胡曉倩,李長(zhǎng)江,吳永祥,祁路路,王玉芹,黃輝,韓婷婷

1 (黃山學(xué)院 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,安徽 黃山, 245041) 2 (黃山學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,安徽 黃山, 245041)

徽州呈坎羅氏毛豆腐是原產(chǎn)地保護(hù)的著名大豆發(fā)酵食品，“呈坎羅氏”是其自主品牌商標(biāo)，入選非物質(zhì)文化遺產(chǎn)，是“世博會(huì)”指定產(chǎn)品和“舌尖上的中國(guó)”報(bào)道產(chǎn)品，是不添加任何添加劑及防腐劑的綠色、獨(dú)特、地方性和傳承性的產(chǎn)品。

過(guò)量自由基能引發(fā)組織細(xì)胞病變，組織細(xì)胞病變可引起各種疾病發(fā)生和加速機(jī)體衰老，通過(guò)阻斷過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)減少或消除自由基，可預(yù)防或減少疾病的發(fā)生，且具有防癌、抗癌的作用[1]。體內(nèi)過(guò)剩自由基能夠被具有抗氧化活性的物質(zhì)有效的清除，對(duì)具有抗氧化活性功能的食品的研究極具現(xiàn)實(shí)意義。

目前學(xué)術(shù)界對(duì)于毛豆腐的研究主要集中在毛豆腐發(fā)酵技術(shù)與化學(xué)成分的分析[2]，對(duì)毛豆腐的抗氧化功能研究甚少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)非遺產(chǎn)品徽州呈坎羅氏毛豆腐基本營(yíng)養(yǎng)成分的檢測(cè)、浸提液的制備及其體外抗氧化活性(總還原力及對(duì)自由基清除能力)的測(cè)定，旨在為非遺產(chǎn)品徽州呈坎羅氏毛豆腐功能機(jī)制研究及功能產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

1.1.1 材料

非遺產(chǎn)品徽州呈坎羅氏毛豆腐，由安徽省黃山市呈坎羅氏毛豆腐工作坊提供。普通毛豆腐1和普通毛豆腐2，購(gòu)自安徽省黃山市陽(yáng)湖菜市場(chǎng)的兩家不同商家。

1.1.2 試劑

乙醇、甲醇、磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)、鐵氰化鉀、三氯乙酸、FeCl3、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris-HCl，pH 8.2)、鄰苯三酚、HCl、硫酸亞鐵、水楊酸、過(guò)氧化氫、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、Vc、過(guò)硫酸鉀等，均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水。

1.1.3 儀器與設(shè)備

TDL-5臺(tái)式低速離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠; HH-S恒溫水浴鍋,江蘇省金壇市醫(yī)療儀器有限公司; YP3001N電子天平,上海精密科學(xué)儀器有限公司; pH酸度計(jì),梅特勒-托利多儀器上海有限公司; SX4-10箱式電阻爐,上海樹立儀器儀表有限公司; LPCD-E3000電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海龍躍儀器設(shè)備有限公司; FL-1電子萬(wàn)用爐,北京市永光醫(yī)療儀器有限公司; Microfuge 20R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)中國(guó)有限公司; SpectraMax-190型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀,美國(guó)Moleculear Devices公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 毛豆腐營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)

呈坎羅氏毛豆腐和普通毛豆腐，同時(shí)進(jìn)行以下?tīng)I(yíng)養(yǎng)成分指標(biāo)的檢測(cè)，以示比較。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為平行測(cè)定3次取平均值。

(1)pH值測(cè)定

pH酸度計(jì)測(cè)定。

(2)水分測(cè)定

按照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)和方法(GB/T 5009.3—2010)進(jìn)行測(cè)定[3]。

(3)灰分的測(cè)定

按照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)和方法(GB/T 5009.4—2016)進(jìn)行測(cè)定[4]。

(4)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

用BCA法蛋白含量測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

(5)可溶性總糖含量的測(cè)定

采用蒽酮比色法測(cè)定[5]。以標(biāo)準(zhǔn)品葡萄糖含量X為橫坐標(biāo)，A620為Y縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得線性回歸方程Y=2.123 7X-0.001 2，R2=0.994 1，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在10～80 μg/mL時(shí)與A620呈良好的線性關(guān)系。將待測(cè)樣品溶液測(cè)得的吸光值代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算樣品溶液的含糖量，并換算為100 g毛豆腐樣品中的總糖含量表示(g/100 g)。

(6)Vc含量的測(cè)定

采用2，4-二硝基苯肼比色法測(cè)定[6]。以標(biāo)準(zhǔn)品Vc含量X為橫坐標(biāo)，A500為Y縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得線性回歸方程Y=0.011 3X-0.0013，R2=0.996 7， Vc標(biāo)準(zhǔn)品在1.6～8 μg/mL時(shí)與A500呈良好的線性關(guān)系。將待測(cè)樣品溶液測(cè)得的吸光值代入Vc標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算樣品溶液的Vc含量,并換算為100 g毛豆腐樣品中的Vc含量，mg表示(mg/100 g)。

1.2.2 呈坎羅氏毛豆腐浸提液?jiǎn)我蛩卦O(shè)置和制備

將呈坎羅氏毛豆腐研磨成糊狀，精準(zhǔn)稱取5、10、 20 g置于燒杯中，加入100 mL蒸餾水作為溶劑，攪拌均勻后靜置60 min，得單因素料液比的1∶20、1∶10、 1∶5三個(gè)水平；再在單因素浸提溫度的35 ℃(接近體溫)和100 ℃(接近烹飪的蒸煮溫度)這2個(gè)水平的恒溫水浴鍋中浸提60 min，室溫下靜置冷卻至室溫，2 000 r/min離心15 min，再在4 ℃, 14 000 r/min離心30 min，取上清液為浸提液，置4 ℃冷藏備用。每個(gè)水平的實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.3 呈坎羅氏毛豆腐浸提液的可溶性固形物含量測(cè)定

采用干燥法測(cè)定[7]。選取干燥稱量容器，稱重后將重量記為W0。加入1 mL浸提液(按照1.2.2制備)，稱重后記為W1。90 ℃烘30 min，然后將烘箱溫度調(diào)為105 ℃，烘1.5 h后拿出，再放入干燥器中干燥30 min，稱重后記為W2(一定要達(dá)到恒重，即質(zhì)量差值小于0.2 mg)。每個(gè)水平浸提液均平行做3份。按照公式(1)計(jì)算可溶性固形物含量。

(1)

1.2.4 呈坎羅氏毛豆腐浸提液體外抗氧化活性檢測(cè)

(1)呈坎羅氏毛豆腐浸提液總還原力的測(cè)定

采用普魯士藍(lán)法[8]。用合適濃度的Vc水溶液做參照，評(píng)價(jià)浸提液的總還原力。每個(gè)水平浸提液重復(fù)3次。

(2)呈坎羅氏毛豆腐浸提液對(duì)超氧陰離子清除能力的測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法[9-11]。用合適濃度的Vc水溶液做參照，評(píng)價(jià)浸提液對(duì)超氧陰離子的清除能力。每個(gè)水平浸提液重復(fù)3次。

(3)呈坎羅氏毛豆腐浸提液對(duì)羥自由清除能力的測(cè)定

采用水楊酸捕獲羥自由基法[12-13]。用合適濃度的Vc水溶液做參照，評(píng)價(jià)浸提液對(duì)羥自由基的清除能力。每個(gè)水平浸提液重復(fù)3次。

(4)呈坎羅氏毛豆腐浸提液對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

采用DPPH法[14-16]。用合適濃度的Vc水溶液做參照，評(píng)價(jià)浸提液對(duì)DPPH自由基的清除能力。每個(gè)水平浸提液重復(fù)3次。

(5)呈坎羅氏毛豆腐浸提液對(duì)ABTS自由基清除率的測(cè)定

采用ABTS法[17-18]。用合適濃度的Vc水溶液做參照，評(píng)價(jià)浸提液對(duì)ABTS自由基的清除能力。每個(gè)水平浸提液重復(fù)3次。

1.2.5 呈坎羅氏毛豆腐浸提液體外抗氧化活性數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，利用Duncan′s多重比較法分析樣本間的差異顯著性，P<0.05認(rèn)為樣本間具有顯著差異。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 呈坎羅氏毛豆腐和普通毛豆腐的營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)結(jié)果

營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，普通毛豆腐的pH值波動(dòng)較大，呈現(xiàn)不穩(wěn)定的狀態(tài)，而呈坎羅氏毛豆腐的pH值很穩(wěn)定，呈弱堿性。呈坎羅氏毛豆腐的水分、灰分、可溶性總糖和Vc含量都略高于普通毛豆腐。呈坎羅氏毛豆腐的蛋白質(zhì)含量達(dá)到20.830 gmL，遠(yuǎn)高于普通毛豆腐的蛋白質(zhì)含量。相比普通毛豆腐，徽州呈坎羅氏毛豆腐具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

表1 呈坎羅氏毛豆腐和普通毛豆腐的營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)結(jié)果Table 1 The results of nutritional components in Luo’s hariy toufu and the oridinary hariy toufu

2.2 呈坎羅氏毛豆腐浸提液的總還原力

還原能力強(qiáng)的物質(zhì)因其化學(xué)本質(zhì)為還原劑，將會(huì)是良好的電子供體，研究發(fā)現(xiàn)總還原力與物質(zhì)的抗氧化活性呈正相關(guān)[19]。一般情況下具有較強(qiáng)還原能力的物質(zhì)能夠把Fe3+還原成Fe2+，根據(jù)顯色反應(yīng)可以判斷其還原程度，反應(yīng)后的吸光度越大的物質(zhì)其還原能力越強(qiáng)[20]。呈坎羅氏毛豆腐浸提液和對(duì)照品Vc的總還原力實(shí)驗(yàn)測(cè)定的A700數(shù)值如表2所示。

由表2可知，2個(gè)單因素的不同水平得到的浸提液的總還原力具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P<0.05)。料液比降低，可溶性固形物含量增加，總還原力增加；相同的料液比，浸提溫度從35 ℃(接近體溫)升高到100 ℃(接近食品加工蒸煮溫度)，可溶性固形物含量和總還原力均明顯增加。以Vc為參照，料液比同為1∶5，35 ℃的浸提液的總還原力，與25 μg/mL的Vc相當(dāng)，而100 ℃浸提液的總還原能力明顯提升，與50 μg/mL的Vc相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，呈坎羅氏毛豆腐浸提液具有一定的抗氧化能力，浸提溫度的升高，有利于浸提液可溶性固形物中活性成分的有效釋放并促進(jìn)總還原力的提升。

表2 呈坎羅氏毛豆腐浸提液的總還原力Table 2 The reducing power of the different extracts of Luo′s hairy toufu in Chengkan village

注：同列不同字母表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異(P<0.05)；“-”表示未檢出。

2.3 呈坎羅氏毛豆腐浸提液對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力

呈坎羅氏毛豆腐浸提液和對(duì)照品Vc對(duì)超氧陰離子自由基的清除率如表3所示。由表3可知，2個(gè)單因素的不同水平得到的浸提液，其對(duì)超氧陰離子自由基的清除率有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P<0.05)。浸提液對(duì)超氧陰離子自由基的清除率，隨著料液比降低、可溶性固形物含量增加或浸提溫度升高而呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。以Vc為參照，實(shí)驗(yàn)中的不同浸提液，對(duì)超氧陰離子均有較好的清除能力，基本高于120 μg/mL的Vc，而且，料液比為1∶5的100 ℃浸提的毛豆腐浸提液，清除能力已超過(guò)200 μg/mL Vc溶液的清除能力，說(shuō)明呈坎羅氏毛豆腐浸提液對(duì)超氧陰離子有較好的清除能力。

表3 呈坎羅氏毛豆腐浸提液對(duì)超氧陰離子自由基的清除率Table 3 The scavenging activity of the different extracts of Luo's hairy toufu in Chengkan village

注：同列不同字母表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異(P<0.05);“-”表示未檢出。

2.4 呈坎羅氏毛豆腐浸提液對(duì)羥自由基的清除能力

呈坎羅氏毛豆腐浸提液和對(duì)照品Vc對(duì)羥自由基的清除率如表4所示。由表4可知，2個(gè)單因素的不同水平得到的浸提液，其對(duì)羥自由基的清除率有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P<0.05)。浸提液對(duì)羥基自由基的清除率，隨著料液比降低、可溶性固形物含量增加或浸提溫度升高而呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。以Vc為參照，實(shí)驗(yàn)中的不同浸提液，對(duì)羥自由基均有較好的清除能力，介于120～600 μg/mL的Vc，料液比為1∶5的100 ℃浸提液對(duì)羥自由基的清除效果，已極大超過(guò)了200 μg/mL的Vc溶液的清除效果，與600 μg/mL的Vc溶液清除效果大致相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，呈坎羅氏毛豆腐浸提液對(duì)羥自由基有較強(qiáng)的清除能力。

表4 呈坎羅氏毛豆腐浸提液對(duì)羥自由基的清除率Table 4 The scavenging activity of ·OH in the different extracts of Luo′s hairy toufu in Chengkan village

注：同列不同字母表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異(P<0.05);“-”表示未檢出。

2.5 呈坎羅氏毛豆腐浸提液對(duì)DPPH自由基的清除能力

呈坎羅氏毛豆腐浸提液和對(duì)照品Vc對(duì)DPPH自由基的清除率如表5所示。由表5可知，兩個(gè)單因素的不同水平得到的浸提液，其對(duì)DPPH自由基的清除率有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P<0.05)。浸提液對(duì)DPPH自由基的清除率，隨著料液比降低、可溶性固形物含量增加或浸提溫度升高而呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。以Vc為參照，料液比為1∶5的35 ℃的浸提液對(duì)DPPH自由基的清除效果，與20 μg/mL Vc溶液的清除效果相當(dāng)，而100 ℃浸提的毛豆腐浸提液對(duì)DPPH自由基清除能力，就明顯高于20 μg/mL Vc溶液，說(shuō)明呈坎羅氏毛豆腐浸提液對(duì)DPPH自由基有一定的清除能力。

表5 呈坎羅氏毛豆腐浸提液對(duì)DPPH自由基的清除率Table 5 The scavenging activity of DPPH· in the different extracts of Luo′s hairy toufu in Chengkan village

注：同列不同字母表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異(P<0.05)；“-”表示未檢出。

2.6 呈坎羅氏毛豆腐浸提液對(duì)ABTS自由基的清除能力

呈坎羅氏毛豆腐浸提液和對(duì)照品Vc對(duì)ABTS自由基的清除率如表6所示。由表6可知，2個(gè)單因素的不同水平得到的浸提液，其對(duì)ABTS自由基的清除率有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P<0.05)。浸提液對(duì)ABTS自由基的清除率，隨著料液比降低、可溶性固形物含量增加或浸提溫度升高而呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。以Vc為參照，實(shí)驗(yàn)中的不同浸提液，對(duì)ABTS自由基均有較好的清除能力，介于40～200 μg/mL的Vc，料液比為1∶5的100 ℃浸提的毛豆腐浸提液對(duì)ABTS自由基的清除效果與200 μg/mL的Vc溶液相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，呈坎羅氏毛豆腐浸提液對(duì)ABTS自由基有較好的清除能力。

表6 呈坎羅氏毛豆腐浸提液對(duì)ABTS自由基的清除率Table 6 The scavenging activity of ABTS· in the different extracts of Luo′s hairy toufu in Chengkan village

注：同列不同字母表示在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異(P<0.05);“-”表示未檢出。

3 結(jié)論

在眾多的植物性蛋白質(zhì)中，只有大豆蛋白能提供所有的必需氨基酸，是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織指定的優(yōu)質(zhì)蛋白，成為越來(lái)越重要的植物蛋白資源[21-22]。本研究綜合對(duì)比分析了徽州呈坎羅氏毛豆腐和普通毛豆腐的基本營(yíng)養(yǎng)成分(pH、水分、灰分、蛋白質(zhì)含量、總糖含量、Vc含量)，結(jié)果顯示徽州呈坎羅氏毛豆腐蛋白質(zhì)、Vc以及可溶性總糖的含量高于普通毛豆腐，具較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

Vc是重要的水溶性捕捉型抗氧化物，能清除活性氧自由基，具抗衰老、預(yù)防心血管疾病等多種生理功能，促進(jìn)人體正常生理代謝的平衡[23-24]。吳非等的研究顯示，傳統(tǒng)霉菌發(fā)酵豆制品具有較高的抗氧化活性[25]。徽州毛豆腐是將來(lái)自于大豆蛋白的豆腐自然接種毛霉菌，發(fā)酵4～7 d而成。在發(fā)酵過(guò)程中因微生物及酶的作用，在毛豆腐中產(chǎn)生了許多生物活性物質(zhì)[2, 26]。本實(shí)驗(yàn)以不同浸提溫度與料液比為因素水平，研究了徽州呈坎羅氏毛豆腐浸提液的抗氧化活性，以闡明不同加工方式對(duì)其功能活性的影響。結(jié)果表明，徽州呈坎羅氏毛豆腐浸提液具有較好的總還原力和對(duì)超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力。不同浸提溫度與料液比對(duì)徽州呈坎羅氏毛豆腐浸提液抗氧化活性的影響顯著。相比35 ℃(接近體溫)的浸提液，100 ℃(接近食品加工蒸煮溫度)的浸提液，其體外抗氧化能力明顯增強(qiáng)。本研究首次闡明了非遺產(chǎn)品徽州呈坎羅氏毛豆腐的功能活性，并為其合理的加工方式提供了技術(shù)參考，為其成為可開發(fā)的抗氧化功能食品提供了理論依據(jù)。下一步將對(duì)100 ℃浸提的毛豆腐浸提液進(jìn)行主要活性成分分析，以明確抗氧化活性的主要成分。