巫偉峰，陳孝丑，陳發(fā)興，黃曉慧，陳 春，張毅智，汪長(zhǎng)水

(1.福建省林業(yè)科技試驗(yàn)中心，福建 南靖 363600；2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350000；3.福州植物園，福建 福州 350000；4.貴州省植物園，貴州 貴陽(yáng) 550000)

【研究意義】中國(guó)蘭是國(guó)人對(duì)中國(guó)傳統(tǒng)蘭花的統(tǒng)稱(chēng)，簡(jiǎn)稱(chēng)國(guó)蘭，屬蘭科(Orchidaceae)蘭屬(Cymbidium)植物，主要有春蘭、建蘭、墨蘭、蕙蘭、寒蘭、春劍、蓮瓣蘭和豆瓣蘭等八大類(lèi)[1]。從古至今，國(guó)蘭一直為我國(guó)文人雅客所稱(chēng)頌，觀其態(tài)、聞其香、品其韻，素有“花中君子”、“王者香”等美譽(yù)，具有極高的觀賞及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。我國(guó)具有豐富的野生國(guó)蘭種質(zhì)資源，但由于過(guò)度盜采或不合理開(kāi)發(fā)，許多珍貴資源正逐漸趨于瀕危。近年，隨著我國(guó)對(duì)國(guó)蘭遺傳資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用的日益重視，我國(guó)學(xué)者陸續(xù)開(kāi)展了國(guó)蘭種質(zhì)資源調(diào)查[2]、形態(tài)學(xué)標(biāo)記[3]、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記[4]、生化標(biāo)記[5]及分子標(biāo)記[6-8]等方面的研究，在國(guó)蘭的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)、物種鑒定、遺傳多樣性及親緣關(guān)系等方面已然具有一定的技術(shù)積累，但在分析效率、準(zhǔn)確性、專(zhuān)業(yè)性要求等方面仍然存在諸多局限。因此，探尋一種快速、容易上手、結(jié)果可靠的遺傳鑒定策略十分必要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】DNA條形碼(DNA barcoding)技術(shù)是利用基因組中一段公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的 DNA 片段來(lái)進(jìn)行物種鑒定的分子診斷新技術(shù)，該概念自加拿大分類(lèi)學(xué)家Paul Hebert(2003)首次提出后，便受到各國(guó)科學(xué)家的廣泛關(guān)注，是近年來(lái)植物分子系統(tǒng)學(xué)研究的熱點(diǎn)[9]，已成功應(yīng)用于生物物種分類(lèi)和鑒定、生態(tài)學(xué)調(diào)查及生物多樣性評(píng)估等研究領(lǐng)域[10]。目前被提議用于DNA條形碼技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段主要有rpoB、rpoC1、matK、rbcL、psbA-trnH、atpF-atpH、psbK-psbI、ITS、ITS2等核酸片段[11]。其中葉綠體基因片段matK和rbcL在2009年被國(guó)際條形碼協(xié)會(huì)植物工作組提出作為陸地植物通用的條形碼序列，并建議將葉綠體基因片段psbA-trnH和核糖體DNA ITS作為補(bǔ)充條形碼[12]。2011 年，中國(guó)植物條形碼研究組通過(guò)對(duì)1757種植物的psbA-trnH、ITS/ITS2及rbcL+matK序列或序列組合進(jìn)行鑒別能力評(píng)價(jià)，提出將ITS/ITS2序列作為種子植物的核心條形碼，psbA-trnH作為輔助條形碼序列[13]。為了實(shí)現(xiàn)國(guó)蘭鑒定的自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化，突破對(duì)經(jīng)驗(yàn)及專(zhuān)業(yè)的局限，建立一套有效的國(guó)蘭DNA條形碼鑒定技術(shù)體系?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本文建立國(guó)蘭中幾種常見(jiàn)DNA條形碼的PCR擴(kuò)增方法，并利用電泳成像、BLASTN等技術(shù)驗(yàn)證方法的有效性。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為進(jìn)一步研究國(guó)蘭的DNA條形碼技術(shù)提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)樣品取自福建省南靖縣，樣品信息見(jiàn)表1。采取健康、無(wú)病蟲(chóng)害新鮮嫩葉，使用75 %酒精對(duì)葉片表面進(jìn)行清潔，做好樣品相關(guān)信息標(biāo)記，液氮速凍，置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

參照本課題組黃曉慧等文獻(xiàn)報(bào)道[14]中的研磨儀法提取樣品DNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系在高連明等方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化[10]。修改后方法如下，PCR反應(yīng)液組成：總20 μl 體系，10 μl 2 ×TaqMaster Mix(廈門(mén)泰京生物技術(shù)有限公司)，1 μl 模板DNA，上下游引物各0.5 μl，無(wú)菌水8 μl。引物信息見(jiàn)表2，委托北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行合成。PCR反應(yīng)程序(BIO-RAD T100TM PCR儀)：94 ℃預(yù)變性 4 min，94 ℃變性45s，退火 1 min(溫度見(jiàn)表2)，72 ℃延伸 1 min，循環(huán)數(shù)35，72 ℃終延伸 10 min。PCR產(chǎn)物通過(guò)經(jīng)天根DNA純化回收試劑盒(DP214-03)純化后，委托北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

表1 樣品信息表

表2 引物信息列表

M 表示標(biāo)準(zhǔn)分子量，數(shù)字編號(hào)對(duì)應(yīng)表1樣品M represents the standard molecular weight, and the numerical number corresponds to the samples of table 1圖1 國(guó)蘭中ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic map of PCR amplification products of ITS2, psbA-trnH, rbcL and matK in Chinese orchid

1.3 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序結(jié)果拼接和質(zhì)量評(píng)估使用CodonCode Aligner V2.06(CodonCode, USA)軟件進(jìn)行分析。序列質(zhì)量評(píng)價(jià)判斷方法參照國(guó)際DNA 條形碼協(xié)會(huì)(CBOL)的通用標(biāo)準(zhǔn)[11]。ITS和ITS2序列采用隱馬爾可夫模型HMMer真核生物的注釋方法，去除序列兩端5.8S和26S區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列[22]。psbA-trnH、rbcL、matK等3個(gè)條形碼序列直接利用CodonCode Aligner V2.06(CodonCode,USA)軟件除去引物區(qū)獲得相應(yīng)序列。序列驗(yàn)證使用NCBI網(wǎng)站的BLASTN相似序列檢索在線工具。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)

由圖1可知，除ITS存在非特異擴(kuò)增外，ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK均在相應(yīng)分子量位置獲得單一特異條帶。結(jié)果表明White等[15]設(shè)計(jì)的ITS通用引物不適用于國(guó)蘭，ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK等幾種條形碼序列通用引物可以用于國(guó)蘭的DNA條形碼分析。

圖2 ‘復(fù)興奇蝶’的 ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK 條形碼序列測(cè)序局部峰圖Fig.2 Local peak map of ITS2, psbA-trnH, rbcL and matK sequences of ‘Fuxingqiedie’

表3 序列的BLASTN驗(yàn)證結(jié)果

注：C.為Cymbidium.縮寫(xiě)。

2.2 序列驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增獲得的ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序成功率為100 %，成功獲得16條條形碼序列如圖2所示。采用NCBI的BLASTN核苷酸序列相似檢驗(yàn)在線工具對(duì)獲得16條序列進(jìn)行相似序列檢驗(yàn)如表3所示，列出每個(gè)供試樣品相應(yīng)條形碼序列相似總得分排名前5的物種名稱(chēng)，結(jié)果顯示所獲16條序列均與蘭屬物種具有極高相似度，表明通過(guò)本研究PCR擴(kuò)增方法可以有效獲得相應(yīng)條形碼序列。

3 小 結(jié)

本研究通過(guò)電泳成像、BLASTN核苷酸序列相似度檢驗(yàn)等分析手段，驗(yàn)證了國(guó)蘭中常見(jiàn)幾種DNA條形碼PCR擴(kuò)增方法的有效性，結(jié)果表明文中所報(bào)道的PCR擴(kuò)增方法可以用于國(guó)蘭ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK等幾種條形碼的分析研究。ITS序列由于引物存在非特異擴(kuò)增，需要設(shè)計(jì)或選擇新的引物進(jìn)行嘗試，這可能與ITS序列兩端保守性較低有關(guān)，針對(duì)不同類(lèi)群需要相適宜的引物，通用性較差。高連明等針對(duì)ITS通用性較差的問(wèn)題，列出了多個(gè)目前種子植物ITS通用性較高的引物組合，3個(gè)正向引物(ITS5、ITS5a、ITS1)均可以與反向引物ITS4組合進(jìn)行PCR反應(yīng)[10]。

相比前人的DNA條形碼技術(shù)PCR反應(yīng)體系[10, 23]，本研究的PCR反應(yīng)溶液操作體系更為簡(jiǎn)單，這得益于混合酶試劑的使用。傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)溶液需要加入DNA聚合酶(Taq酶)、反應(yīng)緩沖液(10 × buffer)、dNTPs混合物(甚至dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、上游引物和下游引物、MgCl2、無(wú)菌水等試劑，加樣操作繁瑣。而混合酶試劑是由TaqDNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2以及反應(yīng)緩沖液制成的混合試劑，試劑可以直接用于PCR擴(kuò)增，且不影響反應(yīng)效果和后續(xù)測(cè)序，使用混合酶只需在PCR反應(yīng)溶液中加入混合酶、上游引物和下游引物、無(wú)菌水及DNA模板即可進(jìn)行PCR反應(yīng)，大大簡(jiǎn)化了PCR反應(yīng)操作流程。本研究結(jié)果顯示，該混合酶可以有效用于國(guó)蘭ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK等幾種條形碼的PCR反應(yīng)，是提高國(guó)蘭DNA條形碼鑒定效率的一種有益嘗試。