蘇曉慧，任 娟，李 舵，馬曉艷，美熱木古麗?巴依待拉提，烏那爾汗?吉斯汗，王 文，薛 文，秦 菊，居馬別克?夏拉巴依

（新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯木齊 830063）

非洲豬瘟（ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起的一種急性、烈性豬傳染病，發(fā)病率、致死率可高達(dá)100%，危害嚴(yán)重，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)可造成毀滅性打擊，可引起巨大的經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)影響[1]。ASF自2018 年8 月在遼寧省首發(fā)以來，已在我國多個(gè)省份發(fā)生[2-3]。為進(jìn)一步加強(qiáng)ASF 防控，新疆地區(qū)加強(qiáng)臨床監(jiān)視、現(xiàn)場排查，對(duì)生豬從生產(chǎn)到屠宰全程進(jìn)行采樣監(jiān)測(cè)，嚴(yán)格控制生豬及其產(chǎn)品調(diào)運(yùn)監(jiān)管，多部門協(xié)調(diào)聯(lián)動(dòng)，形成了良好的工作機(jī)制。

2018 年12 月5 日，新疆巴州若羌縣動(dòng)物公路檢查站在攔截的袋裝水餃中采集樣品13 個(gè)批次，經(jīng)新疆動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)5 個(gè)批次呈ASFV 核酸陽性。隨后，將疑似陽性樣品送中國動(dòng)物衛(wèi)生流行病學(xué)中心復(fù)核，確診為ASFV 核酸陽性。為進(jìn)一步了解新疆地區(qū)外地輸入豬肉水餃的ASFV 污染情況，在該區(qū)其他公路檢查站和冷庫超市開展了ASFV 排查工作，又連續(xù)排查出4 個(gè)批次的外地輸入速凍水餃為ASFV 核酸陽性。這是新疆地區(qū)自2018 年9 月開展ASF 專項(xiàng)排查以來，首次排查出輸入性豬肉制品攜帶ASFV。

1 材料

1.1 樣品

樣品來源：動(dòng)物公路檢查站攔截的速凍豬肉餡水餃，其中來源于A 廠13 個(gè)批次、B 廠1 個(gè)批次；在冷庫、超市中抽檢B 廠速凍豬肉餡水餃11 個(gè)批次。樣品的采集、保存和運(yùn)輸嚴(yán)格按照《非洲豬瘟監(jiān)測(cè)樣品采集、保存與運(yùn)輸方法》[4]中的要求，以豬肉產(chǎn)品的批次為采樣單位，每批次按豬肉產(chǎn)品包裝的規(guī)格（件/箱）隨機(jī)抽樣。數(shù)量為每批次隨機(jī)抽取10 件（箱），每件（箱）采集樣品2 份，合計(jì)每批次采集樣品20 份。

1.2 試劑

天根磁珠法病毒DNA/RNA 提取試劑盒（批號(hào)S7327）、DNA 病毒反應(yīng)液（批號(hào)20181129）：購自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)公司；TaqMan 探針、ASFV 特異性引物、提取陽性對(duì)照、反應(yīng)陽性對(duì)照：均由中國動(dòng)物衛(wèi)生流行病學(xué)中心提供。

1.3 儀器設(shè)備

上海博訊電熱恒溫水槽SSW-600-2S、Bertin Precellys evolution 高通量組織研磨儀、Sigma3K-15臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)、天隆NP968 自動(dòng)核酸提取儀、QuantStudio5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀。

2 方法

2.1 樣品處理

每批次每袋隨機(jī)挑取2～3 個(gè)餃子，挑出其中的豬肉進(jìn)行剪碎。在加有陶珠的組織研磨管中，加入1 mL PBS 緩沖液，再加入剪碎的樣品約100 mg，使用 Bertin Precellys 組織研磨儀進(jìn)行勻漿處理。處理后放入60 ℃水浴鍋滅活30 min，每間隔5 min 顛倒混勻樣品1 次。

2.2 病毒DNA 提取

對(duì)滅活后的樣品4 ℃ 2 000 r/min，離心10 min；取200 μL 上清液，使用磁珠法病毒DNA 提取試劑盒提取DNA；將提取的核酸于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 熒光定量PCR

采用ASFV 特異熒光定量PCR 方法擴(kuò)增ASFV VP72 基因片段[4]。PCR 以20 μL 體系進(jìn)行：DNA 病毒熒光反應(yīng)液10 μL、ROX 0.2 μL、無菌無核酸水5.7 μL、正向引物0.8 μL、反向引物0.8 μL、TaqMan 探針0.5 μL，模板DNA 2 μL。同時(shí)，設(shè)立提取陽性/陰性對(duì)照、反應(yīng)陽性/陰性對(duì)照。密封反應(yīng)試管，瞬時(shí)離心，放入熒光PCR 儀，按照熒光PCR 循環(huán)條件擴(kuò)增。

3 結(jié)果

根據(jù)ASFV 檢測(cè)操作規(guī)程分析，樣品Ct 值低于40 為陽性。12 月5 日檢測(cè)的13 個(gè)批次樣品中，有5 個(gè)批次檢測(cè)到ASFV 特異性擴(kuò)增曲線，Ct 值為28.3～32.68（圖1），其他批次熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果見表2。

圖1 12 月5 日熒光PCR 擴(kuò)增結(jié)果

表2 豬肉餡水餃的熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果

4 討論

4.1 陽性豬肉產(chǎn)品的處置

新疆畜牧獸醫(yī)局接到中國動(dòng)物衛(wèi)生流行病學(xué)中心的復(fù)核確診后立即行動(dòng)，要求動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督部門會(huì)同食品藥品監(jiān)管部門按照應(yīng)急預(yù)案開展處置工作，銷毀陽性樣品，并通知各級(jí)食品藥品監(jiān)管部門、畜牧獸醫(yī)等部門，對(duì)同批次產(chǎn)品進(jìn)行無害化處理，對(duì)相關(guān)場所進(jìn)行徹底清洗消毒，同時(shí)繼續(xù)加強(qiáng)開展ASF 疫情排查工作。

4.2 加強(qiáng)流調(diào)溯源

本次速凍豬肉水餃中ASFV 核酸的確診在國內(nèi)是首次，能從豬肉產(chǎn)品中檢出ASFV，說明ASFV 已形成了一定污染面。此次在速凍豬肉水餃中檢出ASFV 核酸，推斷是由于潛伏期帶毒豬沒有臨床癥狀，屠宰后進(jìn)入加工企業(yè)，被加工生產(chǎn)成豬肉制品所造成的[5]。ASFV 自身較脆弱，對(duì)熱抵抗力不強(qiáng)[6]。雖然此類豬肉制品一般直接進(jìn)入餐桌，在蒸煮烹飪過程，均能將病毒殺死，但是水餃中豬肉的溯源應(yīng)引起主管部門的高度重視，這也是控制疫病傳播風(fēng)險(xiǎn)的重要環(huán)節(jié)。水餃在烹飪過程中，如果未對(duì)豬肉進(jìn)行高溫處理，未煮熟的水餃會(huì)以餐廚垃圾喂豬或進(jìn)入養(yǎng)殖戶，很容易造成ASFV 的傳播擴(kuò)散[7]。其次如果在加工處理車間，人員、車輛、污水、廢棄物處理不當(dāng)，就有可能造成病毒擴(kuò)散，從而引發(fā)新的疫情[7]。因此，要加強(qiáng)產(chǎn)地檢疫和屠宰場的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)發(fā)病豬和處于潛伏期的豬，防止問題豬肉流入食品生產(chǎn)環(huán)節(jié)。

4.3 繼續(xù)做好ASF 防控

目前國內(nèi)ASF 疫情仍呈點(diǎn)狀散發(fā)態(tài)勢(shì)，因豬肉制品調(diào)入而傳播ASF 的風(fēng)險(xiǎn)較高，因此應(yīng)該警惕通過污染病毒的豬肉制品而引發(fā)疫情的可能。鑒于目前ASF 防控形勢(shì)仍較嚴(yán)峻，今后仍需重點(diǎn)排查養(yǎng)殖場、生豬交易市場、屠宰場等高風(fēng)險(xiǎn)場點(diǎn)，同時(shí)加大公路檢查站對(duì)跨省入疆生豬和豬肉產(chǎn)品的檢查和查處力度，嚴(yán)格控制從疫區(qū)調(diào)入生豬及相關(guān)產(chǎn)品。