朱葆華，沈 含，朱召霞，李 赟，楊官品，潘克厚,3**

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學(xué))，山東 青島 266003；2.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島266003；3．青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，山東 青島 266237)

鈍頂螺旋藻(Arthrospiraplatensis)屬于藍藻門(Cyanophyta)藍藻綱(Cyanobacteria)顫藻目(Oscillatoriales)螺旋藻屬(Spirulina)或節(jié)旋藻屬(Arthrospira)，呈多細胞絲狀螺旋形，藻絲寬4～5 μm，長400～600 μm[8]。其蛋白質(zhì)含量可達50%～70%，含有人體必需的8種氨基酸和非必需的9種氨基酸以及不飽和脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)、藻藍蛋白等，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FDA)譽為“人類二十一世紀(jì)最理想的保健食品”[9-10]。

硒(Selenium,Se)是人體必需的微量元素，是谷胱甘肽過氧化酶(GPX)的活性成份，參與構(gòu)成硫氧還蛋白還原酶(TR)、脫碘酶(ID)等酶的活性中心[11-12]。螺旋藻是硒有機化的理想載體，可有效實現(xiàn)對硒的富集和有機化。關(guān)于硒對螺旋藻的影響，目前研究主要集中在最適硒濃度以及富硒螺旋藻壞境因子優(yōu)化，如溫度、光照、pH等，以獲得高產(chǎn)生物量和含硒藻藍蛋白、螺旋藻多糖等生物活性物質(zhì)[13-16]，關(guān)于硒與螺旋藻固碳效率的相互關(guān)系，未見研究報道。螺旋藻對硒的富集具有雙重效應(yīng)，低濃度硒促進生長，高濃度硒抑制其生長[17]，而不同品系的螺旋藻以及培養(yǎng)方式不同，最適硒濃度隨之不同[18-20]。高海洋[18]報道，當(dāng)硒濃度為7 mg/L時，螺旋藻生長最好，生物量達到1.719 g/L，比對照組提高了11.62%。Wang等[19]報道，低濃度硒(0.1～1 mg/L)對螺旋藻無毒，且生物量最大，生長速率最快，促進其生長，而高濃度硒(10 mg/L)幾乎抑制了藻的生長。Zhong等[20]研究了不同硒濃度對石莼光合作用以及抗氧化酶活性的影響，表明低濃度硒(≤750 mg/L)可提高谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性，增加光合色素含量，提高抗脂質(zhì)過氧化(LPO)能力，降低細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平。

本實驗研究硒對鈍頂螺旋藻生長及固碳速率的影響，通過添加不同濃度的無機硒(Na2SeO3)，測定其生物量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)以及含碳率，篩選出促進其生長并提高固碳速率的最佳硒濃度，為大規(guī)模培養(yǎng)螺旋藻提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 藻種培養(yǎng)

鈍頂螺旋藻(Arthrospiraplatensis)來自中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫，編號為FACHB-834。在改良的Zarrouk培養(yǎng)基中添加無機硒(Na2SeO3·5H2O)進行培養(yǎng)[21]。首先，用微吸管與96孔板逐級稀釋相結(jié)合的方法純化藻種[22]，將純化的藻種培養(yǎng)至指數(shù)生長期，轉(zhuǎn)接至500 mL的錐形瓶，每瓶中加入350 mL培養(yǎng)基，初始接種密度OD750為0.1，共6組，每組3個平行，分別添加不同質(zhì)量的Na2SeO3·5H2O，調(diào)節(jié)Na2SeO3·5H2O終濃度為0 mg/L(對照組)、1、10、20、50和100 mg/L。培養(yǎng)溫度(30±1)℃，LED光照強度(70～80)μmol·m-2·s-1，光周期L∶D =12 h∶12 h，培養(yǎng)周期10 d，pH穩(wěn)定在9.0±0.5。

1.2 實驗方法

1.2.1 生長曲線及比生長速率測定 用紫外分光光度計(Hitachi U-3310)隔天定時測定各組OD750值，并繪制生長曲線。比生長速率通過公式(1)進行計算[23]。式中：μ為比生長速率(d-1)；x1，x2分別為培養(yǎng)開始和結(jié)束時細胞干重；t1，t2為培養(yǎng)開始和結(jié)束時間。

(1)

1.2.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定 用水樣葉綠素?zé)晒鈨x(Water-PAM)隔天定時測定各組鈍頂螺旋藻的誘導(dǎo)光曲線和快速光曲線。藻細胞暗適應(yīng)15 min，吸取2 mL藻液上樣測定各參數(shù)?？芍苯幼x出PSII最大光轉(zhuǎn)換效率Fv/Fm，最大光合電子傳遞速率rERTmax，光能的利用效率α等參數(shù)。其中F0(基礎(chǔ)熒光)用弱測量光(0.01 μmoL·m-2·s-1)測量可得，F(xiàn)m(最大熒光)用飽和脈沖(4 000μmoL·m-2·s-1，持續(xù)時間為0.8 s)激發(fā)可得[24]。

1.2.3 生物量測定 分別取初始和培養(yǎng)11 d的藻液50 mL，用GF/CTM(WhatmanTM公司)玻璃纖維素濾膜進行抽濾，將濾膜轉(zhuǎn)移至干燥的培養(yǎng)皿中，放入恒溫烘箱，60 ℃干燥，反復(fù)稱量至恒重[25]。培養(yǎng)11 d，剩余藻液采收用1 250目篩絹抽濾，用蒸餾水洗滌3次，將藻泥連同篩捐轉(zhuǎn)入離心管中真空冷凍干燥備用。

1.2.4 細胞含碳率及固碳速率測定 稱取2 mg左右經(jīng)真空冷凍干燥的藻粉，用錫箔紙將藻粉包裹好，使用CHN元素分析儀(Vario EL Ⅲ，德國)測定藻細胞含碳率Cc。

CO2固定速率[26]通過公式(2)計算。式中RC：CO2固定速率；Px為螺旋藻的生長速率，通過公式(3)計算，x2：終生物量，x1：初始生物量，t2-t1：兩次測量的間隔時間；Cc：藻干細胞含碳率；MCO2：CO2分子量；Mc為C原子量。

(2)

(3)

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)采用軟件SPSS18.0進行單因素方差分析(LSD，Duncan)，并進行多重比較，顯著性水平為P<0.05；采用Origin8.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒對鈍頂螺旋藻生長的影響

圖1顯示，不同硒濃度下，鈍頂螺旋藻在指數(shù)生長前期OD750值差異不顯著(P>0.05)，培養(yǎng)7～11 d，硒濃度>10 mg/L處理組藻細胞密度顯著低于對照組(0 mg/L)(P<0.05)，說明較高的硒濃度抑制鈍頂螺旋藻的生長，且培養(yǎng)后期顯微觀察部分藻絲斷裂死亡，藻液泛黃；硒濃度≤10 mg/L處理組差異不顯著(P>0.05)，生長狀態(tài)良好。

2.2 硒對比生長速率和細胞干重的影響

由圖2可以看出，鈍頂螺旋藻的比生長速率在不同硒濃度處理下差異顯著，低濃度處理組(1、10 mg/L)顯著高于高濃度處理組(50、100 mg/L)，1 mg/L時比生長速率最高，達0.27 d-1。

不同硒濃度處理下鈍頂螺旋藻收獲時的生物量與比生長速率趨勢一致(見圖3)，低濃度處理組(1、10 mg/L)顯著高于高濃度處理組(50、100 mg/L)，與對照組相比，1 mg/L處理組生物量提高了21%，100 mg/L的處理組則降低了48%，說明硒對鈍頂螺旋藻生長具有兩重性，較低的硒濃度(≤10 mg/L)促進其生長；較高的硒濃度(>20 mg/L)則對其生長產(chǎn)生不同程度的抑制甚至導(dǎo)致部分藻體斷裂死亡。

2.3 硒對鈍頂螺旋藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

最大光能轉(zhuǎn)換效率Fv/Fm反映了PSII反應(yīng)中心均處于開放時的最大量子產(chǎn)量，即能量捕獲效率[27]?？焖俟忭憫?yīng)曲線(Rapid response light curve，RLC)中，快速光曲線的初始斜率α，用于表征光能的利用效率；最大電子傳遞速率rETRmax，用于表征潛在的最大光合作用速率[28]。由圖4(A、B、C)可以看出，最大光能轉(zhuǎn)換效率(Fv/Fm)，最大電子傳遞速率(rETRmax)和光能利用率(α)與對照組相比均有所提高，但差異不顯著，低濃度處理組(1、10 mg/L)顯著高于高濃度處理組(50、100 mg/L)說明高濃度硒脅迫使PSII反應(yīng)中心受損，抑制了光合作用的原初反應(yīng)，阻礙了光合電子傳遞的過程。

(數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，圖中不同字母表示存在顯著性差異 (P<0.05，Duncan多重比較)。Values are expressed as mean ± standard deviation.Different letters indicate significant difference (P<0.05,one-way ANOVA,followed by Duncan,s).)
圖1 不同硒濃度下鈍頂螺旋藻的生長情況
Fig.1 The growth ofArthrospiraplatensisexposed to different Se concentrations

(數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，圖中不同字母表示存在顯著性差異 (P<0.05，Duncan多重比較)。Values are expressed as mean±standard deviation.Different letters indicate significant difference (P<0.05,one-way ANOVA,followed by Duncan,s).)
圖2 不同硒濃度下鈍頂螺旋藻比生長速率
Fig.2 The specific growth rate ofArthrospiraplatensisexposed to different Se concentrations

(數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，圖中不同字母表示存在顯著性差異 (P<0.05，Duncan多重比較)。Values are expressed as mean ± standard deviation.Different letters indicate significant difference.(P<0.05,one-way ANOVA,followed by Duncan,s).)
圖3 不同硒濃度下鈍頂螺旋藻生物量
Fig.3 The biomass density ofArthrospiraplatensisexposed to different Se concentrations

圖4 不同硒濃度下鈍頂螺旋藻Fv/Fm、rETRmax、α Fig.4 The Maximum photochemical efficiencies Fv/Fm,rETRmax、α of Arthrospira platensis exposed to different Se concentrations

2.4 硒對鈍頂螺旋藻固碳效率的影響

鈍頂螺旋藻的含碳率與固碳效率變化趨勢一致(見圖5)，均為低濃度處理組(1、10 mg/L)顯著高于高濃度處理組(50、100 mg/L)(P<0.05)，與對照組相比，1 mg/L處理組固碳速率顯著提高了26.86%，達153.32 mg/(L·d)，100 mg/L處理組固碳速率最低，為47.23 mg/(L·d)，說明硒濃度在一定范圍內(nèi)(1～10 mg/L)有利于鈍頂螺旋藻固定二氧化碳。

(數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，圖中不同字母表示存在顯著性差異 (P<0.05，Duncan多重比較)。Values are expressed as mean ± standard deviation.Different letters indicate significant difference (P<0.05,one-way ANOVA,followed by Duncan,s).)
圖5 不同硒濃度下鈍頂螺旋藻CO2固碳速率以及含碳率
Fig.5 Carbon dioxide fixation rate and carbon content ofArthrospiraplatensisexposed to different Se concentrations

3 討論

硒(Se)是人體必需的微量元素，螺旋藻培養(yǎng)過程中適當(dāng)添加無機硒，不僅可以促進其生長，還能提高螺旋藻的品質(zhì)，但培養(yǎng)螺旋藻適宜的硒濃度，不同研究者報道差別很大[13-16]。何曉艷等[29]報道,當(dāng)培養(yǎng)基中的硒離子(Se4+)濃度為0.1 mg/L時，能夠促進螺旋藻的生長，提高生物量和藻膽蛋白的含量。Li等[30]培養(yǎng)螺旋藻時添加亞硒酸鈉，在0.5～40 mg/L硒濃度下顯著促進螺旋藻的生長，低于400 mg/L均利于藻細胞的生長，超過500 mg/L時，對藻細胞有制毒作用。Cepoi等[31]研究表明：添加硒濃度為50～70 mg/L，螺旋藻的生物量較不添加硒提高22%～25%，在硒濃度超過200 mg/L時，其生長受到抑制。周志剛等[32]研究了硒對極大螺旋藻藻細胞、藻膽體及藻藍蛋白的光譜特性，發(fā)現(xiàn)硒(IV)濃度低于40 mg/L促進藻細胞生長，超過60 mg/L則抑制細胞生長，而李志勇等[21]報道，在0.02～411 mg/L濃度范圍內(nèi)，硒促進鈍頂螺旋藻生長，提高其生物量。在本研究中，較低的硒濃度(1、10 mg/L)促進鈍頂螺旋藻的生長，1 mg/L硒濃度下，其生物量最大(1.04 g/L)，比生長速率最快(0.265 d-1)，固碳速率最高(153.32 mg/(L·d)；硒濃度為20 mg/L時，生物量和比生長速率與對照組相比沒有顯著差異，但OD750在指數(shù)生長末期卻顯著低于對照組(見圖1)，可能原因是該濃度的硒有利于細胞內(nèi)容物的積累與合成(比如藻藍蛋白和葉綠素a等)[20]，導(dǎo)致細胞密度不變的情況下生物量增加，比生長速率也增加，這方面還需要進一步實驗驗證。顯示與對照組在培養(yǎng)指數(shù)后期差異顯著，因添加硒影響其生物量，從而影響比生長速率，同時也會對細胞的內(nèi)容物和胞外物產(chǎn)生影響，影響OD750值。而較高的硒濃度(50、100 mg/L)則抑制藻細胞的生長，與對照組相比生物量分別顯著降低了43%和47.7%。以上研究結(jié)果表明，不同螺旋藻藻株適宜添加的硒濃度，不同的研究者得出了不同的結(jié)論，因此，針對不同的螺旋藻品系，應(yīng)適時調(diào)整最適硒濃度，為規(guī)?；a(chǎn)提供可靠的理論依據(jù)。

葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)，比如Fv/Fm、rETRmax等可以直觀反映藻細胞的光合作用能力及生理狀態(tài)。已有的研究表明，硒可以提高植物的光合作用能力。Feng等[33]在梨、葡萄和桃子葉面噴灑17 mg/L的硒，提高了葉子的凈光合作用效率，PSⅡ的最大光能轉(zhuǎn)換效率(Fv/Fm)和光化學(xué)淬滅等。在一定范圍內(nèi)(≤50 mg/L)，隨著硒濃度的增加，水稻PSII的Fv/Fm顯著增加，硒濃度超過50 mg/L，F(xiàn)v/Fm則逐漸降低[34]。用10 mg/L硒處理苦蕎，PSII的潛在光合作用效率顯著高于對照組[35]。本研究中，低濃度硒提高了藻細胞的最大光能轉(zhuǎn)換效率(Fv/Fm)，最大電子傳遞速率(rETRmax)和光能利用率(α)，且低濃度處理組(1、10 mg/L)顯著高于高濃度處理組(50、100 mg/L)(見圖4 A、B、C)，說明硒有助于提高螺旋藻的光合作用能力。單雪鳳等[36]報道，硒對螺旋藻的捕光色素蛋白如藻藍蛋白、別藻藍蛋白和Rubisco大亞基及超氧化物歧化酶(SOD)等蛋白質(zhì)具有明顯上調(diào)作用。由于藻膽蛋白是螺旋藻的重要捕光色素蛋白，能將吸收的光能高效快速傳遞給光合反應(yīng)中心[37]，Rubisco大亞基直接參與光合作用固定CO2，同時，硒可參與輔酶A和輔酶Q的合成，影響非特異性磷酸化酶的活性和ATP形成的速率[38]。因此，這些蛋白質(zhì)及酶含量增加有助于提高藻細胞的光合作用能力。

硒不但提高螺旋藻的光合作用能力，還可以提高藻細胞的含碳率和固碳速率。本研究中，螺旋藻的含碳率和固碳速率均為低濃度處理組(1、10 mg/L)顯著高于高濃度處理組(50、100 mg/L)，與對照組相比，1 mg/L處理組固碳速率顯著提高了26.86%，達153.32 mg/(L·d)(見圖5)。硒是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性成分，具有抗氧化作用。Othman等[39]研究發(fā)現(xiàn)，硒能顯著提高SOD、GSH-Px的活性，使GSH含量增加，增強細胞的抗氧化能力，清除活性氧自由基，還能提高捕光色素蛋白如藻藍蛋白、別藻藍蛋白及葉綠素a的含量，增強細胞的光合固碳能力[40-42]。Zhong等[20]的研究結(jié)果表明，較低的硒濃度(≤750 mg/L)提高石莼細胞內(nèi)過氧化物酶(GPX、CAT、POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性及光合色素含量，有助于降低活性氧(ROS)水平，維持藻細胞較好的生理狀態(tài)，提高藻細胞的光合作用能力和固碳效率，但高濃度硒(≥1 000 mg/L)對石莼細胞產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)活力下降，細胞凋亡。本研究中，高濃度硒(50、100 mg/L)抑制藻細胞生長，與對照組相比，固碳速率分別顯著下降了52.9%和61.2%。有研究表明，硒濃度較低時作為抗氧化劑，而在較高濃度時，硒則作為氧化劑導(dǎo)致細胞的抗氧化能力降低，活性氧(ROS)水平升高，引起蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)的氧化損傷，最終細胞死亡[19,43-44]。另外，藻細胞硒代謝過程中產(chǎn)生的硒化氫對細胞色素氧化酶有強烈的抑制作用[43]，硒能與氨基酸的巰基反應(yīng)，抑制巰基酶活性[45]，高濃度亞硒酸鈉能使藻細胞葉綠素含量降低，從而影響光合作用[46]。

4 結(jié)語

本實驗使用改良的Zarrouk培養(yǎng)基，設(shè)置不同的硒濃度，在光照為70～80μmoL·m-2·s-1(LED光源)，溫度為(30±1)℃條件下培養(yǎng)鈍頂螺旋藻，結(jié)果表明，較低的硒濃度(1 和10 mg/L)促進藻細胞生長，硒濃度為1 mg/L時，培養(yǎng)10 d后，其最終生物量達1.04 g/L，比生長速率為0.27 d-1，固碳速率最高為153.32 mg/(L·d)，綜合考慮生長及固碳率速，培養(yǎng)鈍頂螺旋藻的最佳硒濃度為1 mg/L。本實驗可為大規(guī)模培養(yǎng)富硒鈍頂螺旋藻提供一定的參考。