張曉南 普 楠 張瀟元 吳長(zhǎng)玲 施 珩 王中江 江連洲，3 楊秋萍，3*

（1東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 哈爾濱 150030

2黑龍江省學(xué)勤科技有限公司 哈爾濱 150030

3黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院 哈爾濱 150028）

大豆異黃酮是黃酮類(lèi)化合物的一種，是大豆生長(zhǎng)代謝中產(chǎn)生的次級(jí)活性物質(zhì)。大豆生長(zhǎng)的過(guò)程伴隨著大豆異黃酮的形成過(guò)程。由于大豆異黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)和人體雌性激素的化學(xué)結(jié)構(gòu)非常相似，因此大豆異黃酮又被稱(chēng)為植物雌激素。有研究表明：長(zhǎng)期定量的攝入大豆異黃酮可調(diào)節(jié)體內(nèi)的雌激素含量，使其保持一個(gè)正常的范圍，從而達(dá)到抗衰老的功效。服用大豆異黃酮也可以預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松、動(dòng)脈血管硬化等病癥[3]。純度高的大豆異黃酮粉末一般呈淺黃色或米白色，有苦澀味[1]。由于大豆異黃酮化學(xué)結(jié)構(gòu)上具有特殊的疏水性，因此它的水溶性非常差。這直接導(dǎo)致大豆異黃酮原粉的生物利用度極低，嚴(yán)重影響人體的吸收和利用。

目前制備藥物微粉的傳統(tǒng)工藝包括氣流破碎法、球磨研磨法、沉淀法以及超臨界流體法等[4]。純機(jī)械破碎的方法效率低，能耗大，污染重，生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)人體健康造成危害，同時(shí)也對(duì)環(huán)境造成一定程度的污染。超臨界流體法雖然污染小，但設(shè)備造價(jià)與維修費(fèi)用高昂，制得的納米顆粒收率低且不易于工業(yè)化。

反溶劑重結(jié)晶法[5-6]是制備生物活性粉體的一種重要方法，其原理是：將藥物溶解后，通過(guò)調(diào)節(jié)一定的物理?xiàng)l件，將藥物釋放到其不溶解的反向溶劑中，阻止藥物晶核的生長(zhǎng)和團(tuán)聚，通過(guò)干燥最終得到小粒徑的納米粉體[9-10]。用這種方法制備的納米粉體生物利用度有較大的提高[7-8]。反溶劑重結(jié)晶技術(shù)與傳統(tǒng)制備工藝相比具有更好的前景[11-14]，其對(duì)環(huán)境友好，工藝操作相對(duì)簡(jiǎn)便，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。目前已有多種難溶性口服藥物通過(guò)此方法提高了生物利用度[15-17]。

本試驗(yàn)中先采用單因素的方法進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，得到初步試驗(yàn)結(jié)果后，再通過(guò)正交軟件設(shè)計(jì)因素和水平，優(yōu)化反溶劑制備過(guò)程，最終制得顆粒均勻，分散性較好且生物利用度較高的大豆異黃酮納米粉。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

圖1 大豆異黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structural formula of isoflavone

市售食品級(jí)大豆異黃酮（純度80%），河南嘉致化工產(chǎn)品有限公司；二甲基亞砜（分析純），天津天力化學(xué)試劑有限公司；丙酮（分析純），天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器和設(shè)備

磁力攪拌機(jī)（MS-H280-Pro），Dragonlab 公司；蠕動(dòng)泵（KCP-B08G），Kamoer公司；干燥箱（DHP-9052），一恒科學(xué)儀器有限公司；電子天平（BP-622B），上海奔普儀器科技有限公司；循環(huán)水真空泵（SHZ-III），上海亞榮生化儀器廠(chǎng)。

1.3 反溶劑重結(jié)晶

反溶劑重結(jié)晶法是制備生物活性粉體的一種常用手段，原理為：在兩種體系的（溶劑與反溶劑）混合過(guò)程中，一定條件下的生物質(zhì)溶液會(huì)形成過(guò)飽和度，然后經(jīng)過(guò)成核、結(jié)晶、重組一系列環(huán)節(jié)組成納米粒子。驅(qū)動(dòng)這個(gè)過(guò)程的主要因素是過(guò)飽和度的程度以及形成速度，此外，在此過(guò)程中重組而形成的納米粒子特征（形貌、晶型、粒徑等）顯著的依賴(lài)于產(chǎn)生過(guò)飽和度的程度和穩(wěn)定性。

1.4 反溶劑重結(jié)晶過(guò)程

配制不同濃度的大豆異黃酮-二甲基亞砜溶液，啟動(dòng)反溶劑裝置，裝置中的真空泵產(chǎn)生負(fù)壓將溶液通過(guò)高壓噴嘴傳送至無(wú)水丙酮（反溶劑溶液）中，此時(shí)均質(zhì)機(jī)以1 000 r·min-1的速度在兩相溶液中快速攪拌；經(jīng)過(guò)充分的攪拌混合，兩相溶液立刻產(chǎn)生大量的乳白色的絮狀沉淀物，采用負(fù)壓抽濾的方式收集這些反溶劑結(jié)晶，用20 mL無(wú)水丙酮洗脫結(jié)晶體上的溶劑殘留3次，收集并干燥結(jié)晶體，最終得到疏松、流動(dòng)性較好的納米大豆異黃酮粉。

1.5 采用正交試驗(yàn)優(yōu)化參數(shù)

使用latin軟件對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行L9（34）設(shè)計(jì)，考察的因素包括：反應(yīng)時(shí)間，體積比，轉(zhuǎn)速和濃度，以微粉的粒徑為考察指標(biāo)（見(jiàn)表1）。

表1 影響因素及水平Table 1 Influencing factors and corresponding levels

1.6 掃描電鏡（SEM）

取適量樣品用雙面導(dǎo)電膠帶粘于觀(guān)察臺(tái)中央，置于離子濺射儀的樣品艙中，15 mA的電流下噴金處理，通過(guò)掃描電鏡（JSM-6360LV，JEOL，日本）觀(guān)察粒子的外觀(guān)形貌并計(jì)算平均尺寸。

1.7 差示量熱（DSC）檢測(cè)

按照李旺等[15]處理方法，對(duì)儀器溫度校準(zhǔn)后，將樣品置于樣品池，稱(chēng)重后置入儀器樣品座檢測(cè)分析。通氮?dú)馑俾蕿?0 mL/min，升溫速率10℃/min，設(shè)定溫度的范圍25～300℃。

1.8 紅外光譜（FT-IR）檢測(cè)

本研究使用KBr作為分散劑，采用壓片法制備待測(cè)固體試樣。將原粉與納米粉分別和KBr粉混合后充分研磨均勻，在低真空（3 mmHg）下用油壓機(jī)加壓（8 T/cm2）5 min 壓片，得到厚度約為 1～2 mm的透光圓形薄片，將薄片致于紅外干燥箱中干燥2 min后在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外掃描分析。

1.9 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)都進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，并將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行誤差分析。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、相關(guān)性和差異顯著性分析；采用Origin 9軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與檢測(cè)

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)以四因素三水平共9個(gè)試驗(yàn)建立，以 A 反應(yīng)時(shí)間（min），B 體積比，C 轉(zhuǎn)速（r/min），D質(zhì)量濃度（mg/mL）為因素，各自確定3個(gè)水平來(lái)建立正交試驗(yàn)體系。試驗(yàn)結(jié)果以微細(xì)顆粒的粒徑來(lái)體現(xiàn)。

通過(guò)正交試驗(yàn)表格可以分析出：對(duì)粒徑影響程度由大到小的因素分別為A（反應(yīng)時(shí)間）＞C（轉(zhuǎn)速）＞D（濃度）＞B（體積比），試驗(yàn)結(jié)果在條件 A2，B1，C3，D3下試驗(yàn)結(jié)果為最佳。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment design and results

2.2 掃描電鏡（SEM）分析

通過(guò)掃描電鏡可以很好地觀(guān)測(cè)納米粒子的形貌特征和尺寸。圖2a為大豆異黃酮原粉，可以看出未經(jīng)制備的原粉形態(tài)不規(guī)則、粉體呈現(xiàn)大塊狀，比表面積較小、粉體粒徑大小在幾微米至幾十微米不等，這樣的粒子往往水溶性較差；而制備后的（圖2b）異黃酮納米粒子相對(duì)均勻統(tǒng)一、粒子的形態(tài)較為規(guī)則、呈現(xiàn)出圓球狀，平均直徑低于200 nm。粒子的平均比表面積較大，制備后的圖2b納米粉與圖2a原粉相比，具有較大的比表面積。

圖2 制備前后大豆異黃酮粉的掃描電鏡觀(guān)測(cè)結(jié)果Fig.2 SEM testing of processed and unprocessed isoflavone

2.3 DSC分析

如圖3所示為DSC吸熱曲線(xiàn)，分別檢測(cè)了大豆異黃酮原粉和納米粉的樣品，原粉的吸熱峰分別在104，162℃處，納米粉的吸熱峰則在88℃和147℃處出現(xiàn)，制備后的粉體對(duì)應(yīng)的峰值小于異黃酮原粉峰值，這證實(shí)了納米粉的熔點(diǎn)較原粉低，這是由于穩(wěn)定型的結(jié)晶擁有更高的熔點(diǎn)，亞穩(wěn)定型結(jié)晶的熔點(diǎn)變低導(dǎo)致。

2.4 紅外光譜（FT-IR）分析

圖3 制備前后大豆異黃酮粉的DSC光譜分析Fig.3 DSC spectra of processed and unprocessed isoflavone

通過(guò)FT-IR檢測(cè)可知，制備前后的兩種異黃酮樣品的紅外譜圖的峰形基本一致，出峰時(shí)間也相差不大（圖4），制備前、后的兩種粉體有著大致相同的紅外吸收峰位置，制備后的微粉峰高略大，但二者均為結(jié)晶型顆粒。這說(shuō)明經(jīng)過(guò)反溶劑重結(jié)晶法制得的粉體其化學(xué)結(jié)構(gòu)并沒(méi)有發(fā)生改變，這與胡婷婷等[18]的研究結(jié)果一致。

圖4 制備前后大豆異黃酮粉的傅里葉紅外光譜分析Fig.4 FT-IR spectrascopy of processed and unprocessed isoflavone

2.5 堆密度測(cè)試

通過(guò)堆密度測(cè)試比較說(shuō)明：在質(zhì)量相同的情況下，異黃酮納米粉（a）的體積幾乎是原粉（b）的2～3倍；制備后的異黃酮納米粉比表面積有較大的增加，粉體變得疏松均勻，而且流動(dòng)性也變得更好。質(zhì)量不變但體積改變后，制備后的異黃酮密度變小，其水溶性較之前得到了極大的提高。

圖5 堆密度分析制備前后的大豆異黃酮粉體Fig.5 The bulk density of processed and unprocessed isoflavone

2.6 不同試驗(yàn)因素對(duì)微粉粒徑的影響分析

2.6.1 反應(yīng)時(shí)間 隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，粒徑變化呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。反應(yīng)初期，由于奧斯瓦爾德熟化效應(yīng)，小粒子在反溶劑體系下發(fā)生相互碰撞，團(tuán)聚生長(zhǎng)成為分子群和復(fù)分子群；隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，和攪拌體系的高速運(yùn)轉(zhuǎn)，粒徑大小逐漸降低并趨于平衡；溶劑的析出有利于阻止小粒徑的粒子團(tuán)聚，最終趨于穩(wěn)定[19]。

2.6.2 溶劑反溶劑體積比 由表2看出，當(dāng)溶劑與反溶劑體積比達(dá)到1∶6時(shí)，得到的微粉粒徑是208 nm。我們進(jìn)行了補(bǔ)充試驗(yàn)（試驗(yàn)條件：溶劑反溶劑體積比 V（DMSO）∶V（丙酮）為 1∶7 與 1∶8，溶液初始質(zhì)量濃度為300 g/L，攪拌轉(zhuǎn)速為1 200 r/min），所得的大豆異黃酮的平均粒徑為219 nm與250 nm，與溶劑比為1∶6條件下制得的樣品粒徑相近，因此選取的最佳溶劑比例為1∶6；這與劉志勝等[16]研究中所述內(nèi)容相符。

2.6.3 攪拌轉(zhuǎn)速在反溶劑重結(jié)晶試驗(yàn)體系中，攪拌速度與粒子成核大小是呈反比的。提高攪拌速率，會(huì)導(dǎo)致粒子在溶液內(nèi)部較快運(yùn)動(dòng)，形成向心力，做有規(guī)律的離心運(yùn)動(dòng)，從而減小粒子發(fā)生碰撞的機(jī)會(huì)；這一現(xiàn)象有效抑制了分子群的形成，抑制了粒子粒徑的生長(zhǎng)，從而獲得較小的粒徑生成。因此經(jīng)對(duì)比分析，文中所選取的最佳攪拌轉(zhuǎn)速為1 200 r/min。

2.6.4 大豆異黃酮溶液濃度 提高溶液濃度可使反溶劑體系生成的晶核臨界半徑減小，提高晶核生成的速率，使晶體數(shù)量增多，生成小晶粒[15]。由表2數(shù)據(jù)可知：當(dāng)原料大豆異黃酮溶液質(zhì)量濃度為300 mg/mL時(shí)，得到的粒徑達(dá)到最小值208 nm。在相同條件下重復(fù)試驗(yàn)2次，得到的粒徑分別為205 nm和256 nm，因此，選取最佳大豆異黃酮溶液初始質(zhì)量濃度為300 mg/mL。

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)樣品平均粒徑的影響Fig.6 Effect of precipitation time on the average particle size

圖7 溶劑反溶劑體積比對(duì)樣品平均粒徑的影響Fig.7 Effect volume ratio of solvent on the average particle size

圖8 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)樣品平均粒徑的影響Fig.8 Effect of stirring speed on the average particle size

3 結(jié)論

采用反溶劑重結(jié)晶法制備的納米大豆異黃酮粉體粒度均勻，本方法操作簡(jiǎn)便易行、試驗(yàn)制得的粒子形貌和尺寸易于調(diào)控，本試驗(yàn)結(jié)果粒徑與反應(yīng)時(shí)間呈正比、與溶劑-反溶劑的體積比、轉(zhuǎn)速、溶液濃度呈反比，本試驗(yàn)最佳工藝條件為：反應(yīng)時(shí)間3 min，體積比 1∶6，溶液質(zhì)量濃度 300 mg/mL，反溶劑過(guò)程的攪拌轉(zhuǎn)速為1 200 r/min，上述試驗(yàn)結(jié)果表明：反溶劑重結(jié)晶法制備納米大豆異黃酮粉體的工藝切實(shí)可行。紅外光譜結(jié)果可得知：制備前后的粒子化學(xué)結(jié)構(gòu)沒(méi)有變化。制備后的納米粉流動(dòng)性變得更好、粒子疏松密度減小、粒徑分布均勻化且比表面積增大2～3倍。本研究結(jié)果對(duì)大豆異黃酮產(chǎn)業(yè)具有一定的指導(dǎo)作用。