朱瑋芳，王莉莉，徐 滌，王 潔，李鳳婷，閆 昊

(中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點實驗室，海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003)

龍須菜(Gracilariopsislemaneiformis)廣泛分布于中國的黃海海域[1]，是中國重要的栽培海藻，主要作為提取瓊膠的原料，也大量用于鮑魚養(yǎng)殖等。隨著龍須菜養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展壯大，龍須菜的種質(zhì)退化現(xiàn)象也越來越嚴(yán)重，盡管目前已有多個高產(chǎn)的新品種，如981龍須菜[2]、龍須菜2008[3]、魯龍1號[4]等，但仍然無法完全滿足生產(chǎn)上的需求。此外，目前龍須菜的養(yǎng)殖方式為營養(yǎng)繁殖，其苗種的來源與保存都存在一定風(fēng)險。為了獲得穩(wěn)定可控的苗種來源以及更精準(zhǔn)的品種改良方法，都要求對其世代交替的繁殖發(fā)育調(diào)控機制有更加深入的認(rèn)識。

龍須菜是典型的真紅藻亞綱(Florideophycidae)的三世代型生活史，包括二倍的四分孢子體以及附生于雌配子體藻枝上的果孢子體世代和單倍的配子體世代[5]，其四分孢子體與雌雄配子體分別萌發(fā)自果孢子和四分孢子，但萌發(fā)的時間和空間相同，可形成混雜的群落。在成熟之前形態(tài)大小完全相同，無法進(jìn)行區(qū)分[6]。

通過轉(zhuǎn)錄水平的比較分析來尋找世代差異表達(dá)的基因在紅藻相關(guān)研究中已經(jīng)不少的報道。例如在紫菜(Pyropia/Porphyra)屬中，曾報道在孢子體中特異表達(dá)的一種延長因子EF-1a[7]；還有在配子體中發(fā)現(xiàn)的依賴于特殊啟動子元件的PyKPA1基因，可編碼鈉離子泵[8-9]；此外還有研究通過抑制性消減雜交對紫菜配子體和孢子體形態(tài)差異相關(guān)候選基因進(jìn)行分析注釋，發(fā)現(xiàn)配子體更趨向于具有生長和自我保護(hù)的趨勢，而孢子體在發(fā)育過程中更活躍[10]。在江蘺中也報道了在果孢子體中特有的泛素基因[11]和硫轉(zhuǎn)運酶等基因[12]以及在雌配子體中特異表達(dá)的gmf-01基因[13]。丁弘葉等[14]還通過AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，得到了一個在四分孢子體和雌配子體中穩(wěn)定表達(dá)，而在雄配子體中不表達(dá)的遺傳標(biāo)記。

本文將利用ContigExpress、Blast2GO等生物信息學(xué)軟件對實驗所得1 873條有效序列進(jìn)行進(jìn)一步的聚類和分析，進(jìn)一步整理并深入理解以上消減雜交的結(jié)果，并利用實時熒光定量PCR的方法對部分差顯序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的比較和驗證，為后續(xù)江蘺屬紅藻世代交替及發(fā)育的研究提供數(shù)據(jù)并開拓思路。

1 材料與方法

1.1 實驗用材料

文庫構(gòu)建及RT-qPCR驗證所用材料為本實驗室保種的一株采自青島湛山灣的野生龍須菜四分孢子體以及由它放散的四分孢子所萌發(fā)培養(yǎng)的雌配子體和雄配子體各一株。以這3個樣品進(jìn)行實驗?zāi)康氖潜M量減少遺傳背景的差異。

1.2 序列的聚類和Blast2GO分析

本實驗室在前期工作中構(gòu)建了5個正反向的龍須菜雌、雄配子體間以及它們分別與四分孢子體之間的抑制性消減雜交文庫，再通過斑點雜交方法在各庫中進(jìn)一步對差異顯示序列進(jìn)行篩查，盡量去除假陽性片段。根據(jù)斑點雜交結(jié)果，總共獲得2 682個差異顯示的陽性克隆(陽性克隆的定義為該克隆與本組差減產(chǎn)物探針雜交的信號值同與反向差減產(chǎn)物探針雜交的信號值的比值≥2)，測序后共獲得1 873條可用序列(見表1)[15]。將所得數(shù)據(jù)全部導(dǎo)入ContigExpress中進(jìn)行聚類并檢查聚類結(jié)果的可行性，減少因PCR擴增或是測序過程中產(chǎn)生的堿基錯誤而造成的誤差。最后將這些經(jīng)過聚類的序列導(dǎo)入Blast2GO軟件，進(jìn)行一系列的比對和注釋。

表1 斑點雜交陽性克隆的測序結(jié)果統(tǒng)計Table 1 The positive clones and effective sequences for the dot-blot results

注：未成熟的藻體即距離藻枝尖端1 cm以內(nèi)的藻枝部分；成熟的藻體即距離藻枝尖端1 cm以下的主枝部分。
Note:Immature branches indicate the upper part of branches less than 1cm from the tip.Mature branches indicate the part of branches below the tip.

1.3 龍須菜藻體總RNA提取和cDNA合成

分別稱取龍須菜雌配子體、雄配子體和四分孢子體各約100 mg，于盛有液氮的研缽中迅速研磨至粉末，利用RNase-Free產(chǎn)品提取各樣品的總RNA。利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的總RNA質(zhì)量，并用NanoDrop 2000C測定總RNA的濃度，用以計算反轉(zhuǎn)錄時總RNA的用量。分別以上述步驟提取的4種總RNA為模板，用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈的cDNA，將所得cDNA樣品置于-20°C冰箱貯藏備用。

1.4 部分候選差顯基因的實時熒光定量PCR(RT-qPCR)驗證

根據(jù)比對結(jié)果中的GO IDs、KEGG Pathway Map和序列所在SSH文庫的代表性，本輪實驗選擇了9個重疊群(contig-03、contig-11、contig-19、contig-35、contig-44、contig-52、contig-60、contig-114、contig-116)及3個單條序列(7310、8142、0125)共12條候選基因，采用RT-qPCR的方法對SSH文庫篩選的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的定量驗證。

首先進(jìn)行差異基因RT-qPCR反應(yīng)的引物設(shè)計與反應(yīng)條件優(yōu)化，使用RealMaster Mix (SYBR Green)試劑盒(TIANGEN)進(jìn)行PCR反應(yīng)，使用儀器為ABI 7500熒光定量PCR儀，反應(yīng)步驟如下：95 ℃ 5 min,95 ℃ 1 min,54 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,35個循環(huán)，最后72 ℃延長10 min。內(nèi)參基因使用的是本實驗篩選出兩個在龍須菜不同世代中表達(dá)穩(wěn)定的rbcL和Co基因?qū)嶒灁?shù)據(jù)進(jìn)行分析[16]。待測基因的相對定量表達(dá)以2-ΔΔCt方法進(jìn)行計算[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍須菜抑制性消減雜交差異表達(dá)基因的聚類

去除載體后得到1 873條序列，將其用Vector NTI Suite 6.0軟件中的ContigExpress進(jìn)行聚類分析，最終獲得118個重疊群(contig)，以及未被聚類進(jìn)任何一個重疊群的247條單條序列，共計365個基因片段序列。

2.2 生物信息學(xué)分析

本實驗對得到的118個重疊群及247條單條序列利用Blast2GO在線軟件進(jìn)行分析及注釋。結(jié)果顯示，應(yīng)用blastx搜索比對上的序列所對應(yīng)的生物物種大多數(shù)來自植物，但非常分散，在比對上的3 000條序列中，匹配數(shù)較高的物種有玉米(Zeamays)(52次)、小立碗蘚(Physcomitrellapatens)(53次)、水稻(Oryzasativa)(57次)、蒺藜苜蓿(Medicagotuncatula)(59次)和大豆(Glycinemax)(65次)等，前10名物種比對上的序列僅有437條。圖1中列出e值最小，即匹配度最高的blast對應(yīng)的物種。結(jié)果的指向性更加明確，在比對上的183條序列中，匹配次數(shù)最高的的物種為：隱藻(Guillardiatheta)(3次)、條斑紫菜(Pyropiayezoensis)(3次)、極地膠球藻(Coccomyxasubellipsoidea)(4次)、龍須菜(G.lemaneiformis)(4次)、銅綠微囊藻(Microcystisaerugisona)(5次)、細(xì)基江蘺(Gracilariatenuistipitata)(5次)、長囊水云(Ectocarpussiliculosus)(6次)、蒺藜苜蓿(Medicagotuncatula)(6次)、小立碗蘚(Physcomitrellapatens)(9次)等，其中日本凋毛藻(Griffithsiajaponica)(17次)最多，共計62次，并且物種中藻類明顯增加。同時，可以看到blast結(jié)果中顯示大量沒有任何序列可以匹配的待測序列，推測為紅藻或龍須菜及其近緣物種的特有基因，這些序列也是未來研究的難點和重點。

圖1 Blast匹配度最高的物種分布圖Fig.1 Top-Hit species distribution

將GO注釋過的基因歸類到基因本體論的三大詞條下，如圖2、3、4所示。在對生物學(xué)途徑注釋結(jié)果的分析中發(fā)現(xiàn)，其中最多的為參與機體的代謝途徑的序列(210條)，另外包括有關(guān)細(xì)胞途徑、生物調(diào)控、生物合成、信號傳遞、復(fù)制、應(yīng)激反應(yīng)、發(fā)育過程、細(xì)胞定位、細(xì)胞組分生源的序列等。分子功能注釋結(jié)果中，包括與轉(zhuǎn)移酶活性、水解酶活性、裂合酶活性、氧化還原酶活性等酶活性相關(guān)的序列，以及與小分子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、核酸結(jié)合、離子結(jié)合等結(jié)合相關(guān)的序列等。細(xì)胞組件注釋結(jié)果中，包括細(xì)胞組分、蛋白質(zhì)復(fù)合體組分、無膜細(xì)胞器組分、有膜細(xì)胞器組分等，分析顯示其絕大多數(shù)都在細(xì)胞(71條)、細(xì)胞器(78條)及蛋白質(zhì)復(fù)合體(23條)水平進(jìn)行描述。

2.3 熒光定量結(jié)果分析

本輪實驗原本選擇了9個重疊群(contig-03、contig-11、contig-19、contig-35、contig-44、contig-52、contig-60、contig-114、contig-116)及3個單條序列(7310、8142、0125)共12條候選基因。由于測序所得片段并非基因全長，最終僅有8條序列優(yōu)化出合適的反應(yīng)引物，進(jìn)行了RT-qPCR驗證。檢測基因及內(nèi)參基因所使用的引物見表2。

(Viral reproduction process 病毒繁殖過程 Transposition 轉(zhuǎn)座 System process 系統(tǒng)進(jìn)程 Stem cell proliferation 干細(xì)胞增殖 Small molecule metabolic process 小分子代謝過程 Sexual reproduction 有性生殖 Secondary metabolic process 次生代謝過程 Response to stress 應(yīng)激反應(yīng)，脅迫應(yīng)答 Response to other organism 對其他生物體的反應(yīng) Response to external stimulus 應(yīng)對外部刺激 Response to endogenous stimulus 應(yīng)對內(nèi)源性刺激 Response to chemical stimulus 應(yīng)對化學(xué)刺激 Response to biotic stimulus 應(yīng)對生物刺激 Response to abiotic stimulus 應(yīng)對非生物刺激 Reproductive process 生殖過程 Regulation of molecular function 分子功能的調(diào)控 Regulation of body fluid levels 體液水平的調(diào)控 Regulation of biological quality 生物質(zhì)量的調(diào)控 Regulation of biological process 生物過程的調(diào)控 Primary metabolic process 初級代謝過程 Pigment metabolic process 色素代謝過程 Pathogenesis 發(fā)病機制 Oxidation-reduction process 氧化還原過程 Organophosphate metabolic process 有機磷代謝過程 Organic substance metabolic process 有機物質(zhì)代謝過程 Nitrogen compound metabolic process 氮化合物代謝過程 Multicellular organismal signaling 多細(xì)胞有機體的生物信號 Multicellular organismal metabolic process 多細(xì)胞有機體的代謝過程 Multicellular organismal development 多細(xì)胞有機體的發(fā)育 Multicellular organismal reproduction 多細(xì)胞有機體的繁殖 Microtubule-based process 基于微管的生物過程 Methylation 甲基化 Macromolecule metabolic process 大分子代謝過程 Anatomical structure development 解剖結(jié)構(gòu)發(fā)育 Biosynthetic process 生物合成過程 Catabolic process 分解代謝過程 Cell activation 細(xì)胞活化 Cell communication 細(xì)胞通訊 Cell cycle 細(xì)胞周期 Cell death 細(xì)胞死亡 Cell division 細(xì)胞分裂 Cell growth 細(xì)胞生長 Cell-cell signaling 細(xì)胞間信號 Cellular component biogenesis 細(xì)胞組分的生物發(fā)生 Cellular component organization 細(xì)胞組分的組織結(jié)構(gòu) Cellular component organization and biogenesis at cellular level 細(xì)胞水平上細(xì)胞組分結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生 Cellular developmental process 細(xì)胞發(fā)育過程 Cellular homeostasis 細(xì)胞穩(wěn)定性 Cellular localization 細(xì)胞定位 Cellular metabolic process 細(xì)胞代謝過程 Cellular response to stimulus 細(xì)胞對刺激的反應(yīng) Chromosome segregation 染色體分離 Coagulation 凝結(jié)物 Digestion 消化 Establishment of localization 定位的建立 Immune effector process 免疫效應(yīng)過程 Immune response 免疫反應(yīng) Interspecies interaction between organisms 生物體種間相互作用 Macromolecule localization 大分子定位)
圖2 生物過程功能分類中水平3的匹配序列數(shù)目
Fig.2 Number of hits for biological process at Level 3

(Transmembrane transporter 跨膜轉(zhuǎn)運蛋白 Transferase activity 轉(zhuǎn)移酶活性 Transcription factor binding 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的 Tetrapyrrole binding 結(jié)合四吡咯的 Substrate-specific 基質(zhì)特異性 Structural constituent of ribosome 結(jié)構(gòu)組成型核糖體 Small molecule binding 結(jié)合小分子的 Site-specific recombinase 位點特異重組酶 Sequence-specific DNA 序列特異DNA Protein binding 結(jié)合蛋白質(zhì)的 Cofactor binding 結(jié)合輔助因子的 Enzyme activator activity 酶激活物活性 Hydrolase activity 水解酶活性 Integrase activity 整合酶活性 Ion binding 結(jié)合離子的 Isomerase activity 異構(gòu)酶活性 Ligase activity 連接酶活性 Lipid binding 結(jié)合脂質(zhì)的 Lyase activity 裂合酶活性 Metal cluster binding 結(jié)合金屬原子簇的 Nucleic acid binding 結(jié)合核酸的 Oxidoreductase activity 氧化還原酶活性 Peroxidase activity 過氧化酶活性 Phosphatase regulator 磷酸酶調(diào)節(jié)物)
圖3 分子作用功能分類中水平3的匹配序列數(shù)目
Fig.3 Number of hits for molecular function at Level 3

(Virion part 病毒粒子部分 Vesicle 囊泡 Protein-DNA complex DNA蛋白復(fù)合體 Protein complex 蛋白質(zhì)復(fù)合體 Organelle part 細(xì)胞器部分 Non-membrane-bounded organelle 非膜系統(tǒng)的細(xì)胞器 Apoplast 質(zhì)外體 Cell part 細(xì)胞部分 Cell-cell junction 細(xì)胞間連接 extracellular region part 細(xì)胞外區(qū)域部分 Membrane part 膜部分 Membrane-bounded organelle 膜系統(tǒng)的細(xì)胞器)
圖4 細(xì)胞成分功能分類中水平3的匹配序列數(shù)目
Fig.4 Number of hits for cellular component at Level 3

表2 候選差顯基因熒光定量PCR反應(yīng)的引物序列Table 2 RT-qPCR primers for candidate differential expression genes

表3 候選差顯基因的來源和性質(zhì)Table 3 The original library and characters of candidate differential expression genes

以上8條候選序列選自各個SSH文庫，具有一定的代表性，其來源和性質(zhì)見表3。這里面既有來自于單個庫的多條序列拼接而成的contig及單條序列，也有出現(xiàn)在多個庫中的序列拼接而成的contig。因此有的基因僅僅出現(xiàn)在1個文庫內(nèi)，如contig-03、contig-11、contig-19、contig-52、contig-60以及7310；有的基因僅出現(xiàn)在一種藻體世代內(nèi)，如contig-35，盡管在2#和5#庫中都找到了該序列，但這兩個文庫都是成熟的雄配子體分別與成熟的雌配子體和未成熟的雄配子體雜交而來，所以它僅在成熟的雄配子體中調(diào)高表達(dá)；還有的基因不僅僅出現(xiàn)在一種藻體世代內(nèi)，如contig-44在多個庫中出現(xiàn)，且不屬于同一個世代，因此它們的情況更加復(fù)雜，需要謹(jǐn)慎和深入的分析。

圖5是8條候選序列的在龍須菜不同世代中的相對表達(dá)量，每個序列的結(jié)果都以3個樣品中表達(dá)量最低的值作為參照，每個樣品計算與其的差值作圖。這8條候選基因的實時熒光定量PCR的結(jié)果可以分為兩大類，一類是與SSH文庫篩選結(jié)果基本一致的，包括contig-03、contig-11、contig-52、contig-60以及7310；另一類則是與SSH文庫篩選結(jié)果不一致的，有contig-19、contig-35和contig-44這3條序列。

(①Tetrasporaphyte;②Immature female gametophyte;③Mature female gametophyte;④Male gametophyte.)圖5 8個待測序列在龍須菜不同世代中的相對表達(dá)定量分析Fig.5 The relative quantitation of the 8 candidate sequences in different phases of G.lemaneiformis

Contig-03來自3#庫，SSH文庫篩選結(jié)果顯示，其在成熟雌配子體的表達(dá)相對于未成熟雌配子體中調(diào)高。圖5(a)顯示的RT-qPCR結(jié)果同樣表明，該基因的確是在成熟雌配子體中的表達(dá)量顯著高于未成熟雌配子體，在四分孢子體和雄配子體中的表達(dá)量遠(yuǎn)低于雌配子體，因此contig-03有可能是一條真正與雌配子體世代相關(guān)的序列。

Contig-11來自2#庫，根據(jù)SSH文庫篩選結(jié)果是成熟的雄配子體相對于成熟的雌配子體中調(diào)高表達(dá)的序列。圖5(b)顯示的RT-qPCR結(jié)果表明該基因在成熟雄配子體中的表達(dá)量的確顯著高于成熟的雌配子體。但是，結(jié)果還顯示該基因在四分孢子體甚至是未成熟雌配子體中也有相似的調(diào)高表達(dá)，因此contig-11看起來并不是一條與雄配子體世代相關(guān)的特異序列。

Contig-52和contig-60這2個基因非常相似，都來自4#庫，根據(jù)SSH文庫篩選結(jié)果，未成熟雌配子體相對于成熟雌配子體調(diào)高表達(dá)。圖5(c)、(d)顯示的RT-qPCR結(jié)果表明這兩個基因在未成熟雌配子體中的表達(dá)量確實都高于在成熟的雌配子體中。但是，結(jié)果還顯示它們在四分孢子體中的表達(dá)量與在未成熟雌配子體中類似，也高于成熟雌配子體，因此這兩個基因應(yīng)該也都不是與雌配子體世代相關(guān)的序列。

序列7310來自7#庫，根據(jù)SSH文庫篩選結(jié)果是成熟的雌配子體相對于四分孢子體中調(diào)高表達(dá)的基因。圖5(h)顯示的RT-qPCR結(jié)果表明該基因在成熟與未成熟雌配子體中的表達(dá)量類似，都高于在四分孢子體中的表達(dá)量，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在雄配子體中的表達(dá)量，因此7310也很可能是一條真正與雌配子體世代相關(guān)的基因。

Contig-19來自2#庫，根據(jù)SSH文庫篩選結(jié)果該基因應(yīng)該在雄配子體中上調(diào)表達(dá)，但是圖5(c)顯示的RT-qPCR結(jié)果表明它在未成熟雌配子體和四分孢子體的表達(dá)量均遠(yuǎn)高于雄配子體，而在成熟雌配子體中的表達(dá)量也非常低，因此contig-19很可能只是一條與生長相關(guān)的基因序列。

Contig-35來自2#和5#庫，根據(jù)SSH文庫篩選結(jié)果，該基因的表達(dá)量應(yīng)該是雄配子體高于成熟雌配子體。而圖5(d)顯示的RT-qPCR結(jié)果表明它在成熟雌配子體中的表達(dá)量最高，這與SSH文庫篩選結(jié)果相反。但該基因在成熟的雌配子體以及雄配子體中的表達(dá)量均高于在未成熟雌配子體和四分孢子體中的表達(dá)量，暗示contig-35有可能與配子體世代相關(guān)。

Contig-44是由2#、8#和10#庫的多條序列混雜拼接而成的一條序列，因此本身就存在矛盾性，既可能在雄配子體中調(diào)高表達(dá)，也可能在四分孢子體中調(diào)高表達(dá)。圖5(e)顯示的RT- qPCR結(jié)果表明，該基因在未成熟雌配子體的表達(dá)量非常低，而在其它3種成熟藻體材料中的表達(dá)量都較高，說明contig-44可能是一條與成熟藻體生長相關(guān)的基因序列。

3 討論

通過Blast2GO進(jìn)一步對龍須菜SSH文庫中獲得的1 873條差異顯示基因的生物信息學(xué)分析可以看出，這些所得的序列廣泛分布在龍須菜生長發(fā)育的多種過程中，參與龍須菜多種生物學(xué)功能以及組分構(gòu)成，更加說明龍須菜性別和世代的遺傳是由多因子參與、多細(xì)胞共同完成的復(fù)雜生命活動。文庫中大多數(shù)的序列都沒有能夠比對上準(zhǔn)確的基因信息，說明這些序列有可能是龍須菜，或者親緣關(guān)系很近的江蘺屬物種，甚至是紅藻中所特有的基因，還需要大量細(xì)致的工作去揭示這一過程的遺傳調(diào)控。

根據(jù)Blastx的比對結(jié)果，提示contig-03 和contig-11分別與NADH脫氫酶活性和過氧化物酶的活性有關(guān)，而contig-44可能編碼α-1,4-葡聚糖裂解酶，7310與磷脂酰肌醇-3激酶基因有很高的相似性。其余4個序列均是功能未知的基因。

為了驗證SSH文庫所篩選到的差顯基因的可信度，確定真正在龍須菜不同世代及不同發(fā)育階段特異表達(dá)或差異表達(dá)的基因，本研究利用RT-qPCR方法對一些可能的差顯序列進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄水平的比較。通過上節(jié)對RT-qPCR結(jié)果的分析可以得出，contig-03和序列7310有可能是真正與雌配子體世代相關(guān)的序列，contig-35也有可能與配子體世代有關(guān)，而其余5個序列都基本只是與生長過程有關(guān)的基因。其中contig-03的部分序列與NADH脫氫酶活性有一定相似性，可能與發(fā)育過程中能量的需求有關(guān)；7310則顯示編碼磷脂酰肌醇-3激酶，可能參與了PI3K通路，與細(xì)胞的生長、極化和分化有關(guān)。但是contig-03與7310的RT-qPCR模式也不相同，盡管都是在雌配子體中的表達(dá)顯著高于四分孢子體和雄配子體，但contig-03在成熟雌配子體中的表達(dá)量顯著高于未成熟雌配子體，而7310在成熟與未成熟雌配子體中的表達(dá)量類似，這可解釋為contig-03是到雌配子體發(fā)育的后期才開始行使功能，而7310的表達(dá)從雌配子體早期發(fā)育階段就開始了。

在RT-qPCR驗證的8條序列中有5條序列與SSH文庫篩選結(jié)果基本一致，而另外3條與SSH文庫篩選結(jié)果不一致，說明SSH技術(shù)的確存在較高的假陽性率。但通過對斑點雜交結(jié)果重新的進(jìn)行聚類后分析以及RT-qPCR驗證，可得到更多更準(zhǔn)確的信息，例如contig-44這條序列既在四分孢子體文庫中出現(xiàn)，又在雄配子體文庫中出現(xiàn)，使人對它的作用產(chǎn)生疑惑，但經(jīng)聚類和RT-qPCR分析，發(fā)現(xiàn)該基因很可能在龍須菜成熟部分的表達(dá)高于在未成熟部分，它的注釋表明其編碼的是葡聚糖裂解酶。該酶可以將儲存物質(zhì)——紅藻淀粉降解為果糖，參與龍須菜的糖代謝[18]，因此在藻體成熟部分該基因看起來更加活躍。

由此可以看出，采取構(gòu)建多個SSH文庫共同篩選的方法可以較好過濾掉SSH文庫產(chǎn)生的假陽性克隆，使實驗結(jié)果更加準(zhǔn)確；而對斑點雜交結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的聚類分析和RT-qPCR驗證可以更加有效地提高實驗結(jié)果的可信度。