楊婕，王玉華，米蘭，李愛霞，王婧

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點實驗室， 甘肅省葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅 蘭州,730070)

近幾年，面對葡萄酒產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)化、國際化和高端化的發(fā)展趨勢，提升葡萄酒品質(zhì)是我國應(yīng)對市場競爭的主要策略。然而，全球氣候變化的趨勢使得釀酒葡萄果實出現(xiàn)成熟速度加快，糖分含量提高，酸度下降，風(fēng)味物質(zhì)較為寡淡等問題[1]。因此如何提高葡萄酒酸度、降低乙醇體積分?jǐn)?shù)，突出葡萄酒典型性風(fēng)格是葡萄酒釀造中急需解決的技術(shù)問題。近年來，隨著對葡萄酒研究的深入，非釀酒酵母的潛在應(yīng)用價值不斷被揭示，利用非釀酒酵母與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)混合接種發(fā)酵，從而利用不同菌種“取長補短”是提升葡萄酒品質(zhì)的重要途徑之一[2]。

Lachanceathermotolerans是Lachancea屬代表性物種，可代謝產(chǎn)生乳酸，具有生物“酸化劑”之稱[3]，在葡萄酒釀造中能夠增加酒體酸度，降低pH值[4]，并且其乳酸產(chǎn)生能力高于乳酸菌[5]。然而L.thermotolerans具有中等乙醇發(fā)酵能力，必須與發(fā)酵能力較強的酵母混合接種才能完成乙醇發(fā)酵[6]。BENITO[7]利用L.thermotolerans與S.cerevisiae混合發(fā)酵來探索其對西班牙南部葡萄產(chǎn)區(qū)的應(yīng)用效果，結(jié)果表明L.thermotolerans在提高葡萄酒乳酸含量、甘油含量、增加揮發(fā)性香氣物質(zhì)方面有顯著效果。也有學(xué)者研究表明，L.thermotolerans菌株之間的生理代謝和發(fā)酵能力差異較大，包括乳酸產(chǎn)生能力、耐受性等都各不相同[7]。目前國內(nèi)對L.thermotolerans在葡萄酒中的應(yīng)用尚未被重視，不同L.thermotolerans菌株與S.cerevisiae順序接種方式對干白葡萄酒增酸效應(yīng)及感官品質(zhì)影響的研究尚未見報道。

高品質(zhì)的白葡萄酒需要一定的酸度來支撐其口感的清爽度，然而近幾年越來越多的白葡萄品種如霞多麗、貴人香、白詩南、長相思等在酸度上均無法滿足要求。企業(yè)在生產(chǎn)中解決酸度缺乏的措施通常是增加商業(yè)食品級的酸，如酒石酸，乳酸或檸檬酸。但是，使用工業(yè)酸存在很多問題，如缺乏化學(xué)穩(wěn)定性、成本提高等[7]。因此，明確L.thermotolerans的增酸、增香效應(yīng)，同時借助S.cerevisiae發(fā)酵力強的特性揭示混合發(fā)酵方式對提高白葡萄酒酸度和感官品質(zhì)的研究十分必要。

本試驗以甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點實驗室保藏的3株L.thermotolerans菌株為材料，研究不同L.thermotolerans菌株與S.cerevisiae以順序接種發(fā)酵的方式對發(fā)酵過程主要產(chǎn)物的影響，乙醇發(fā)酵結(jié)束后測定葡萄酒的各項理化指標(biāo)和乳酸產(chǎn)生情況，并用GC-MS測定其揮發(fā)性化合物的含量，以期為L.thermotolerans在國產(chǎn)白葡萄酒釀造中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

霞多麗葡萄：2016年9月采自甘肅省武威市民勤縣夏博覽葡萄酒莊園，含糖量210 g/L(以葡萄糖計)、可滴定酸含量7.2 g/L(以酒石酸計)。

L-蘋果酸、L-乳酸(色譜純):上海源葉生物科技有限公司；NaOH、NaCl、HCl、醋酸鈉、無水碳酸鈉、醋酸、無水葡萄糖等試劑(分析純):天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

L.thermotolerans1(LT1)：中國科學(xué)院微生物研究所；L.thermotolerans2(LT2)：南陽師范學(xué)院；L.thermotolerans3(LT3)：安琪酵母公司；S.cerevisiae(SC)，活性干酵母粉，安琪酵母公司。

YPD液體培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母浸粉1%。

YPD固體培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：YPD液體培養(yǎng)基再加瓊脂2%。

WL營養(yǎng)培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

Genesis 10s紫外-可見分光光度計,美國Thermo Scientific公司；500051S 立式高壓滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD超凈工作臺,蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司； SPX-150-II生化培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；TRACE1310-ISQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Thermo Scientific公司； Ultimate 3000高效液相色譜儀,美國Thermo Scientific公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種培養(yǎng)

將活化于YPD平板的供試菌株挑取單菌落分別接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24 h，以2%的接種量分別接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24 h制成種子液，然后進(jìn)行酵母菌接種試驗。

1.4.2 小容器釀造試驗

霞多麗葡萄除梗破碎、壓榨裝罐，加入40 mg/L SO2、20 mg/L果膠酶，4℃澄清48 h，60℃水浴10 min[1]，放置室溫，取葡萄汁接種供試菌株于1 L玻璃罐中，裝液量為70%，啟動乙醇發(fā)酵。

順序接種：首先以2%的接種量將擴培后的3株L.thermotolerans菌株分別接種于澄清的葡萄汁中(接種后L.thermotolerans初始菌體數(shù)量為106CFU/mL)，96 h后以2%的接種量接入S.cerevisiae(接種后S.cerevisiae初始菌體數(shù)量為106CFU/mL)進(jìn)行混菌發(fā)酵；同時以接種S.cerevisiae純種發(fā)酵為對照(接種后S.cerevisiae初始菌體數(shù)量為106CFU/mL)。

發(fā)酵溫度控制在20℃左右，當(dāng)殘?zhí)呛康陀? g/L 時，乙醇濃度基本不變時終止發(fā)酵，每個處理重復(fù)3次。

1.4.3 主要理化指標(biāo)分析

乙醇發(fā)酵結(jié)束后取樣測定殘?zhí)?、乙醇體積分?jǐn)?shù)、總酸、pH值和揮發(fā)酸等基本理化指標(biāo)，參照GB/T 15038—2006 《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.4.4L-乳酸、蘋果酸測定

乙醇發(fā)酵結(jié)束后取樣，參考BUGLASS等[8]和PéREZ-RUIZ等[9]方法，略作修改。采用高效液相色譜儀進(jìn)行測定。

色譜條件：色譜柱：BDS HYPERSIL C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測器：二極管陣列檢測器；流動相：0.005 mol/L的硫酸水溶液；流速0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；檢測波長：210 nm。

定性：將配好的蘋果酸、乳酸單一標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣，確定各自的出峰時間，根據(jù)保留時間進(jìn)行定性。

定量：將配好不同濃度的蘋果酸和乳酸混合標(biāo)準(zhǔn)液分別進(jìn)樣，進(jìn)行定量分析。以不同混合酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為橫坐標(biāo)，出峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蘋果酸、乳酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別計算出酒樣中蘋果酸、乳酸的含量。

1.4.5 生長曲線測定

生長曲線測定參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》。

1.4.6 菌株細(xì)胞數(shù)量測定

參照GOBBI等[4]的方法，略作修改。單獨接種S.cerevisiae的發(fā)酵酒樣用YPD固體平板進(jìn)行菌落計數(shù)。S.cerevisiae和L.thermotolerans順序發(fā)酵酒樣采用WL營養(yǎng)培養(yǎng)基測定，其中在WL營養(yǎng)培養(yǎng)基上L.thermotolerans呈深綠色，S.cerevisiae呈白色，根據(jù)菌落不同的顏色計算二者的生物量計算L.thermotolerans和S.cerevisiae的生物量。

1.4.7 揮發(fā)性化合物測定

HS-SPME樣品處理：取8 mL酒樣于頂空瓶中。加入2.4 g NaCl及10 μL內(nèi)標(biāo)物2-辛醇，并加入磁力攪拌轉(zhuǎn)子，密封并搖勻，將搖勻的樣品放于40℃磁力攪拌器中，平衡30 min，插入萃取頭于40 ℃恒溫水浴鍋中磁力攪拌吸附富集30 min。

GC-MS分析條件：參照魯榕榕等[10]方法并略作修改。色譜條件：色譜柱：DB-WAX(60 m×2.5 mm×0.25 μm)；柱升溫程序：40℃保持7 min，以4℃/min升至200℃，保持8 min；載氣(He，純度99.999%)流速 1 mL/min；進(jìn)樣口溫度240℃；不分流進(jìn)樣。質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源(EI)；電子能量70 eV；傳輸線溫度220℃；離子源溫度240℃；質(zhì)譜掃描范圍m/z50～350。

定性定量方法：用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析鑒定，香氣成分分析利用MS全離子掃描模式下的總離子流圖譜。分析結(jié)果運用計算機譜庫(NIST 11)進(jìn)行初步檢索和分析，再結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行人工譜圖解析，確定揮發(fā)性物質(zhì)的各化學(xué)成分；采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，內(nèi)標(biāo)物為2-辛醇。如公式(1)、(2)：

各香氣成分含量/(mg·L-1)=

(1)

(2)

1.4.8 感官分析

感官分析參照GOBBI等[4]的方法，略做修改。選擇10名經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)并具有葡萄酒品鑒資格證的專業(yè)人員進(jìn)行感官評定。對各酒樣進(jìn)行隨機編號，分別從香氣強度、花香、果香、甜味、酸味、異味、澄清度、酒體平衡8個方面對各葡萄酒樣品進(jìn)行具體評價。使用10分結(jié)構(gòu)化數(shù)值尺度來量化，1～9代表強烈程度逐漸增加。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 23.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，利用Duncan’s多重比較在置信區(qū)間0.05下對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，對不同處理酒樣的香氣化合物進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本理化指標(biāo)

由表1可知，在4組供試酒樣中，殘?zhí)呛烤?4 g/L，各處理間均無顯著差異。S.cerevisiae純種發(fā)酵的對照組乙醇體積分?jǐn)?shù)最高為13.45%，3組順序發(fā)酵酒樣乙醇體積分?jǐn)?shù)與對照酒樣相比有所降低，但3組處理酒樣間存在顯著差異，由此可見，L.thermotolerans具有降低葡萄酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)的潛力；3組處理酒樣揮發(fā)酸含量為(0.28～0.35) g/L，與對照酒樣(0.43 g/L)相比均顯著降低，且處理間存在顯著差異，表明L.thermotolerans具有低產(chǎn)揮發(fā)酸的特性；3組處理酒樣pH值比對照酒樣顯著降低了6%～10%，且3組處理酒樣間差異顯著，其pH值與總酸含量相對應(yīng)，表明L.thermotolerans能增加酒體酸度。

表1 乙醇發(fā)酵結(jié)束時供試酒樣理化指標(biāo)Table 1 physico-chemical indices of sample wines at the end of alcoholic fermentation

注：SC:單獨接種S.cerevisiae酒樣；LT1-SC：先接種L.thermotolerans1，4d后接入S.cerevisiae酒樣；LT2-SC：先接種L.thermotolerans2，4d后接入S.cerevisiae酒樣；LT3-SC：先接種L.thermotolerans3，4d后接入S.cerevisiae酒樣。同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 總酸及蘋果酸、L-乳酸分析

由圖1-A可知，3組處理酒樣之間總酸含量差異顯著，比對照酒樣(6.53 g/L)增加了7.2%～44.4%。L.thermotolerans作為生物酸化劑，具有產(chǎn)生L-乳酸的能力，由圖1-B可知，3組處理酒樣中L-乳酸的含量顯著高于對照酒樣(0.12 g/L)，其中LT1酒樣的乳酸含量(2.53 g/L)顯著高于LT2酒樣(2.01 g/L)和LT3酒樣(1.52 g/L)。由此可知，3株L.thermotolerans菌株自身的差異性導(dǎo)致其產(chǎn)生乳酸的能力各不相同。本試驗未進(jìn)行蘋乳發(fā)酵，3組處理酒樣中蘋果酸含量與對照酒樣相比顯著降低了21%～24%，但處理酒樣之間蘋果酸含量并無顯著差異。

A-總酸；B-蘋果酸和乳酸圖1 供試酒樣總酸及蘋果酸、乳酸生成量Fig 1 Production of total acid and malic acid、lactic acid of sample wines注：圖中不同小寫字母表示各組差異顯著(P<0.05)。

2.3 生長曲線及乳酸曲線分析

由圖2可知，3株L.thermotolerans菌株的生長趨勢基本相似，經(jīng)歷了約1 d的延滯期，隨后在第2天進(jìn)入了對數(shù)生長期，第4天3株L.thermotolerans的生長量達(dá)到最大值為107CFU/mL，之后生長趨于穩(wěn)定。同樣，3株L.thermotolerans菌株產(chǎn)乳酸的趨勢大致相同，均是在第4天達(dá)到最大值，分別為1.66、1.80、1.35 g/L，隨后乳酸含量略有下降，但基本保持穩(wěn)定。綜上，3株L.thermotolerans菌株生長曲線和乳酸曲線均在第4天達(dá)到最大值。

A-生長曲線；B-乳酸曲線圖2 三株L.thermotolerans的生長曲線及乳酸曲線Fig 2 Growth curves and lactic acid curves of threeL.thermotolerans

2.4 發(fā)酵過程中不同酵母菌生長趨勢的變化

乙醇發(fā)酵過程中對2種酵母菌生長動態(tài)的監(jiān)測結(jié)果見圖3，起始接種的菌體細(xì)胞濃度均為106CFU/mL，圖3-A為單獨接種S.cerevisiae的酒樣中菌體數(shù)量的變化情況，最初菌體數(shù)量增長快速，第4天達(dá)到最大值107CFU/mL，隨后略有下降，直至乙醇發(fā)酵結(jié)束，其菌體數(shù)量穩(wěn)定在106CFU/mL。圖3-B～圖3-D為

A-S.cerevisiae純種發(fā)酵生長趨勢變化; B-L.thermotolerans1和S.cerevisiae順序發(fā)酵生長趨勢變化;C-L.thermotolerans 2和S.cerevisiae順序發(fā)酵生長趨勢變化; D-L.thermotolerans 3和S.cerevisiae順序發(fā)酵生長趨勢變化圖3 供試酒樣乙醇發(fā)酵中不同酵母菌生長趨勢變化Fig.3 Evolution of different yeasts during alcohol fermentation of sample wines

不同L.thermotolerans菌株與S.cerevisiae菌株順序接種發(fā)酵過程中的菌體生長動態(tài)。3株L.thermotolerans菌株在發(fā)酵過程中菌體生長趨勢基本相似，均在1～4 d內(nèi)生長迅速，并在第4天菌體數(shù)量達(dá)到最大值為107CFU/mL。在S.cerevisiae菌株接入第2天，隨著S.cerevisia菌體數(shù)量的增多，L.thermotolerans菌體數(shù)量逐漸開始下降，其中LT1菌株(圖3-B)和LT2菌株(圖3-C)均在第8天消亡，LT3菌株(圖3-D)在第9天消亡，而處理組中S.cerevisiae菌體數(shù)量在乙醇發(fā)酵結(jié)束(第11天)依然穩(wěn)定在106CFU/mL。

2.5 主要揮發(fā)性香氣化合物的分析

本試驗測定了乙醇發(fā)酵結(jié)束后的各酒樣的香氣組成，共檢測出72種香氣物質(zhì)，其中包括酯類物質(zhì)30種，高級醇類19種，酸類物質(zhì)7種，醛酮萜烯類物質(zhì)12種，其他化合物4種。見表2。

表2 供試酒樣揮發(fā)性香氣成分及含量 單位：μg/L

續(xù)表2

編號香氣化合物香氣物質(zhì)含量SCLT1-SCLT2-SCLT3-SCB11庚乙二烯乙二醇0.69±0.01c-45.06±4.05a1.93±0.20bB122-十六烷醇4.39±0.12d16.33±0.15c22.49±0.43b25.45±1.55aB131-癸醇-2.29±0.07c401.70±2.26a27.26±0.82bB149-癸烯-1-醇-4.55±0.22-39.58±0.92B151-辛醇--12.87±0.1820.82±0.32B16丙三醇-100.11±0.6995.99±3.03-B171-壬醇-1.67±0.09c194.59±3.33a54.59±0.24bB18丙醇---2.66±0.09B19金合歡醇-17.75±0.40-7.79±0.16小計4 316.773 823.493 637.003 800.07酸類C1己酸489.43±1.80a88.50±0.28d385.71±5.06b137.82±0.37cC2辛酸4 662.73±0.03a588.82±22.84c1 054.75±11.13b1 018.49±0.99bC3壬酸10.27±0.15b7.09±0.21c367.41±1.84a8.39±0.04cC4癸酸2 198.15±0.31a574.68±5.12d1 997.28±1.20b773.7±0.96cC59-癸烯酸279.69±1.64b283.99±0.65b19.46±0.85c584.12±10.82aC6異丁酸--165.33±4.7221.74±2.28C717-十八炔酸-2.29±0.2244.02±0.77-小計7 640.271 545.374 033.962 544.26醛酮萜烯類D12-十五烷酮4.10±0.09--1.67±0.10D2甲基壬基甲酮54.78±0.63a0.42±0.02d19.73±0.56b3.98±0.06cD3香葉基丙酮-4.06±0.05151.06±1.15-D4大馬士酮-64.36±0.14b418.35±1.08a48.15±0.78cD5β-紫羅蘭酮---6.52±0.40D6香茅醇-5.42±0.07--D7反式-橙花叔醇-63.55±1.05b530.43±3.13a55.26±0.45cD8橙花醇--77.79±0.49-D9金合歡烯-26.84±1.95b217.33±2.79a17.92±0.83cD10香葉醇-19.63±0.46-21.63±0.88D11α-松油醇-2.06±0.12--D12芳樟醇-15.04±0.03b614.60±4.96a14.13±0.47b小計58.88201.382 246.62169.26其他類E1苯乙烯71.36±4.18b26.81±0.85d195.95±1.26a50.93±4.36cE22,6-二叔丁基對甲酚33.28±0.92c124.19±0.93b624.75±3.86a132.18±2.72bE34-乙烯基-2-甲氧基苯酚32.67±0.44--5.95±0.15E42,4-二叔丁基苯酚121.14±0.56c155.99±2.82b494.03±4.84a144.91±0.77b小計258.45306.991 314.73333.97

注：“-”表示未檢測到香氣成分。

2.5.1 酯類化合物

酯類物質(zhì)主要是酵母在乙醇發(fā)酵過程中產(chǎn)生的，通常賦予葡萄酒果香，花香，甜香等[11]。由表2可知，本試驗共檢測出30種酯類物質(zhì)，在酒中的總含量為7 043.19～25 885.57 μg/L。LT2、LT3順序接種酒樣中酯類化合物的總含量顯著高于S.cerevisiae純種發(fā)酵的對照酒樣(19 985.48 μg/L)，其中LT2酒樣中酯類化合物的總含量最高(26 018.54 μg/L)，比對照酒樣高出30%，其中含量較高的包括肉桂酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯等；其次是LT3酒樣(14 606.75 μg/L)，含量較高的包括辛酸乙酯、庚酸乙酯；LT1酒樣中酯類含量最少(7 043.19 μg/L)，但其中癸酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯的含量較高。在供試酒樣中辛酸乙酯和癸酸乙酯貢獻(xiàn)較大，其主要香氣特征為果香，這也是霞多麗葡萄酒的主體香氣成分[12]。本試驗中順序接種發(fā)酵所產(chǎn)生的辛酸乙酯、癸酸乙酯等物質(zhì)的含量顯著高于對照酒樣。綜上，不同L.thermotolerans菌株對酯類物質(zhì)的產(chǎn)生有不同的影響。

2.5.2 高級醇類化合物

高級醇類化合物是酵母代謝的次級產(chǎn)物之一，是葡萄酒中主要的香氣物質(zhì)。葡萄酒中的高級醇質(zhì)量濃度低于300 mg/L時，有助于提高自身的復(fù)雜性；當(dāng)質(zhì)量濃度超過400 mg/L，雜醇將會作為一個消極的影響因子[13]。本試驗共檢測出19種高級醇，順序接種酒樣中高級醇含量為(3 637.00～3 800.07) μg/L，比對照酒樣(4 316.77 μg/L)下降了12%～16%，3組處理酒樣間高級醇含量也存在顯著差異。順序接種酒樣中的正丁醇、2,3-丁二醇、1-癸醇、苯乙醇的含量均高于對照酒樣，其中苯乙醇、1-癸醇、2-壬醇賦予葡萄酒濃郁的花香和果香，提高香氣復(fù)雜性。

2.5.3 脂肪酸類化合物

脂肪酸類物質(zhì)大部分來源于酵母菌代謝的副產(chǎn)物，葡萄酒中通常表現(xiàn)出來的奶酪味以及脂肪味與葡萄酒中存在的脂肪酸密切相關(guān)[14]。本試驗中共檢測出7種脂肪酸，順序接種酒樣中脂肪酸類物質(zhì)的總含量為1 545.37～4 033.96 μg/L，與對照酒樣(7 640.27 μg/L)相比顯著降低了46%～80%。在葡萄酒中已報道的脂肪酸有異丁酸、丁酸、異戊酸、己酸、辛酸、癸酸、9-癸烯酸和月桂酸[15]，雖然脂肪酸與葡萄酒的不良風(fēng)味有關(guān)，但它們對葡萄酒的香氣平衡有著重要作用，并且能抑制對應(yīng)芳香酯的水解[16]。而本試驗共檢測出己酸、辛酸、癸酸、9-癸烯酸4種脂肪酸，它們在低濃度時會散發(fā)奶酪和奶油的風(fēng)味，而在高濃度時有腐敗和刺激味。本試驗中順序接種酒樣中檢測到的主要的脂肪酸類物質(zhì)如己酸、辛酸和癸酸的含量均顯著低于對照酒樣。

2.5.4 醛酮及萜烯類化合物

萜烯類化合物具有濃郁的香味，其感官閾值較低，是麝香型葡萄及其葡萄酒的典型香氣，它賦予了葡萄酒濃郁的品種香氣特征。萜烯類化合物屬于植物體中由乙酰CoA合成的次級代謝產(chǎn)物，以游離態(tài)和無味的糖苷結(jié)合態(tài)存在于葡萄果實中，葡萄果皮中的含量最高[17]。本試驗共檢測出12種萜烯類化合物，在酒中總含量為169.26～2 246.62 μg/L，3組順序接種酒樣中醛酮及萜烯類物質(zhì)含量均顯著高于對照酒樣(58.88 μg/L)。其中LT2酒樣產(chǎn)生的醛酮及萜烯類物質(zhì)含量最高(2 246.62 μg/L)，高出對照組37倍，其中含量較高的有香葉基丙酮、大馬士酮、反式-橙花叔醇、橙花醇、金合歡烯、芳樟醇等；其次是LT1酒樣(201.38 μg/L)，高出對照組2.4倍，其中含量較高的有香葉基丙酮、大馬士酮、金合歡烯、香葉醇、α-松油醇。產(chǎn)量最低的為LT3酒樣(169.26 μg/L)，高出對照組1.9倍，含量較高的有大馬士酮、β-紫羅蘭酮、香葉醇。

2.5.5 其他化合物

本試驗共檢測到4種其他香氣成分，分別為苯乙烯、2,6-二叔丁基對甲酚、2,4-二叔丁基苯酚、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚，順序接種酒樣中各物質(zhì)總含量由高到低分別為LT2(1 314.73 μg/L)、LT3(333.97 μg/L)、LT1(306.99 μg/L)。

2.6 主要發(fā)酵香氣的OAV

葡萄酒中的香氣物質(zhì)和香氣特征之間有著復(fù)雜的聯(lián)系，OAV可用于評價各風(fēng)味化合物對酒香氣的貢獻(xiàn)，超過閾值的香氣化合物會對葡萄酒的特征香氣產(chǎn)生較大影響[18]。為進(jìn)一步研究不同L.thermotolerans對葡萄酒具體香氣的影響，本試驗對已提取的揮發(fā)性香氣化合物進(jìn)行了定性定量分析，將各供試酒樣中OAV>1的呈香化合物整理成表3，香氣閾值[19-21]和香氣描述[11,20,22-24]根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)獲得。

由表3可知，共有19種揮發(fā)性化合物的OAV>1。本文OAV值>1的酯類包括乙酸異戊酯(香蕉味)、肉桂酸乙酯(奶油，草莓)、乙酸苯乙酯(蘋果)、癸酸乙酯(水果味)、月桂酸乙酯(甜香、蜂蠟香)和辛酸乙酯(菠蘿、梨清香)。其中肉桂酸乙酯(246.05)、癸酸乙酯(33.85)、乙酸苯乙酯(5.89)在LT2酒樣中的OAV最大，顯著高于對照酒樣，尤其是肉桂酸乙酯的OAV相較對照酒樣高達(dá)4.7倍。OAV>1的高級醇類有2,3-丁二醇(5.90)、1-癸醇(1.00)、2-壬醇(2.11)、苯乙醇(1.02)，均在LT2酒樣中最大，顯著高于其他酒樣，賦予了葡萄酒甜香，花香，果香，奶油等氣味，LT2酒樣所產(chǎn)生的苯乙醇的OAV值最高為1.02，可達(dá)對照酒樣的1.6倍，苯乙醇由苯丙氨酸代謝產(chǎn)生，可賦予酒體玫瑰花香和薔薇花香。在脂肪酸類物質(zhì)中只有己酸，辛酸OAV>1，賦予葡萄酒不愉快的氣味(酸臭氣味，腐敗味等)。本試驗中香葉基丙酮、大馬士酮和β-紫羅蘭酮和芳樟醇在對照酒樣中并未檢測出，僅在順序接種酒樣中被檢測出OAV>1，這些醛酮及萜烯類化合物具有花香、甜果香和紫羅蘭等香氣，極大地豐富了葡萄酒的風(fēng)味。其中LT2酒樣中香葉基丙酮(2.52)、大馬士酮(8.37)和芳樟醇(102.42)的OAV顯著高于其他2個處理酒樣，LT3酒樣中的β-紫羅蘭酮(72.44)則最高。這些主要的香氣物質(zhì)使人愉悅，柔和優(yōu)雅，極大地豐富了口感，對葡萄酒的香氣均有非常重要的貢獻(xiàn)。

表3 供試酒樣中OAV>1香氣成分的OAVTable 3 Mean values of OAV for volatile compounds which presented OAV>1 in sample wines

注：“/”表示未檢測到香氣成分。

2.7 各處理酒樣揮發(fā)性香氣的主成分分析

為直觀分析4種酵母菌株乙醇發(fā)酵后對霞多麗干白葡萄酒中呈香物質(zhì)的差異，對檢測出各類呈香化合物的含量進(jìn)行主成分分析。主成分1的方差貢獻(xiàn)率達(dá)到52.760%，主成分2的方差貢獻(xiàn)率為40.627%，二者累積貢獻(xiàn)率達(dá)到93.387%，能反映樣品的風(fēng)味品質(zhì)信息。

A-因子載荷圖；B-樣品分布圖圖4 香氣化合物主成分分析的因子載荷圖及香氣化合物主成分分析的樣品分布圖Fig.4 Loadings plot from PCA and score plot from PCA of volatile aroma compounds

圖4-A為檢測出的香氣化合物主成分分析的因子載荷圖，圖4-B為檢測出的香氣化合物主成分分析的樣品分布圖，因子的載荷系數(shù)反映了霞多麗干白葡萄酒中各揮發(fā)性香氣物質(zhì)對各主成分的影響，相關(guān)系數(shù)越大，說明主成分對該變量的代表性越強。從圖4-A可得出與PC1高度正相關(guān)的有棕櫚酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、苯乙醇、正丁醇等，其中在圖4-B中LT2酒樣分布在PC1正半軸，與上述香氣特征較接近。而1-戊醇、乙酸異戊酯、肉桂酸乙酯則與PC1高度負(fù)相關(guān)(載荷系數(shù)>0.9)，在圖4-B中LT1酒樣和LT3酒樣距離較近，將其聚為一類，與上述香氣特征較接近。與PC2高度正相關(guān)的有月桂酸乙酯、癸酸-3-甲基-丁酯、辛酸、己酸、癸酸，而2-十六烷醇、辛酸乙酯PC2呈負(fù)相關(guān)(載荷系數(shù)>0.7)。

2.8 感官評價

對4組供試酒樣進(jìn)行感官分析，由圖5可知，有L.thermotolerans菌株參與發(fā)酵的酒樣獲得的總體得分比對照酒樣高。對于酸味和甜味，3組處理酒樣均顯著高于對照酒樣，這是由于L.thermotolerans本身產(chǎn)較高的乳酸。在澄清度、酒體平衡、異味方面各供試酒樣差異不大。而在花香和果香方面，LT2酒樣的表現(xiàn)較優(yōu)于其他2組處理酒樣。3組處理酒樣在香氣強度方面均高于對照酒樣。綜上，有L.thermotolerans菌株參與發(fā)酵的處理組在香氣強度、花香、果香、酸味和甜味方面均優(yōu)于對照酒樣，菌株LT2在3組順序接種酒樣中表現(xiàn)最優(yōu)。

圖5 感官分析雷達(dá)圖Fig.5 Radar map of sensory analysis

3 討論

近年來研究表明，L.thermotolerans菌株具有中等發(fā)酵乙醇的能力，因此需與S.cerevisiae混合發(fā)酵完成乙醇發(fā)酵[4,25]。有學(xué)者研究表明，L.thermotolerans菌株和S.cerevisiae混合發(fā)酵時，所產(chǎn)生的生長曲線與乳酸曲線基本一致，即第4天細(xì)胞生物量達(dá)到最大值，乳酸的產(chǎn)量也達(dá)到最大值[26]。也有研究指出，當(dāng)L.thermotolerans菌株和S.cerevisiae菌株混合發(fā)酵，一旦接種S.cerevisiae細(xì)胞后，L.thermotolerans菌株的生物量明顯降低，這種現(xiàn)象直接關(guān)系到乳酸的產(chǎn)生量[27]。本文中3株L.thermotolerans菌株在第4天的生長量及乳酸含量均達(dá)到最大，所以本試驗采用間隔4天順序接種模式發(fā)酵，使L.thermotolerans菌株在乙醇發(fā)酵前期充分發(fā)揮增酸作用。L.thermotolerans菌株相較其他非釀酒酵母，是1株高產(chǎn)乳酸的酵母，KAPSOPOULOU等[26]發(fā)現(xiàn)L.thermotolerans純種發(fā)酵中L-乳酸產(chǎn)量較高，但也有研究報道指出，在大多數(shù)情況下，當(dāng)L.thermotolerans與發(fā)酵力更強的酵母混合接種完成乙醇發(fā)酵時，乳酸的產(chǎn)量差異相對較小，這主要取決于與S.cerevisiae混合培養(yǎng)的不同方式[7]。本試驗中最高的1株L.thermotolerans產(chǎn)生了2.53 g/L乳酸，雖增加的含量不同，但增加的趨勢大致相同。本試驗3組順序接種酒樣產(chǎn)生的蘋果酸與對照酒樣相比降低了21%～24%，有研究表明，L.thermotolerans菌株在乙醇發(fā)酵中也可降解L-蘋果酸，其含量與對照相比下降了8%～26%[4,26-27]，但有些學(xué)者的研究中則未出現(xiàn)這些現(xiàn)象[5,28]，這可能與L.thermotolerans菌株自身性質(zhì)有關(guān)，但具體原因還需進(jìn)一步研究。KAPSOPOULOU等[27]利用L.thermotolerans菌株與S.cerevisiae混合發(fā)酵發(fā)現(xiàn)總酸相比對照增加0.6～5 g/L，而COMITINI等[3]研究發(fā)現(xiàn)其總酸增加0.3～2.2 g/L，pH值降低了0.3，這取決于混合接種的策略不同。但在所有的情況下，增加了的總酸和降低了的pH值的原因是因為乳酸的增加比蘋果酸降解的影響大得多[29]。L.thermotolerans菌株的增酸效應(yīng)對于提高溫暖產(chǎn)區(qū)的低酸度白葡萄汁具有顯著效果[1]。本試驗中，3株L.thermotolerans菌株順序接種發(fā)酵的酯類物質(zhì)與對照酒樣相比，總含量增加，但有些種類也有降低，這可能與不同L.thermotolerans菌株之間的差異有關(guān)。GIL等[30]分析了西班牙馬德里產(chǎn)區(qū)白葡萄酒和桃紅葡萄酒中的香氣成分，發(fā)現(xiàn)其中辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸異戊酯等比其他酯類的含量更高，而在本試驗中也發(fā)現(xiàn)辛酸乙酯、肉桂酸乙酯、乙酸苯乙酯等比其他酯類含量較高。有研究報道，L.thermotolerans菌株比S.cerevisiae會產(chǎn)生更少的高級醇[5,27]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，順序接種發(fā)酵酒樣產(chǎn)生的高級醇的總含量明顯低于S.cerevisiae純種發(fā)酵。BENITO等[5]觀察到涉及L.thermotolerans菌株順序發(fā)酵時，產(chǎn)生的高級醇比S.cerevisiae純種發(fā)酵低了13%，而BALIKCI等[31]也報道了相同的結(jié)果。GOBBI等[4]對L.thermotolerans菌株與S.cerevisiae混合發(fā)酵進(jìn)行研究，評估不同的條件對其產(chǎn)生的影響，其結(jié)果表明，混合發(fā)酵與對照相比產(chǎn)生了大量的2-苯乙醇，2-甲基-1-丁醇和3-甲基-1-丁醇也顯著降低。CHEN等[32]報道在L.thermotolerans菌株混合發(fā)酵中1-丙醇的含量顯著增加，而3-甲基-1-丁醇和2-甲基-1-丁醇顯著降低，這可通過L.thermotolerans菌株自身的差異來解釋以上原因。BENITO等[1]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)L.thermotolerans菌株順序發(fā)酵時，萜烯類化合物增加了15%，而這種現(xiàn)象可能與L.thermotolerans菌株中的葡萄糖苷酶的活性密切相關(guān)。L.thermotolerans菌株參與發(fā)酵的萜烯類總含量顯著高于對照酒樣，且不同菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性香氣化合物的含量大有不同，這可能與菌株自身特性有關(guān)。

4 結(jié)論

L.thermotolerans不同菌株和S.cerevisiae以間隔4 d順序接種方式釀造霞多麗干白葡萄酒，發(fā)酵性能良好，基本理化指標(biāo)符合國標(biāo)要求，對葡萄酒增酸和提高產(chǎn)品香氣質(zhì)量、感官品質(zhì)具有積極影響，但不同L.thermotolerans菌株的釀造潛力各不同。L.thermotolerans菌株順序接種發(fā)酵使供試酒樣中L-乳酸和總酸含量顯著增加，揮發(fā)酸顯著降低；揮發(fā)性香氣化合物中脂肪酸乙酯和醛酮及萜烯類化合物的含量顯著增多；感官分析表明，順序發(fā)酵使酸度增加，口感清爽，果香、花香味突出，酒體平衡。