丁海燕，李曉捷，郭 栗，楊官品

(1.中國(guó)海洋大學(xué)教育部海洋遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003；2.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003；3.國(guó)家海藻海參工程科學(xué)與技術(shù)研發(fā)中心 山東 煙臺(tái) 264003；4.海藻遺傳改良和高效栽培山東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264003；5.山東東方海洋科技股份有限責(zé)任公司，山東 煙臺(tái) 264003；6.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所，山東 青島 266003)

不等鞭毛總門的褐藻與后鞭毛生物(如動(dòng)物和真菌)和植物(植物、綠藻和紅藻等)的進(jìn)化存在平行性，兩類生物有相似的先天免疫機(jī)制和脅迫防御反應(yīng)機(jī)制[1-3]。先天免疫機(jī)制不同于脅迫防御應(yīng)答機(jī)制。防御機(jī)制可經(jīng)受體引發(fā)對(duì)病原體的抵抗[4-5]。最近，在模式褐藻長(zhǎng)襄水云基因組中就找到了防御有關(guān)的受體[6]。過氧化物爆發(fā)導(dǎo)致局部活性氧簇(Radical oxygen species,ROS)濃度急劇升高，是防御應(yīng)答機(jī)制之一。這一機(jī)制在人[7]、植物[8]和褐藻[2]中都存在。病原體感染導(dǎo)致膜釋放十八碳(植物)和二十碳(動(dòng)物)脂肪酸，用于合成氧脂素(Oxylipin)。海帶同時(shí)存在這兩類氧脂素生物合成途徑[9-14]。

海帶(Saccharinajaponica)屬于囊泡藻界，不等鞭毛總門，褐藻綱，海帶目，海帶科，海帶屬。上1920—1930年代日本引入中國(guó)栽培。海帶是孢子體世代和配子體世代交替型生活史，從幼嫩孢子體長(zhǎng)為成熟孢子體的過程中面臨諸多環(huán)境脅迫。中國(guó)海帶栽培主要是“浮繩網(wǎng)藻體倒置避夏”栽培模式。海帶的生長(zhǎng)區(qū)直接面對(duì)強(qiáng)紫外線、強(qiáng)陽(yáng)光、高溫度和頻繁的光照和溫度波動(dòng)，而藻體的梢部卻指向弱光、相對(duì)低溫的海底。海帶栽培集約化程度高，面積大，藻體密集，經(jīng)常與動(dòng)物養(yǎng)殖空間重疊。大尺度、大范圍的環(huán)境溫度波動(dòng)和海水酸化，海水富營(yíng)養(yǎng)化也逐步演變成不可忽略的環(huán)境影響因子。這些因素單獨(dú)或組合作用，導(dǎo)致海帶孢子體處于持續(xù)性的免疫和防御狀態(tài)。有報(bào)道稱L.digitata受環(huán)境刺激后可識(shí)別其細(xì)胞壁多糖的分解碎片，觸發(fā)局部過氧化物爆發(fā)[15-16]，防御相關(guān)基因的表達(dá)，釋放游離脂肪酸[17]、加強(qiáng)鹵素代謝[18]。

褐藻是唯一利用無機(jī)碘抵抗細(xì)胞外氧化脅迫的生物。碘合成可高效去除過氧化物爆發(fā)產(chǎn)生的過量過氧化氫和過氧根離子[19]。催化鹵素合成的釩依賴鹵素過氧化物酶(Vanadium-dependent halogenperoxidase,vHPO)是一類過氧化物酶，依其對(duì)鹵素離子催化效率的不同，分為釩依賴氯過氧化物酶(vCPO)、釩依賴溴過氧化物酶(vBPO)和釩依賴碘過氧化物酶(vIPO)三類。3種過氧化物酶中，vCPO只存在于陸地植物中，而另外兩種存在于海洋藻類，尤其是褐藻中。研究發(fā)現(xiàn)vBPO基因能催化碘離子與過氧化氫反應(yīng)生成次碘酸，而次碘酸進(jìn)一步將碘離子氧化為碘分子。反應(yīng)過程為：I-+ H2O2→ HIO + OH-;HIO + I-+ H+→ I2+ H2O。

vBPO在海帶免疫應(yīng)答和防御中發(fā)揮重要作用[2]。為弄清海帶vBPO基因的表達(dá)模式隨海帶生長(zhǎng)發(fā)育的變化關(guān)系及其與藻體碘含量的關(guān)系，探究海帶在生長(zhǎng)發(fā)育過程中免疫防御反應(yīng)的變化，本研究通過轉(zhuǎn)錄組分析研究了正常栽培海帶不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期vBPO基因的表達(dá)模式。

1 材料和方法

1.1 RNA提取和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

本研究所用的海帶孢子體為東方7號(hào)[20]，分別在4個(gè)發(fā)育時(shí)期，即薄嫩期(Mushroom stage)、厚成期(Adult stage)、成熟期(Mature stage)和衰老期(Aging stage)采集兩株，取其生長(zhǎng)點(diǎn)組織，用無菌海水徹底清洗表面粘液后，在液氮中研磨成粉末，用除多糖多酚的RNA提取試劑盒提取RNA，溶于DEPC處理過的重蒸水，用NanoDrop測(cè)定濃度，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整度和可能的基因組DNA污染。合格RNA迅速置于-80℃冰箱中保存。

用Oligo(dT)磁珠富集mRNA，片段化后用六堿基隨機(jī)引物合成第一鏈cDNA，然后用DNA polymerase I和RNase H合成第二鏈cDNA，再用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。末端修飾并加A尾后與測(cè)序接頭連接，再用AMPure XP beads選擇片段大小，PCR擴(kuò)增，用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，富集150～200 bp的cDNA形成測(cè)序文庫(kù)。將文庫(kù)用Qubit2.0定量，稀釋至1.5 ng/μL，用Agilent 2100檢測(cè)片段大小，合格后用Q-PCR方法進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫(kù)有效濃度>2nmol/L)，在Illumina HiSeq平臺(tái)上測(cè)序。

去除含接頭、不確定堿基比例大于0.1%、Q≤20堿基數(shù)≥50%的初始讀序(raw reads)獲得凈讀序(cleanreads)。將凈讀序用Trinity[21]進(jìn)行拼接(k=25，最小kmer覆蓋度=2)。用 FPKM方法校正轉(zhuǎn)錄本豐度，消除序列長(zhǎng)度和測(cè)序深度影響[21]，實(shí)現(xiàn)豐度標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 碘含量測(cè)定

與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序用海帶孢子體同步采集4個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期的東方7號(hào)海帶孢子體，每時(shí)期3株，通風(fēng)處曬干后用粉碎機(jī)粉碎成≤400目的顆粒，均勻混合后用NaNO2-尿素法測(cè)量碘的含量[22]。

1.3 海帶vBPO基因表達(dá)模式分析

海帶4個(gè)時(shí)期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的組裝物(unigene，后續(xù)分析轉(zhuǎn)稱為基因)針對(duì)Nr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋，根據(jù)注釋信息獲取海帶vBPO基因及其對(duì)應(yīng)各時(shí)期的轉(zhuǎn)錄本豐度。利用OmicShare tools2.0(www.omicshare.com)繪制vBPO基因表達(dá)熱圖。

1.4 海帶vBPO分子系統(tǒng)學(xué)分析和結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

從海帶4個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)中提取vBPO基因的序列，用Unipro UGENE軟件(http://www.x64bitdownload.com/download/t-64-bit-unipro-ugene-64-bit-download-jheuyjsm.html)獲得其開放閱讀框(openreadingframe,ORF)并推導(dǎo)其氨基酸序列。在NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載不同物種的vBPO序列。將這些序列用MAFFT(http://www.softpedia.com/get/Science-CAD/MAFFT.shtml)進(jìn)行對(duì)位分析，然后用MrBayes3.2(http://mrbayes.csit.fsu.edu/)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。最后獲取的系統(tǒng)樹是1 000次重復(fù)計(jì)算的結(jié)果。為進(jìn)一步確定海帶vBPO基因，用NCBI的CD-Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)工具對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 海帶vBPO基因表達(dá)模式

海帶孢子體4個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得196 238 671條凈讀序，組裝成133 516條不重復(fù)基因(Unigene,以下改稱基因)。這些基因中，只有33.84%可針對(duì)NR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋，19.25%針對(duì)SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋，32.95%針對(duì)PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋，33.06%針對(duì)GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋。另外，可注釋的基因中，絕大部分是病毒、轉(zhuǎn)座子等先關(guān)蛋白。海帶是非模式物種，進(jìn)化上與已知模式物種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這給我們基于基因的功能注釋理解海盜生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的生理學(xué)變化造成巨大困難。

幸運(yùn)的是針對(duì)NR數(shù)據(jù)庫(kù)的功能注釋獲得59條可能編碼vBPO的基因(見表1)。因?yàn)楹Щ蚪M序列碎片化嚴(yán)重，無參轉(zhuǎn)錄組分析可能使轉(zhuǎn)錄本組裝也碎片化，我們轉(zhuǎn)而將133 457個(gè)基因的平均豐度作為59個(gè)vBPO基因轉(zhuǎn)錄本豐度的參照。我們發(fā)現(xiàn)海帶vBPO基因轉(zhuǎn)錄本平均豐度是相應(yīng)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的9～19倍，平均13倍。這說明，vBPO基因在海帶孢子體生長(zhǎng)發(fā)育過程中始終高表達(dá)，間接地反映出栽培海帶孢子體很可能持續(xù)性處于脅迫響應(yīng)生理狀態(tài)。

海帶孢子體不同發(fā)育時(shí)期，59個(gè)vBPO基因表達(dá)模式不同(見圖1)。在薄嫩期、厚成期、成熟期和衰老期，這些基因的轉(zhuǎn)錄本豐度(表達(dá)量)存在顯著差異。相對(duì)而言，vBPO基因在成熟期和衰老期的表達(dá)模式更相似，而薄嫩期和厚成期更相似。海帶孢子體不同發(fā)育時(shí)期碘含量逐期增加，薄嫩期為(0.30±0.00)‰，厚成期為(0.38±0.07)‰，成熟期為(1.57±0.05)‰，衰老期為(2.32±0.09)‰。碘含量與vBPO基因平均表達(dá)量成正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)0.974)。

表1 海帶不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期vBPO基因的表達(dá)豐度和轉(zhuǎn)錄組分析組裝長(zhǎng)度Table 1 The abundance and length of the kelp vBPO gene transcripts

續(xù)表1

注：基因轉(zhuǎn)錄本豐度用FPKM值表示；*，小數(shù)點(diǎn)位數(shù)原因，計(jì)為零。
Note:The abundance of genes are expressed as the FPKM value;*,due to

2.2 海帶vBPO分子系統(tǒng)學(xué)分析及結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

表達(dá)模式分析是基于注釋信息進(jìn)行的。為進(jìn)一步證實(shí)這些組裝物是vBPO基因，我們將59個(gè)注釋為vBPO基因中包含完整開放閱讀框的4個(gè)vBPO基因(GenBank存取號(hào)：MH430667、MH430668、MH430669、MH430670)逆翻譯(推導(dǎo))成氨基酸序列，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載16個(gè)物種的28條vBPO氨基酸序列，用這些序列構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。分析發(fā)現(xiàn)海帶4條vBPO氨基酸序列與掌狀海帶的vBPO親緣關(guān)系近，與所有褐藻vBPO氨基酸序列聚在一起。說明這4條海帶vBPO基因確實(shí)是vBPO基因(見圖2)。

對(duì)4條海帶vBPO基因?qū)?yīng)的氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們的結(jié)構(gòu)域相同，第339～602位氨基酸組成PAP2_like蛋白結(jié)構(gòu)域，具有組氨酸磷酸酶和釩依賴鹵素過氧化物酶催化活性基團(tuán)，第418～426位的KWQVHRMLR序列、從第493～495位的SGH序列和從第575～584位的RSHLGVHWRMD的序列是釩結(jié)合位置(見圖2)。

(①M(fèi)ushroom stage；②Adult stage；③Mature stage；④Aging stage。(A)vBPO基因表達(dá)豐度熱圖；(B)FPKM值≥10的vBPO基因表達(dá)豐度折線圖；(C)FPKM值≥1但<10的vBPO基因表達(dá)豐度折線圖；(D)FPKM值>0但<1的vBPO基因表達(dá)豐度折線圖。(A)The heatmap of kelpvBPOgenes;(B)The line chart of kelpvBPOgenes with FPKM values≥10;(C)The line chart of kelpvBPOgenes with FPKM values≥1 but <10;(D)The line chart of kelpvBPOgenes with FPKM values>0 but <1.)
圖1 海帶vBPO基因在四個(gè)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式
Fig.1 The expression abundance heatmap of kelpvBPOgenes during its growth and development

圖2 從有完整開放閱讀框的海帶vBPO基因推導(dǎo)的氨基酸序列與其他物種vBPO的分子系統(tǒng)學(xué)關(guān)系(上)及結(jié)構(gòu)域(下)Fig.2 Phylogenetic relationship of the deduced amino acid sequences from annotated kelp vBPO genes containing the whole open reading frame with those retrieved from GenBank(above)and their structural domain (below)

PAP2_like蛋白是組氨酸磷酸酶和釩依賴鹵素過氧化物酶等組成的酶超家族，有磷脂酸磷酸酶、磷酸酯磷酸酶、葡萄糖-6磷酸酶、葉綠體膜脂磷酰甘油磷酸酶B、釩依賴氯/溴過氧化物酶等亞家族，有些酶是跨膜蛋白。本研究中未發(fā)現(xiàn)海帶vBPO的跨膜區(qū)。Colin等發(fā)現(xiàn)第409～418位氨基酸和第475～492位氨基酸是釩結(jié)合區(qū)[23]。第409～418位氨基酸為KWQVHRMLRP，這一區(qū)域與海帶vBPO第418～427位氨基酸序列完全一致。結(jié)構(gòu)域分析也證實(shí)注釋為海帶vBPO的基因確實(shí)是vBPO。

3 討論

本研究用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法分析了海帶孢子體包括薄嫩期、厚成期、成熟期和衰老期在內(nèi)4個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期vBPO基因的表達(dá)模式，并通過分子系統(tǒng)學(xué)分析和結(jié)構(gòu)域比較驗(yàn)證了海帶的這些基因確實(shí)是vBPO基因；發(fā)現(xiàn)海帶vBPO基因轉(zhuǎn)錄本在4個(gè)發(fā)育時(shí)期的平均豐度是相應(yīng)時(shí)期全部基因轉(zhuǎn)錄本的平均豐度的9～19倍，平均13倍，說明海帶天然免疫和防御應(yīng)答機(jī)制之一的碘富集過程持續(xù)性處于活躍狀態(tài)；發(fā)現(xiàn)海帶vBPO基因的表達(dá)量與海帶孢子體碘含量呈正相關(guān)。這些認(rèn)知對(duì)海帶抗病抗逆生理機(jī)制解析具有重要意義，是海帶抗病抗逆機(jī)制研究的新嘗試。

海帶基因組測(cè)序已經(jīng)測(cè)序[24]。同源性搜索已在發(fā)表的海帶基因組中找到了豐富的vBPO基因拷貝。但是已發(fā)表的海帶基因組序列片段化嚴(yán)重，達(dá)不到參考基因組的程度，搜索結(jié)果只能說明海帶基因組存在豐富的vBPO基因。如果是有參轉(zhuǎn)錄組分析，我們就能了解不同基因的轉(zhuǎn)錄特征。但是，由于已發(fā)表基因組序列的局限性，我們可能遺漏有關(guān)基因?；谶@樣的考慮，我們選擇了無參轉(zhuǎn)錄組分析。分析過程中發(fā)現(xiàn)多數(shù)轉(zhuǎn)錄本組裝物不完整。這又可能影響平均表達(dá)豐度的計(jì)量。因此，參考基因組質(zhì)量的海帶基因組序列對(duì)轉(zhuǎn)錄組分析具有重要的意義。然而，我們不得不等待高質(zhì)量基因組序列的發(fā)表。值得慶幸的是已經(jīng)有用實(shí)時(shí)單分子測(cè)序(三代測(cè)序)技術(shù)結(jié)合二代測(cè)序測(cè)定海帶孢子體基因組獲得參考基因組質(zhì)量的海帶基因組序列的工作(個(gè)人了解)。這將為深入研究海帶抗病抗逆機(jī)制提供背景數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

多拷貝基因的表達(dá)調(diào)控效率是比較低的，海帶需要在不同脅迫條件、不同發(fā)育時(shí)期選擇不同拷貝基因的表達(dá)并協(xié)調(diào)這些基因的作用。海帶不同vBPO基因結(jié)構(gòu)、它們的表達(dá)模式及其與生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期和不同脅迫條件的關(guān)系為深入研究海帶多拷貝基因的系統(tǒng)表達(dá)提供了一個(gè)切入點(diǎn)。

海帶vBPO基因轉(zhuǎn)錄本相對(duì)豐度是與全部轉(zhuǎn)錄本平均豐度比較獲得的相對(duì)值。我們最初想選擇四個(gè)時(shí)期表達(dá)量基本恒定的基因群的平均表達(dá)量作為內(nèi)參來確定vBPO基因的相對(duì)表達(dá)量，但這些基因的表達(dá)量只是相對(duì)恒定。與vBPO基因一樣，無參組裝獲得的這些基因的序列也存在不完整性。既然都不完整，且是在相同的分析條件下比較。我們選擇了全部組裝物的平均豐度做對(duì)照來確定vBPO基因的相對(duì)表達(dá)豐度。海帶基因的表達(dá)分析也可以參考其他物種選擇內(nèi)參基因?；谙嗨频目紤]，我們沒有這樣做。

需要特別強(qiáng)調(diào)的是，本研究的表達(dá)分析針對(duì)的是多拷貝基因?；蛐蛄懈叨认嗨?。在這樣的情況下，實(shí)時(shí)定量PCR方法很難設(shè)計(jì)引物來區(qū)分不同的基因拷貝。但基于測(cè)序的轉(zhuǎn)錄組分析可以克服這一限制，實(shí)現(xiàn)不同基因拷貝的區(qū)分。在方法上，本研究將為多拷貝基因的表達(dá)分析提供一種方法學(xué)借鑒。

4 結(jié)語(yǔ)

分子系統(tǒng)學(xué)和結(jié)構(gòu)域分析證實(shí)轉(zhuǎn)錄組分析注釋的海帶vBPO基因確實(shí)是vBPO基因。海帶vBPO基因存在多個(gè)拷貝，在4個(gè)時(shí)期持續(xù)性選擇性地表達(dá)，且平均表達(dá)量遠(yuǎn)高于總體基因平均表達(dá)量。這說明現(xiàn)行栽培模式下，海帶孢子體有可能處于持續(xù)性脅迫響應(yīng)狀態(tài)，為解釋頻發(fā)的生理性病害提供了一種可能性。轉(zhuǎn)錄組分析組裝獲得多條vBPO基因序列，這與海帶基因組存在眾多vBPO基因拷貝對(duì)應(yīng)，但這些基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式及其與生長(zhǎng)時(shí)期和脅迫環(huán)境間的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。