范家誠，崔曉瑩，武亞男，李正炎,2**

(1.中國海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100；2.中國海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，山東 青島 266100)

在天然水環(huán)境中，不同類型的環(huán)境激素類污染物往往同時存在，僅測試單一污染物的雌激素效應(yīng)可能忽略物質(zhì)間存在的交互效應(yīng)[1]。因此，研究環(huán)境激素類污染物的生物效應(yīng)及其作用機制時應(yīng)當(dāng)考慮這些污染物間的相互作用，這可能涉及不同的作用機制。大多數(shù)的環(huán)境激素可以通過結(jié)合細胞核內(nèi)的特定受體，如芳香烴受體、雄激素受體和甲狀腺受體等，誘導(dǎo)或抑制受體的表達，進而對生物體內(nèi)關(guān)鍵激素的調(diào)節(jié)產(chǎn)物造成差異性表達[2-3]。對環(huán)境雌激素類污染物而言，其典型作用機制是作為配體與雌激素受體(Estrogen receptor,ER)結(jié)合，并通過雌激素應(yīng)答元件調(diào)節(jié)響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄過程[4]。ER在哺乳動物中具有2種亞型，ERα和ERβ。ERα是雌激素受體基因esr1表達的產(chǎn)物，它可以在肝臟和腦等組織中表達。另外，硬骨魚類具有2種ERβ亞型[5-6]，即分別被esr2b和esr2a基因編碼的ERβ1和ERβ2。有研究表明，在雌激素作用下，ERs的基因在肝臟中的表達會明顯上調(diào)[7]。所以，ERs的基因可以作為生物體內(nèi)雌激素活性檢測的典型生物標志物。

除ERs的基因外，卵黃蛋白原(Vitellogenin,Vtg)也常常作為生物標志物，用于分析魚類等動物體內(nèi)的雌激素活性。Vtg是在肝臟中合成的一種卵黃前體蛋白，已有研究指出，成年雄性斑馬魚[8]和幼體斑馬魚[9]可在外源性雌激素的誘導(dǎo)作用下合成卵黃蛋白原，且卵黃蛋白原基因mRNA的轉(zhuǎn)錄也會產(chǎn)生明顯上調(diào)[10]。斑馬魚基因組中存在7種形式的Vtg基因，vtg1～vtg7，其中vtg1的表達量最高，這也使得vtg1成為研究雌激素效應(yīng)的一個重要基因[11-12]。

斑馬魚具有典型脊椎動物所具有的內(nèi)分泌、生殖和神經(jīng)系統(tǒng)以及類似的發(fā)育模式，其基因組、蛋白組和轉(zhuǎn)錄組信息也不斷趨于清晰和完整，斑馬魚體內(nèi)的類固醇激素的類型、類固醇的受體、合成酶及生成途徑和哺乳動物基本相同[13]，因此，斑馬魚經(jīng)常作為雌激素效應(yīng)檢測的模式生物[14]。

17β-雌二醇(17β-Estradiol,E2)是一種天然雌激素，其對雄性斑馬魚具有明顯的雌激素效應(yīng)[15]，它作為一種陽性對照化合物，已廣泛用于評估某些新型污染物的雌激素效應(yīng)。作為壬基酚聚氧乙烯醚的主要降解產(chǎn)物，壬基酚(Nonylphenol,NP)是一種典型的環(huán)境擬雌激素，它可以模擬天然雌激素，對稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)產(chǎn)生雌激素效應(yīng)[16]。而三丁基氯化錫(Tributyltin chloride,TBT)作為一種環(huán)境抗雌激素，可以在mRNA表達、性激素表達、組織器官指數(shù)和生殖行為等不同生物學(xué)水平上，抑制稀有鮈鯽的雌激素效應(yīng)[17]。本研究選取Vtg基因vtg1和ERs基因esr1、esr2a、esr2b作為雌激素響應(yīng)基因，初步探討了3種環(huán)境雌激素類污染物在單獨及共同暴露條件下對斑馬魚肝臟組織中4種基因mRNA表達的影響，為自然環(huán)境中多種環(huán)境激素共存環(huán)境下的生態(tài)風(fēng)險評估提供科技支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

性成熟的雄性斑馬魚(5～6月齡，體長(2.65±0.05)cm，濕重(0.33±0.02)g)購于青島市某花鳥魚市場，實驗前室內(nèi)馴養(yǎng)兩周，馴養(yǎng)條件如下：水溫(27±1)℃、光照14 h(L):10 h(D)，每天換水1/3，早晚各飼喂顆粒型熱帶魚糧(Porpoise,江門)一次。

17β-雌二醇(E2,CAS:50-28-2,>97.0%,上海TCI)、壬基酚(NP,CAS:84852-15-3,美國Sigma-Aldrich)、三丁基氯化錫(TBT,CAS:1461-22-9,99%,北京J&K)

1.2 實驗方法

1.2.1 斑馬魚暴露過程 E2、NP和TBT的單獨暴露：預(yù)先進行各污染物單獨暴露，各污染物暴露濃度分別為：E2：5、10、25、50、100 ng/L；NP：10、25、50、100、200 μg/L；TBT：10、25、50、100、200 ng/L。每種污染物單獨暴露各設(shè)5個濃度組，1個空白及1個溶劑對照組(0.05%乙醇)。

E2、NP和TBT的聯(lián)合暴露：根據(jù)3種污染物單獨暴露的實驗結(jié)果，分別在3種污染物可以造成目的基因mRNA顯著性差異表達的濃度范圍內(nèi)，各選取一個高濃度和一個低濃度，設(shè)置聯(lián)合暴露濃度，各實驗組暴露濃度如下：

E2和NP暴露組：10 ng/L E2+25 μg/L NP，10 ng/L E2+100 μg/L NP，50 ng/L E2+25 μg/L NP，50 ng/L E2+100 μg/L NP；

E2和TBT暴露組：10 ng/L E2+25 ng/L TBT，10 ng/L E2+100 ng/L TBT，50 ng/L E2+25 ng/L TBT，50 ng/L E2+100 ng/L TBT；

NP和TBT暴露組：25 μg/L NP+25 ng/L TBT，25 μg/L NP+100 ng/L TBT，100 μg/L NP+25 ng/L TBT，100 μg/L NP+100 ng/L TBT；

E2、NP和TBT暴露組：10 ng/L E2+25 μg/L NP+25 ng/L TBT，10 ng/L E2+25 μg/L NP+100 ng/L TBT，10 ng/L E2+100 μg/L NP+25 ng/L TBT，10 ng/L E2+100 μg/L NP+100 ng/L TBT，50 ng/L E2+25 μg/L NP+25 ng/L TBT，50 ng/L E2+25 μg/L NP+100 ng/L TBT，50 ng/L E2+100 μg/L NP+25 ng/L TBT，50 ng/L E2+100 μg/L NP+100 ng/L TBT。

聯(lián)合暴露共設(shè)20個濃度組及1個空白及1個溶劑對照組(0.05%乙醇)。

斑馬魚的暴露在水溫(27±1)℃、光照14 h(L)∶10 h(D)連續(xù)曝氣條件下進行。暴露容器為40 cm×25 cm×40 cm玻璃缸，玻璃缸中加入20 L經(jīng)24 h連續(xù)曝氣除氯的自來水，并在每個玻璃缸中添加毒物至對應(yīng)暴露濃度，混勻。每組隨機放入實驗用斑馬魚16尾，每天更換全部暴露液并飼喂顆粒型熱帶魚糧(Porpoise,江門)。暴露進行至第14天后，對各組斑馬魚進行取樣(每組樣本數(shù)n=4)。

1.2.2 組織保存和總RNA提取 將斑馬魚放置于冰面上進行活體解剖，并根據(jù)性腺形態(tài)對其進行性別確認，然后取雄性斑馬魚的肝臟組織置于凍存管中，并加入RNA保存劑(Takara,大連)，保存在-80 ℃超低溫冰箱中備用。RNA提取前，從冰箱中取出凍存的肝臟樣本，采用組織研磨器搗碎勻漿。總RNA提取操作參照TRIzolTMReagent(Invitrogen,美國)試劑說明書進行，提取的總RNA溶于50 μL DNase/RNase-free ddH2O中，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。提取完成后，取1 μL RNA溶液，利用NanoDrop 2000紫外-可見分光光度計(Thermo Fisher,美國)對其進行濃度測定與純度校驗，并取5 μL RNA溶液進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，通過觀察電泳條帶的清晰度，檢驗RNA完整性。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄過程 選取通過上述檢驗的RNA樣本，根據(jù)測得的總RNA濃度，取1 μg總RNA，參照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara,大連)試劑盒說明書構(gòu)建20 μL的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.4 定量PCR引物設(shè)計 根據(jù)NCBI網(wǎng)站GenBank數(shù)據(jù)庫中斑馬魚內(nèi)參基因actb1和4種雌激素響應(yīng)基因vtg1、esr1、esr2a和esr2bmRNA的蛋白質(zhì)編碼區(qū)序列，設(shè)計對應(yīng)引物(見表1)。全部引物由上海生工生物工程股份有限公司進行合成，使用前按照合成說明書，加入DNase/RNase-free ddH2O將其稀釋至8 μmol/L，并置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.5 實時熒光定量PCR反應(yīng) 以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA作為擴增模板，取2 μL cDNA溶液置于96孔板中，參照SYBR?Premix Ex TaqTMII(Takara,大連)試劑盒說明書構(gòu)建20 μL的反應(yīng)體系，并使用Roche LightCycler?480 System(Roche,美國)進行mRNA表達量的檢測，具體反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸與偵測熒光30 s，共計40個循環(huán)；熔解曲線：95 ℃ 5 min，60 ℃ 1 min，95 ℃繼續(xù)；50 ℃降溫30 s。每個樣本重復(fù)進樣3次。反應(yīng)結(jié)束后確認擴增曲線和熔解曲線，并記錄達到閾值時的循環(huán)數(shù)CT。

表 1 雌激素響應(yīng)基因的實時熒光定量反應(yīng)特異性引物Table 1 Gene-specific primers for qPCR analysis of mRNAs of selected estrogen-responsive genes

1.2.6 引物特異性驗證 分析實時熒光定量PCR的熔解曲線，觀察熔解溫度Tm值與特異性吸收峰的生成情況，避免非特異性擴增和二級結(jié)構(gòu)對實驗結(jié)果的影響。并取5 μL擴增產(chǎn)物進行3%瓊脂糖凝膠電泳分析，用以比較擴增產(chǎn)物的分子量是否與設(shè)計結(jié)果一致。經(jīng)驗證，設(shè)計的引物工作性能良好，擴增過程中沒有產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)且擴增產(chǎn)物準確。

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過比較目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率，確立采用2-ΔΔCT相對定量分析方法[18]，采用公式(1)對實驗結(jié)果CT值進行歸一化處理。目的基因的相對表達量以平均值±標準誤差表示，并使用SPSS 22進行單因素方差分析(ANOVA)，采用Duncan法進行實驗組之間表達量的多重比較。

相對mRNA表達量=2-ΔΔCT。

(1)

其中：ΔΔCT=[CT(目的基因)-CT(內(nèi)參基因)]暴露組-[CT(目的基因)-CT(內(nèi)參基因)]對照組。

2 結(jié)果

2.1 E2和NP聯(lián)合暴露對斑馬魚雌激素響應(yīng)基因mRNA表達的影響

研究結(jié)果表明，E2和NP的聯(lián)合暴露可以顯著誘導(dǎo)vtg1和esr1mRNA的表達(見圖1)。當(dāng)兩者都處在較高濃度時(E2 50 ng/L、NP 100 μg/L)，vtg1和esr1mRNA的相對表達量分別為溶劑對照組的81 208和13.57倍，遠大于兩者單獨暴露時相對表達量之和(P<0.05)。另外，E2和NP聯(lián)合暴露對esr2bmRNA的表達的誘導(dǎo)作用與NP單獨暴露時的誘導(dǎo)作用相比無顯著性差異(P>0.05)，對esr2amRNA的表達也沒有顯著性影響(P>0.05)。

2.2 E2和TBT聯(lián)合暴露對斑馬魚雌激素響應(yīng)基因mRNA表達的影響

在E2和TBT聯(lián)合暴露的條件下，vtg1和esr1mRNA的表達情況與E2單獨暴露時相比無顯著性差異(見圖2)。只有當(dāng)E2濃度較低時(10 ng/L)，TBT才能抑制E2對vtg1和esr1mRNA表達的誘導(dǎo)作用(P<0.05)。而esr2a和esr2bmRNA在E2和TBT聯(lián)合暴露下的相對表達量，為溶劑對照組的0.95倍至1.03倍，與溶劑對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)。

2.3 NP和TBT聯(lián)合暴露對斑馬魚雌激素響應(yīng)基因mRNA表達的影響

NP和TBT的聯(lián)合暴露對vtg1和esr1mRNA的表達產(chǎn)生的誘導(dǎo)作用遠低于NP單獨作用時所產(chǎn)生的誘導(dǎo)作用(見圖3)。當(dāng)TBT處于較高濃度(100 ng/L)，且NP為25和100 μg/L時，vtg1mRNA的相對表達量分別為溶劑對照組的2.97和7.79倍，相較于NP單獨暴露時的4.34和12.27倍，均具有顯著性的下降(P<0.05)。對于esr1mRNA表達的影響亦是如此，在上述相同條件下，esr1mRNA的相對表達量分別為溶劑對照組的1.45和2.35倍，相較于NP單獨暴露時所產(chǎn)生的2.18和3.63倍，也表現(xiàn)出了顯著性的下降(P<0.05)。至于兩者聯(lián)合暴露對esr2a和esr2bmRNA表達的影響，則與NP和E2聯(lián)合暴露時的結(jié)果類似。

(雌激素響應(yīng)基因的相對表達量是以actb1為內(nèi)參基因，使用相對定量法對目的基因mRNA的表達量進行歸一化的結(jié)果，并表示為平均值±標準誤差的形式。采用Duncan法對單因素方差分析的結(jié)果進行事后多重比較，不同的小寫字母表示暴露組間具有顯著性差異，P<0.05。Values were normalized againstactb1as a housekeeping gene,and represent mean mRNA expression value ± S.E.M.(n=4)relative to those of the controls.Means of exposures not sharing a common lowercase letter are significantly different atP<0.05 as assessed by one-way ANOVA followed by the Duncan’s test.)
圖 1 E2和NP聯(lián)合暴露14 d的雄性斑馬魚肝臟中vtg1(a)、esr1(b)、esr2a(c)和esr2b(d)mRNA的表達情況
Fig.1 Expression of hepaticvtg1(a),esr1(b),esr2a(c)andesr2b(d)mRNA in adult male zebrafish exposed to various concentrations of E2 and NP for 14 days

(雌激素響應(yīng)基因的相對表達量是以actb1為內(nèi)參基因，使用相對定量法對目的基因mRNA的表達量進行歸一化的結(jié)果，并表示為平均值±標準誤差的形式。采用Duncan法對單因素方差分析的結(jié)果進行事后多重比較，不同的小寫字母表示暴露組間具有顯著性差異，P<0.05。Values were normalized againstactb1as a housekeeping gene,and represent mean mRNA expression value ± S.E.M.(n=4)relative to those of the controls.Means of exposures not sharing a common lowercase letter are significantly different atP<0.05 as assessed by one-way ANOVA followed by the Duncan’s test.)
圖 2 E2和TBT聯(lián)合暴露14 d的雄性斑馬魚肝臟中vtg1(a)、esr1(b)、esr2a(c)和esr2b(d)mRNA的表達情況
Fig.2 Expression of hepaticvtg1(a),esr1(b),esr2a(c)andesr2b(d)mRNA in adult male zebrafish exposed to various concentrations of E2 and TBT for 14 days

(雌激素響應(yīng)基因的相對表達量是以actb1為內(nèi)參基因，使用相對定量法對目的基因mRNA的表達量進行歸一化的結(jié)果，并表示為平均值±標準誤差的形式。采用Duncan法對單因素方差分析的結(jié)果進行事后多重比較，不同的小寫字母表示暴露組間具有顯著性差異，P<0.05。Values were normalized againstactb1as a housekeeping gene,and represent mean mRNA expression value ± S.E.M.(n=4)relative to those of the controls.Means of exposures not sharing a common lowercase letter are significantly different atP<0.05 as assessed by one-way ANOVA followed by the Duncan’s test.)
圖3 NP和TBT聯(lián)合暴露14 d的雄性斑馬魚肝臟中vtg1(a)、esr1(b)、esr2a(c)和esr2b(d)mRNA的表達情況
Fig.3 Expression of hepaticvtg1(a),esr1(b),esr2a(c)andesr2b(d)mRNA in adult male zebrafish exposed to various concentrations of NP and TBT for 14 days

2.4 E2、NP和TBTB聯(lián)合暴露對斑馬魚雌激素響應(yīng)基因mRNA表達的影響

在E2、NP和TBT三種物質(zhì)聯(lián)合暴露的條件下，esr1、esr2a和esr2bmRNA的表達情況與TBT濃度之間的關(guān)聯(lián)程度均相對較小(見圖4)。而對于vtg1mRNA的表達情況來說，當(dāng)E2和NP都處于較低濃度(E2 10 ng/L、NP 25 μg/L)，且TBT的濃度為25和100 ng/L時，vtg1mRNA的相對表達量分別為溶劑對照組的6 354和6 262倍，相較于E2和NP兩者聯(lián)合暴露時的6 782倍，具有顯著性的下降(P<0.05)。在此基礎(chǔ)上升高NP濃度，使其達到100 μg/L，低濃度的TBT(25 ng/L)則不再能抑制E2和NP對vtg1mRNA表達的誘導(dǎo)作用(P>0.05)，此時只有當(dāng)TBT處于較高濃度時(100 ng/L)，vtg1mRNA的相對表達量為溶劑對照組的13 566倍，相較于E2和NP兩者聯(lián)合暴露時的14 905倍，才具有顯著性的下降(P<0.05)。

3 討論

E2是一種天然類固醇雌激素，其對雄性斑馬魚具有明顯的雌激素效應(yīng)，前人研究已證實其可以誘導(dǎo)雄性斑馬魚肝臟vtg1和esr1mRNA的表達[19-20]。而NP則可以通過模擬天然雌激素的功能對斑馬魚產(chǎn)生雌激素效應(yīng)，但其雌激素活性比E2低3～4個數(shù)量級，是一種相對較弱的ER激動劑[21]。本研究中，E2和NP的聯(lián)合暴露對雄性斑馬魚肝臟中vtg1和esr1mRNA表達的影響結(jié)果與前期研究報道結(jié)果相似[22]，即：一種相對較弱的ER激動劑與E2共同作用往往呈現(xiàn)協(xié)同或相加效應(yīng)[23]。至于esr2a和esr2b這2種ER基因，盡管其翻譯產(chǎn)物ERβa和ERβb都可以與天然雌激素[24]或其他雌激素配體結(jié)合[25]，但兩者的表達模式不同于esr1，且兩者間也有所不同，多數(shù)研究表明雌激素對兩者的轉(zhuǎn)錄沒有顯著影響[26]。但也有研究指出，另一種ER激動劑雙酚A(Bisphenol A,BPA)對ERα和ERβ都能發(fā)揮作用[27]，并且能被ER抑制劑所阻斷。

(雌激素響應(yīng)基因的相對表達量是以actb1為內(nèi)參基因，使用相對定量法對目的基因mRNA的表達量進行歸一化的結(jié)果，并表示為平均值±標準誤差的形式。采用Duncan法對單因素方差分析的結(jié)果進行事后多重比較，不同的小寫字母表示暴露組間具有顯著性差異，P<0.05。Values were normalized againstactb1as a housekeeping gene,and represent mean mRNA expression value ± S.E.M.(n=4)relative to those of the controls.Means of exposures not sharing a common lowercase letter are significantly different atP<0.05 as assessed by one-way ANOVA followed by the Duncan’s test.)
圖4 E2、NP和TBT聯(lián)合暴露14 d的雄性斑馬魚肝臟中vtg1(a)、esr1(b)、esr2a(c)和esr2b(d)mRNA的表達情況
Fig.4 Expression of hepaticvtg1(a),esr1(b),esr2a(c)andesr2b(d)mRNA in adult male zebrafish exposed to various concentrations of E2,NP and TBT for 14 days

這與本研究的結(jié)果相類似，即，BPA和NP都可以誘導(dǎo)ERα的調(diào)控基因esr1和ERβb的調(diào)控基因esr2b的表達。因此，猜測本研究中NP對雄性斑馬魚肝臟中ERs的基因表達所表現(xiàn)出的誘導(dǎo)作用，可能與BPA的作用機制相同。

另外，作為環(huán)境抗雌激素，TBT與上述兩種物質(zhì)的作用機制不盡相同。有研究指出，TBT可以通過抑制芳香化酶Cyp19的活性，繼而抑制體內(nèi)E2的生成過程，降低生物體內(nèi)E2的含量并產(chǎn)生抗雌激素效應(yīng)[28]。本研究中，只有在與較低濃度的E2聯(lián)合暴露或與較低濃度的E2和NP三者聯(lián)合暴露時，TBT在較高濃度下才可以抑制E2對雄性斑馬魚肝臟中vtg1mRNA表達的誘導(dǎo)效應(yīng)。當(dāng)TBT和NP聯(lián)合暴露時，其對雄性斑馬魚肝臟中vtg1和esr1mRNA表達又會產(chǎn)生顯著的抑制作用。另外，在E2、NP和TBT三者聯(lián)合暴露的情況下，TBT對雄性斑馬魚肝臟中esr1mRNA表達不產(chǎn)生顯著的抑制作用。同時，實驗結(jié)果也表明，esr1對雌激素的響應(yīng)不如vtg1敏感。因此，在三者聯(lián)合暴露的情況下，只有較為敏感的基因才能對TBT做出明顯響應(yīng)。上述實驗結(jié)果中，TBT的抗雌激素效應(yīng)與E2濃度間呈現(xiàn)出了很強的相關(guān)性，這為前文提出的TBT可以通過降低生物體內(nèi)E2水平來產(chǎn)生抗雌激素效應(yīng)這一作用機理提供了佐證。不過也有研究表明，除了降低生物體內(nèi)雌激素水平之外，抗雌激素還具有其他作用機制，包括競爭受體結(jié)合位點[29]，加速雌激素的代謝[30]，降低ER含量[31]，抑制ER轉(zhuǎn)錄活性[32]以及ER和其他核受體的交互應(yīng)答[33]等。更有進一步研究指出，TBT也可以作為芳香烴受體(Aryl hydrocarbon receptor,AhR)激動劑，參與ER-AhR抑制性交互應(yīng)答，繼而產(chǎn)生抗雌激素效應(yīng)[34]。由此可見，僅憑Vtg和ER兩類生物標志物的基因無法詳細闡明TBT的抗雌激素效應(yīng)機制，需要補充AhR和芳香化酶等其他生物標志物的相關(guān)基因，以及這些基因在不同組織中表達情況的實驗進行驗證。

綜上所述，天然雌激素E2、環(huán)境擬雌激素NP和環(huán)境抗雌激素TBT的聯(lián)合暴露可以誘導(dǎo)雄性斑馬魚肝臟中卵黃蛋白原基因和雌激素受體基因的表達，且3種污染物可能具有不同的作用機制。本研究以斑馬魚作為受試生物，在E2、NP和TBT聯(lián)合暴露的情況下，分別對成年雄性斑馬魚進行了為期14 d的暴露，采用實時熒光定量PCR的檢測方法，研究了不同污染物組合下，成年雄性斑馬魚肝臟中四種雌激素響應(yīng)基因mRNA的表達情況，為今后探索多種環(huán)境雌激素類污染物共存條件下的生物效應(yīng)和生態(tài)風(fēng)險提供了科學(xué)依據(jù)。