豆芳芳，龔小慶，鄒養(yǎng)軍

(1 西北農林科技大學 園藝學院/旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西 楊凌 712100；2 廣元市農業(yè)科學研究院，四川 廣元 628017)

類泛素蛋白RAD23(radiation sensitivity protein-23)，是UBL-UBA家族中的一種轉運蛋白，其主要功能為蛋白損傷修復[1-2]和蛋白酶體降解[3-5]。該類蛋白中有4個明顯的結構域，包括2個可以結合泛素或泛素化蛋白的UBA結構域[6-9]，1個與蛋白酶體受體結合的UBL結構域(如Rpn1、Rpn10、Rpn13等)[10-11]，以及1個位于2個UBA結構域之間的RAD4/XPC結構域[4]。在2個UBA結構域中，起主要調控作用的是位于C端中心區(qū)域的UBA1結構域，靠近C端末尾的UBA2區(qū)域缺失并不影響RAD23的泛素結合功能[12]；而RAD23的UBL結構域磷酸化可以顯著改變其與蛋白酶的互作效應[13]。

RAD23蛋白最早發(fā)現(xiàn)于酵母(Saccharomycescerevisiae)中，功能為參與DNA的損傷修復[14-15]。UV射線造成核酸損傷時，RAD23蛋白將富集到受損位點，參與核酸的損傷修復[5]，RAD4與RAD23互作可以提高擬南芥對UV射線的抗性[16]。此外，酵母RAD23蛋白還會導致光敏性皮膚疾病加重[17]。除了參與核酸修復，RAD23蛋白還是26S蛋白酶系統(tǒng)(UPS)的關鍵組分,其可將泛素化底物運送至蛋白酶體，促使后者降解錯誤折疊的蛋白[18-19]。在模式植物擬南芥中的研究也證實，RAD23蛋白是UPS系統(tǒng)不可或缺的組分，負責將底物蛋白運送至26S蛋白酶體，是擬南芥生長發(fā)育必需的蛋白[20]。同時，由于RAD23缺乏蛋白酶體起始結構域，不會被蛋白酶體降解，因此能在體內穩(wěn)定存在[21-22]。RAD23蛋白中這些特定的結構域，使其能選擇性地與靶蛋白特定位點結合，參與調控蛋白的泛素化過程，從而為蛋白酶體精確降解靶蛋白奠定基礎。

目前，出芽酵母、人類、水稻、玉米、擬南芥和松樹中的RAD23基因家族已被分離鑒定。蘋果(Malusdomestica)作為多年生木本植物中重要的果樹植物，有關其RAD23基因和功能的研究甚少。因此，本試驗克隆了蘋果MdRAD23C2基因，將其轉入煙草，研究其抗旱功能，以期為抗旱蘋果新品種的培育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

蘋果為栽植于西北農林科技大學園藝場的1年生秦冠(Malusdomesticacv.‘Qinguan’)幼苗。野生型煙草(Nicotiananudicaulis)種子由華中農業(yè)大學劉繼紅教授饋贈。

本氏煙草(Nicotianabenthamiana)種子由西北農林科技大學旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室保存。

RNAiso Plus試劑盒、大腸桿菌Top10感受態(tài)、DNA膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒、快速DNA提取試劑盒，均購自北京天根生化科技有限公司；D2000 DNA分子Marker、BamHⅠ、KpnⅠ、克隆載體pMD19-T、PrimeSTAR MAX Premix(2×)、rTaqTM、T4-DNA連接酶、DNA A-Tailing Kit、SYBR?Premix ExTaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)，均購自TaKaRa生物工程有限公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit、Gateway?BP Clonase?Ⅱ Enzyme mix、Gateway?LR Clonase?Ⅱ Enzyme mix，均購自賽默爾科技(中國)有限公司；MDA試劑盒、超氧陰離子和過氧化氫測定試劑盒，均購自南京建成生物科技有限公司；其他試劑均購自上海源葉生物科技有限公司。GV3101菌株、pDONR222載體、pGWB405載體、pCAMBIA2300載體，均由西北農林科技大學旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室保存。

共聚焦顯微鏡，LFM150 META，德國；Stepone Plus System PCR儀，ABI，美國。引物合成及測序均由西安擎科生物有限公司完成。

1.2 方 法

1.2.1 蘋果材料的逆境處理 選擇長勢一致的1年生秦冠(Malusdomesticacv.‘Qinguan’)幼苗，置于不同逆境下處理，并于相應時間點取樣，取樣位置為自頂端而下5～8片葉。干旱處理前，將所用材料澆水至飽和，自然干旱0，4，6，8，10 d取樣，對照組土壤含水量保持在50%左右。鹽處理時，用200 mmol/L NaCl澆灌材料，于0，1，3，6，12，24 h取樣，對照組噴施蒸餾水。堿脅迫處理時，用1 mol/L Na2CO3/NaHCO3(體積比為1∶1)配成堿性水溶液(pH=8.5)澆灌材料，于0，1，3，6，12，24 h取樣，對照組噴施蒸餾水。ABA處理時，以100 mmol/L ABA進行葉面噴施，于0，1，3，6，12，24 h取樣，對照組噴施蒸餾水。所取樣品置于液氮中速凍，-80 ℃保存待用。

1.2.2 蘋果材料RNA提取 用RNAiso Plus試劑盒提取不同逆境處理秦冠葉片的總RNA，采用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄合成cDNA，-20 ℃保存待用。

1.2.3MdRAD23C2基因克隆 根據(jù)蘋果基因組檢索序列設計引物MdRAD23C2-S/A，在引物上分別加入BamHⅠ和KpnⅠ酶切位點(表1)，以干旱處理的秦冠葉片cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系為：12.5 μL PrimeSTAR MAX Premix(2×)，1 μL cDNA，1 μL正向引物，1 μL反向引物，并以離子水補充至25 μL。反應條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min(共35個循環(huán))。PCR反應結束后，將擴增產物用1.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測并切膠回收，經測序確認目標序列，將該基因命名為MdRAD23C2。

1.2.4MdRAD23C2序列生物信息學分析 登錄GDR網站，將擬南芥氨基酸(AtRAD23C，AT3G02540)進行序列Blastp，可得到蘋果蛋白序列(genome database of rosaceae；GDR；http://www.rosaceae.org)。在PLAZA(https://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/versions/plaza_v3_dicots/)網站上進行Blastp，下載與MdRAD23C2同源性較高的不同物種的氨基酸序列，利用DNAMAN 6.0軟件對這些氨基酸進行多序列比對；利用MEGA 5.0軟件，通過Neighbor-joining方法構建系統(tǒng)進化樹，設置Bootstrap數(shù)值為1 000。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nlm.gov/)獲得MdRAD23C2全長基因組序列；MdRAD23C2發(fā)揮功能主要依靠其啟動子區(qū)域的順式作用元件，因此選取MdRAD23C2基因起始密碼子前的1 500 bp片段為啟動子區(qū)域，用于預測其順式作用元件。

1.2.5MdRAD23C2的逆境響應分析 設計基因特異引物MdRAD23C2-F/R(表1)，以不同逆境處理的秦冠葉片cDNA為模板，使用SYBR?Premix ExTaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)進行實時定量PCR分析，內參基因為β-actin(表1)。反應體系為：5 μL SYBR?Premix ExTaqTM，0.5 μL cDNA，0.2 μL正向引物，0.2 μL反向引物，加去離子水補充至10 μL。反應條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，共 40 個循環(huán)。每個樣品重復4次。用2-ΔΔCT法計算MdRAD23C2相對表達量。

表1 本試驗所用引物序列

注：引物MdRAD23C2-S/A序列中的下劃線部分分別為BamHⅠ和KpnⅠ酶切位點。

Note:The under lined zones of MdRAD23C2-S/A indicateBamHⅠ andKpnⅠ digestion sites,respectively.

1.2.6 MdRAD23C2蛋白的亞細胞定位 利用Gateway技術構建MdRAD23C2::GFP融合表達載體。根據(jù)目標序列設計帶有attb位點的引物MdRAD23C2-attb1/attb2(表1)，擴增獲得目標片段。利用BP反應將目標片段克隆至中間載體pDONR222上，經測序確認序列無誤后，通過LR反應將目標片段從中間載體pDONR222重組克隆至表達載體pGWB405(帶有GFP蛋白標簽)上，以構建MdRAD23C2::GFP融合表達載體。利用農桿菌介導轉化法，將構建成功的融合表達載體在生長4周的本氏煙草(Nicotianabenthamiana)表皮細胞中瞬時表達。注射2～3 d后，用共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白的表達。

1.2.7MdRAD23C2過表達載體的構建 在測序正確的PCR回收產物3′端添加A堿基后連接pMD19-T克隆載體，培養(yǎng)16～24 h后，進行菌落PCR檢測，同時提取質粒。用BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切pCAMBIA2300載體和目標載體質粒，電泳回收pCAMBIA2300線性片段和目標載體片段。將回收的片段進行重組連接，構建pCAMBIA2300-MdRAD23C2過表達載體。將重組的過表達載體用凍融法轉化農桿菌，用于煙草轉化。

1.2.8 農桿菌侵染煙草及陽性植株的篩選 將野生型煙草(Nicotiananudicaulis)種子于4 ℃下春化3 d后，用體積分數(shù)70%乙醇表面滅菌30 s，HClO滅菌10 min，之后用滅菌水清洗3次，重懸于0.1%瓊脂糖溶液中，播種在MS培養(yǎng)基上。光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，光照條件為：16 h光照(55～75 μmol/(m2·s))，8 h黑暗。

待煙草生長4周，采用葉盤法進行煙草轉化，獲得再生植株。分別用快速DNA提取試劑盒和RNAiso Plus試劑盒提取煙草再生植株葉片的DNA和RNA，以MdRAD23C2-F/R(特異引物)和35S-F/MdRAD23C2-A(載體引物)引物對轉基因煙草DNA水平進行檢測，以35S-F/MdRAD23C2-A引物對轉基因煙草RNA水平進行檢測，鑒定出陽性轉基因株系。將獲得的陽性煙草株系生根移栽，收獲種子用于后續(xù)試驗。

1.2.9 轉基因煙草的抗旱能力 將轉基因煙草和野生型煙草種子于4 ℃下春化3 d后直接播種于育苗基質中，待露白后播于營養(yǎng)缽中，每個營養(yǎng)缽4株。待生長4周后，選取長勢一致的煙草幼苗進行干旱脅迫。干旱處理前，將所用材料澆水至飽和，至水能夠自然滲出為止。每個株系28株，干旱處理2周。

干旱處理2周后，待煙草出現(xiàn)萎蔫時，按徐新娟等[23]的方法測定相對電導率，按Liu等[24]的方法測定葉綠素a、b及總葉綠素含量，采用MDA試劑盒、超氧陰離子和過氧化氫試劑盒測定MDA、超氧陰離子和過氧化氫含量。二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)和氮藍四唑(tetranitroblue tetrazolium chloride，NBT)染色參考龔小慶[25]的方法進行，待煙草葉片有明顯染色現(xiàn)象時(DAB褐色、NBT藍色)，置于甘油/乳酸/無水乙醇脫色液(三者體積比為1∶1∶3)中，沸水煮沸10 min，蒸餾水清洗3次，再置于體積分數(shù)80%乙醇中，繼續(xù)脫色至葉片完全脫綠，用蒸餾水清洗，鋪于玻璃板上，拍照保存，以觀察煙草葉片的染色程度。

2 結果與分析

2.1 MdRAD23C2的克隆及序列分析

PCR擴增結果顯示，以秦冠蘋果葉片cDNA為材料，克隆得到一條長1 000～2 000 bp的條帶(圖1)，與預期片段大小一致。經測序分析，MdRAD23C2序列長1 146 bp，編碼381個氨基酸。將不同物種RAD23C蛋白的氨基酸序列進行比對，用MEGA 5.0軟件構建系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)，同源氨基酸序列的一致性達68.84%(圖2)，2個蘋果與梨的RAD23C蛋白親緣關系最近，與水稻、玉米的親緣關系較遠(圖3)。預測的MdRAD23C2啟動子區(qū)域順式作用元件包括AE-box(光響應元件)、ARE(厭氧誘導元件)、TATC-box(赤霉素響應元件)、CGTCA-motif(茉莉酸響應元件)、ERE(乙烯響應元件)、MBS(干旱誘導元件)和P-box(赤霉素響應元件)(表2)。

M.Marker；1.擴增序列

黑色區(qū)域為完全一致的氨基酸殘基，灰色區(qū)域為相似度在50%以上的氨基酸殘基；MdRAD23C1.蘋果；MdRAD23C2.蘋果；AtRAD23C.擬南芥；OsRAD23C.水稻；PyRAD23C.梨；ZmRAD23C.玉米The black region represents exactly same amino acid residues,and the gray region represents more than 50% similarity; MdRAD23C1.Malus Domestica;MdRAD23C2.Malus Domestica;AtRAD23C.Arabidopsis thaliana;OsRAD23C.Oryza sativa;PyRAD23C.Pyrus bretschneideri;ZmRAD23C.Zea mays

圖3 不同植物RAD23C的系統(tǒng)進化分析

元件類型Type of element數(shù)量Number of cis-element功能Function元件類型Type of element數(shù)量Number of cis-element功能FunctionAE-box1光響應Light-responsiveTATC-box1赤霉素響應Gibberellin-responsive ARE2厭氧誘導Anaerobic induction MBS2干旱誘導Drought-inducibility CGTCA-motif1茉莉酸響應MeJA-responsiveness P-box1赤霉素響應Gibberellin-responsiveERE2乙烯響應Ethylene-responsive

2.2 MdRAD23C2的逆境響應分析

利用實時定量PCR分析MdRAD23C2對不同逆境的響應，結果顯示，MdRAD23C2可被干旱誘導表達，4 d時MdRAD23C2相對表達量約為起始表達量的11倍(圖4-A)；鹽脅迫也可明顯誘導MdRAD23C2表達，12 h時MdRAD23C2相對表達量約為起始表達量的5倍(圖4-B)；堿脅迫亦能誘導MdRAD23C2的表達(圖4-C)；但ABA基本不能誘導MdRAD23C2的表達(圖4-D)。

A.干旱脅迫；B.鹽脅迫；C.堿脅迫；D.ABA脅迫

2.3 MdRAD23C2蛋白的亞細胞定位

將構建的MdRAD23C2::GFP融合蛋白在本氏煙草葉片中瞬時表達，結果如圖5所示。圖5顯示，GFP蛋白的熒光分布于整個細胞，而融合蛋白的熒光分布于細胞核和細胞膜中，表明MdRAD23C2既可定位于細胞核，也可定位于細胞膜。

2.4 轉MdRAD23C2基因煙草的鑒定

如圖6所示，在陽性轉基因煙草植株中可擴增出目標條帶，而非陽性轉化植株中無此條帶。最后確定1，3，10和13號株系為轉基因株系。選取3和10號株系2個轉基因株系分別標記為C3和C10。

圖5 蘋果MdRAD23C2蛋白的定位分析

“+”和“-”分別代表陽性和陰性對照，1～14代表不同株系。A.DNA水平；B.RNA水平“+” and “-” indicate positive and negative controls,1-14 show different lines,respectively. A.Identification via DNA;B.Identification via RNA

2.5 轉MdRAD23C2基因煙草對干旱脅迫的響應

MdRAD23C2對轉基因煙草抗旱性的影響見圖7和圖8。圖7顯示，對生長4周的轉基因煙草和野生型煙草進行干旱處理，2周后野生型煙草萎蔫情況明顯。圖8顯示，干旱脅迫下轉基因煙草的相對電導率和丙二醛含量均極顯著低于野生型煙草，而葉綠素含量極顯著高于野生型煙草，說明轉基因煙草在干旱脅迫下細胞受到的傷害較小，對干旱脅迫有一定的耐受能力。

WT.野生型煙草；C3和C10.轉基因煙草。下圖同WT.Wild-type tobacco;C3 and C10.Transgenic tobacco plants.The same below 圖7 MdRAD23C2轉基因煙草抗旱處理2周后的生長狀況

圖柱上標不同字母表示不同株系間有極顯著差異(P<0.01)。下圖同Different letters mean highly significant difference between tobacco plants (P<0.01).The same below

圖9，10顯示，干旱脅迫下MdRAD23C2過表達轉基因煙草中活性氧積累明顯少于野生型；干旱處理野生型煙草葉片DAB染液中有較大面積深褐色染色，NBT染液中則有更明顯的藍色顯色。干旱脅迫下野生型煙草中超氧陰離子及過氧化氫的積累極顯著高于轉基因株系。該結果表明，MdRAD23C2過表達降低了干旱脅迫對轉基因煙草的氧化傷害，增強了轉基因煙草對干旱脅迫的耐受性。

圖9 MdRAD23C2過表達轉基因煙草的DAB和NBT染色結果

圖10 MdRAD23C2過表達對轉基因煙草超氧陰離子和過氧化氫含量的影響

3 討 論

本研究通過PCR擴增分離得到蘋果MdRAD23C2，其編碼區(qū)長1 146 bp，編碼381個氨基酸,該蛋白定位于細胞核和細胞膜中。蘋果MdRAD23C2啟動子區(qū)域含有許多與脅迫響應相關的順式作用元件，如AE-box、TATC-box、P-box、CGTCA-motif、ERE、MBS和ARE。本試驗結果表明，MdRAD23C2可以響應干旱、鹽、堿等逆境脅迫，這與Wang等[26]的試驗結果一致，表明該基因或許在植物應答逆境脅迫中發(fā)揮著重要的功能，但對ABA脅迫無響應，這與水稻RAD23參與ABA信號調控[27-28]的研究結果不一致。可能是由于蘋果啟動子區(qū)域不含響應ABA的ABRE元件所致。

相對電導率和MDA含量可以表征膜的受損程度。本研究發(fā)現(xiàn)，MdRAD23C2轉基因煙草質膜的相對透性和MDA含量顯著降低，總葉綠素含量顯著增加。同時，MdRAD23C2過表達也可降低轉基因煙草中過氧化氫及超氧陰離子的積累，減輕氧化傷害?；钚匝醴e累會引起蛋白功能受損，阻斷DNA復制和轉錄，造成細胞死亡或異常蛋白[29]；干旱條件下轉基因煙草耐旱性增強，可能也與XPC/RAD4結構域參與核酸損傷修復有關[30]。

MdRAD23C2作為UPS系統(tǒng)中的轉運蛋白，極有可能通過降解特定的靶蛋白參與植物對干旱脅迫的響應。因而未來將通過篩選MdRAD23C2的互作基因，進一步驗證該基因的生物學功能，以揭示MdRAD23C2在植物干旱脅迫響應中的功能機制。