%的［Bmim］Br，發(fā)現(xiàn)L-色氨酸的萃取效率得到了明顯提高；A.M.Ferreira等［11］通過分別添加5%咪唑型和季銨型離子液體為PEG-檸檬酸鉀雙水相體系的輔助劑，與不含離子液體的雙水相體系相比，富含PEG相中免疫球蛋白G的純度增加了37%；H.Yang等［5］通過添加4%不同咪唑型離子液體為PEG600-NaH2PO4·2H2O雙水相體系的輔助劑，提高了L-苯丙氨酸的萃取效率。

本文合成了季銨型離子液體［N2，2，2，2］BF4，并對其進(jìn)行1H NMR表征和純度驗(yàn)證。通過研究加入少量的［N2，2，2，2］BF4對 PEG-NaH2PO4·2H2O 雙水相系統(tǒng)成相面積的影響，旨在尋找一種低成本有效的雙水相體系，該體系將適合在常溫下較穩(wěn)定的親水性生物活性物質(zhì)的分離純化研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

PEG400、PEG600、PEG2000、PEG4000、PEG6000，均為化學(xué)純；NaH2PO4·2H2O、三乙胺、溴乙烷等，均為分析純。

雙束紫外可見分光光度計(jì)（TU-1901）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000A）；節(jié)能型智能恒溫槽（DC-1006）；恒溫磁力攪拌器（85-1）；離心機(jī)（CenceL500）；油浴鍋（DF-2A）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-8）；核磁共振儀（DP-FD-CNMR-I）；全自動水分測定儀（KF-4）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 兩步法合成季銨型離子液體［N2，2，2，2］BF4

1）合成中間體［N2，2，2，2］Br。 在 250 mL 圓底燒瓶內(nèi)加入 0.1 mol的乙腈（ACN），0.2 mol的三乙胺，用恒壓滴液漏斗加入0.2 mol的溴乙烷，常溫密閉反應(yīng)72 h，抽濾，置于真空干燥箱干燥48 h得到中間體產(chǎn)物［N2，2，2，2］Br。 合成路線見圖1。

圖1 ［N2，2，2，2］Br合成路線

2）以中間體［N2，2，2，2］Br為反應(yīng)物合成季銨型離子液體［N2，2，2，2］BF4。 在 250 mL 圓底燒瓶內(nèi)加入 0.1 mol［N2，2，2，2］Br和 0.11 mol NaBF4，加入100 mL乙腈溶劑，裝好冷凝回流裝置，油浴鍋溫度設(shè)置為80℃，冷凝回流6 h，抽濾，除去下層沉淀；然后將溶液于60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)蒸干，得白色晶體，此為粗目標(biāo)產(chǎn)物；然后向燒瓶內(nèi)加入80 mL異丙醇，油浴鍋溫度設(shè)置為120℃，冷凝回流，待燒瓶內(nèi)固體全部溶解，停止重結(jié)晶，抽濾得白色針狀濕品［N2，2，2，2］BF4，重復(fù)上述步驟，進(jìn)行二次重結(jié)晶；真空干燥48 h，進(jìn)行純度檢測，待固體質(zhì)量不再變化，稱重，計(jì)算產(chǎn)率。合成路線見圖2。

圖2 ［N2，2，2，2］BF4合成路線

產(chǎn)率計(jì)算公式見式（1）:

式中:X為產(chǎn)率，%；Wa為實(shí)際產(chǎn)物量，g；Wp為理論產(chǎn)物量，g。

3）［N2，2，2，2］BF4的結(jié)構(gòu)表征。 用 95%的氘代二甲基亞砜溶劑和5%的四甲基硅烷（TMS）溶解［N2，2，2，2］BF4，由核磁共振儀對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

4）［N2，2，2，2］BF4水溶液標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制及純度的檢測。 準(zhǔn)確稱量［N2，2，2，2］BF4標(biāo)準(zhǔn)樣品0.01 g，在容量瓶中定容到100 mL，得到質(zhì)量濃度為100 mg/L 的［N2，2，2，2］BF4標(biāo)準(zhǔn)樣品水溶液，將其分別稀釋至 10、20、30、40、50、60、70、80、90 mg/L，以去離子水為參比，在190～300 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定［N2，2，2，2］BF4水溶液在紫外光區(qū)的最大吸收波長，并以離子液體水溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［12］；準(zhǔn)確稱量實(shí)驗(yàn)室自制的［N2，2，2，2］BF4離子液體，用去離子水稀釋配成不同濃度的［N2，2，2，2］BF4水溶液，以去離子水為參比，測定最大吸收波長處的吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得 ［N2，2，2，2］BF4離子液體的實(shí)際濃度，計(jì)算所得實(shí)際濃度與理論配制濃度之比，即可得到該離子液體的純度。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

以［N2，2，2，2］Br的物質(zhì)的量、乙腈用量及反應(yīng)時間 3 個因素為研究對象，以［N2，2，2，2］BF4的產(chǎn)率為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

為獲得合成 ［N2，2，2，2］BF4的最佳工藝條件，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以［N2，2，2，2］BF4的產(chǎn)率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 相圖的繪制

在25℃條件下采用濁點(diǎn)法［13］繪制雙水相體系相圖。制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 4%的［N2，2，2，2］BF4原溶液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%不同相對分子質(zhì)量的PEG原溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的NaH2PO4·2H2O原溶液，備用。分別稱量一定質(zhì)量的 PEG 原溶液及［N2，2，2，2］BF4溶液于試管中，邊振蕩邊逐滴滴加鹽溶液，直至混合液剛好出現(xiàn)混濁，接著逐滴滴加蒸餾水，直至混合液變澄清，重復(fù)上述操作。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均質(zhì)量。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)求平均值，采用origin8.5處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ［N2，2，2，2］BF4的 1H NMR 及純度分析

用95%的氘代二甲基亞砜溶劑和5%的TMS溶解［N2，2，2，2］BF4，由核磁共振儀對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，所得結(jié)果如圖3所示；由紫外分光光度計(jì)測得標(biāo)準(zhǔn) ［N2，2，2，2］BF4溶液的紫外吸收光譜圖及標(biāo)準(zhǔn)［N2，2，2，2］BF4溶液濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4和圖5所示。

由圖3可知，δ=2.47～2.53為溶劑峰，在1H NMR中對譜圖峰進(jìn)行了歸屬［14］，數(shù)據(jù)如下:δ=1.01～1.31為—CH2—CH3甲基上的 12個氫，δ=3.03～3.39為—CH2—N—乙基上的8個氫，兩個峰面積的比值為1.45∶1≈3∶2 與理論值符合，說明目標(biāo)化合物［N2，2，2，2］BF4結(jié)構(gòu)正確。

圖3 ［N2，2，2，2］BF4的核磁氫譜圖

圖4 ［N2，2，2，2］BF4水溶液的紫外吸收光譜圖

由圖4 可知，［N2，2，2，2］BF4離子液體水溶液在190～300 nm之間有單一吸收峰，最大吸收波長在205 nm處附近。因此在該最大吸收波長上利用紫外分光光度計(jì)測定離子液體的濃度符合朗伯-比耳光吸收定律，可獲得較高的準(zhǔn)確性［12］。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)［N2，2，2，2］BF4水溶液濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖5所示，線性標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程為y=0.01057x+0.02677，相關(guān)系數(shù)R2=0.9987，由此判斷此標(biāo)準(zhǔn)曲線可用來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室自制［N2，2，2，2］BF4離子液體濃度檢測。分別配制30、70、100 mg/L的實(shí)驗(yàn)室自制［N2，2，2，2］BF4溶液，測得的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得離子液體的純度分別為:98.46%、98.51%、98.48%，經(jīng)過與AgNO3反應(yīng)，未發(fā)現(xiàn)任何沉淀，由此可知，實(shí)驗(yàn)合成的離子液體純度較高［15］，經(jīng)真空干燥后通過KF-4型全自動水分測定儀測定［N2，2，2，2］BF4的含水量， 使含水量在使用前保持在 6×10-4以內(nèi)。

2.2 合成［N2，2，2，2］BF4的單因素與正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.2.1 ［N2，2，2，2］Br的物質(zhì)的量對產(chǎn)率的影響

固定NaBF4的量為1.1 mol不變，乙腈用量為100 mL，反應(yīng)時間為6 h，反應(yīng)溫度為80℃，考察［N2，2，2，2］Br的不同物質(zhì)的量對產(chǎn)率的影響。當(dāng)反應(yīng)物［N2，2，2，2］Br的物質(zhì)的量小于 1.0 mol時，反應(yīng)產(chǎn)率呈上升趨勢；當(dāng)反應(yīng)物［N2，2，2，2］Br的物質(zhì)的量等于1.0 mol時，反應(yīng)產(chǎn)率達(dá)到高值，為89.9%；當(dāng)反應(yīng)物［N2，2，2，2］Br的物質(zhì)的量大于 1.0 mol時，反應(yīng)產(chǎn)率呈下降趨勢，而且，過量的［N2，2，2，2］Br會導(dǎo)致生成雜質(zhì)產(chǎn)物NaBr，并且很難處理［16］。所以，最終選擇［N2，2，2，2］Br的物質(zhì)的量為 1.0 mol。

2.2.2 乙腈用量對產(chǎn)率的影響

固定 ［N2，2，2，2］Br 的 物 質(zhì) 的 量為 1.0 mol、NaBF4的量為1.1 mol不變，反應(yīng)時間為6 h，反應(yīng)溫度為 80 ℃，考察不同乙腈用量對［N2，2，2，2］BF4產(chǎn)率的影響。當(dāng)反應(yīng)物乙腈的用量小于100 mL時，反應(yīng)產(chǎn)率呈上升趨勢；當(dāng)反應(yīng)物乙腈用量為100 mL時，反應(yīng)產(chǎn)率達(dá)到最高，為90.4%；當(dāng)反應(yīng)物乙腈的用量大于100 mL時，反應(yīng)產(chǎn)率呈下降趨勢，說明溶劑的量對離子液體產(chǎn)率影響較大［17］。綜合比較，最終選擇乙腈的用量為100 mL。

2.2.3 反應(yīng)時間對產(chǎn)率的影響

固定 ［N2，2，2，2］Br的物質(zhì)的量為 1.0mol、NaBF4的量為1.1 mol不變，溶劑的量為100 mL，反應(yīng)溫度為 80 ℃，考察不同反應(yīng)時間對［N2，2，2，2］BF4產(chǎn)率的影響。當(dāng)反應(yīng)時間小于8 h時，反應(yīng)產(chǎn)率呈上升趨勢；當(dāng)反應(yīng)時間為8 h時，反應(yīng)產(chǎn)率達(dá)到最高，為91.2%；當(dāng)反應(yīng)時間大于8 h時，反應(yīng)產(chǎn)率呈下降趨勢。而且，過短或者過長的反應(yīng)時間都會對反應(yīng)產(chǎn)率的結(jié)果造成不利的影響，綜合比較，最終選擇的反應(yīng)時間為8 h。

2.2.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與極差分析

根據(jù)不同單因素對產(chǎn)率的影響結(jié)果，以原料配比（A）、溶劑用量（B）、反應(yīng)時間（C）為因素，以［N2，2，2，2］BF4的產(chǎn)率為指標(biāo)，采用 L9（34）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化［N2，2，2，2］BF4產(chǎn)率的最佳影響條件。影響［N2，2，2，2］BF4產(chǎn)率的因素水平表見表 1，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與極差分析表見表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與極差分析表

由表2可知，反應(yīng)條件的選擇對產(chǎn)品收率有明顯的影響，產(chǎn)率可由59.7%提高至89.8%。通過極差分析可以得出:影響該反應(yīng)的最主要的因素是反應(yīng)時間，此外四乙基溴化銨與四氟硼酸鈉的物質(zhì)的量比和溶劑用量對產(chǎn)率也有不同程度的影響；其中，溶劑用量影響最小。最佳反應(yīng)條件為:A1B1C2，即n（［N2，2，2，2］Br）∶n（NaBF4）為 1∶1.1，溶劑 用量為100 mL，反應(yīng)時間為8 h。選擇該反應(yīng)條件做3次平行實(shí)驗(yàn)，最終得到［N2，2，2，2］BF4的產(chǎn)率為（90.70±4.0）%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正交實(shí)驗(yàn)篩選出的最佳合成條件可操作性強(qiáng)，重復(fù)性好，適用于季銨型離子液體［N2，2，2，2］BF4的合成。

2.3 相圖的繪制與雙節(jié)點(diǎn)數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)

2.3.1 相圖的繪制

由濁點(diǎn)法［13］繪制雙水相的相圖，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，隨著PEG相對分子質(zhì)量的增加，雙水相區(qū)域逐漸增大，這主要是因?yàn)樵赑EGNaH2PO4·2H2O雙水相系統(tǒng)中，由于靜電斥力的作用，PEG相對分子質(zhì)量的增大使得體系中水化離子與PEG分子間的水不溶性增強(qiáng)，PEG的疏水性隨著相對分子質(zhì)量的增大而增強(qiáng)。相同聚乙二醇濃度的條件下，聚乙二醇的相對分子質(zhì)量越大，雙水相成相所需的 NaH2PO4·2H2O含量越少，雙水相相圖越靠近原點(diǎn)［14］。所以，各相對分子質(zhì)量的PEG成相能力由大到小分別為:PEG6000+4%IL（IL代表［N2，2，2，2］BF4）、PEG4000+4%IL、PEG2000+4%IL、PEG6000、PEG4000、PEG2000、PEG600+4%IL、PEG600、PEG400+4%IL、PEG400。 由此可知，PEGNaH2PO4·2H2O雙水相系統(tǒng)加入4%具有疏水性的［N2，2，2，2］BF4，能夠替代雙水相中的部分 PEG，增加雙水相區(qū)域的面積，擴(kuò)大成相劑成相的選擇范圍［9］。 J.B.Pereira 等［18］的研究結(jié)果也表明，離子液體自身的疏水性是雙水相成相的驅(qū)動力。

圖6 25℃下三元與四元體系組成的雙水相體系的相圖

2.3.2 相圖數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)

近年來，Merchuk方程已成功應(yīng)用于PEG/鹽和離子液體/鹽雙水相雙節(jié)點(diǎn)數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)。Merchuk經(jīng)驗(yàn)方程形式簡潔，比Pitzer、Cabezas等半經(jīng)驗(yàn)半理論熱力學(xué)模型具有更廣泛的實(shí)際應(yīng)用價值［19］。

由Merchuk方程［20］對相圖數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，結(jié)果見表3和表4。Merchuk方程如式（2）所示。

式中:Y和X分別代表PEG和NaH2PO4·2H2O的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；A，B和C為通過回歸方程得到的常數(shù)。

表3 25℃下通過Merchuk方程獲得的PEG-NaH2PO4·2H2O體系的標(biāo)準(zhǔn)偏差及決定系數(shù)R2

通過非線性擬合得出的相關(guān)系數(shù)A、B和C由標(biāo)準(zhǔn)偏差σ及決定系數(shù)R2對其進(jìn)行評估，由表3和表4可知，R2接近于1，關(guān)聯(lián)度很好，這表明，所有相圖實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)能很好地適用于Merchuk方程，為后續(xù)的雙水相體系的選擇與優(yōu)化奠定了理論基礎(chǔ)。

表4 25℃下通過Merchuk方程獲得的PEG-NaH2PO4·2H2O-4%［N2，2，2，2］BF4體系的標(biāo)準(zhǔn)偏差及決定系數(shù) R2

3 結(jié)論

通過單因素及正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)合成了［N2，2，2，2］BF4，經(jīng)1H NMR譜圖分析得知其結(jié)構(gòu)正確；通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得知，實(shí)驗(yàn)室合成的［N2，2，2，2］BF4純度較高，產(chǎn)率為 90.7%；通過研究添加 4%的［N2，2，2，2］BF4對 PEG-NaH2PO4·2H2O雙水相成相面積的影響可知，隨著PEG相對分子質(zhì)量的增加，成相面積逐 漸增加，其 中 ，PEG6000-NaH2PO4·2H2O-4%［N2，2，2，2］BF4雙水相的成相面積達(dá)到最大， 有利于后續(xù)雙水相成相體系的選擇。通過對相圖數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合得出，決定系數(shù)R2接近于1，關(guān)聯(lián)度很好；與離子液體-鹽雙水相體系相比，PEG-鹽-離子液體雙水相體系在一定程度上減少了成本，為后續(xù)雙水相分離純化生物分子奠定了理論基礎(chǔ)。