張麗娜　劉相富　李遠(yuǎn)　葉艷玲　溫力挽　劉家友　賴文輝

【摘要】 目的 研究3D支架搭載間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）對促進(jìn)造血干細(xì)胞（HSC）體外生產(chǎn)血小板的影響。方法 從本院本部干細(xì)胞臨床研究中心購買種子細(xì)胞HSC及MSC。取適量生物材料， 環(huán)氧乙烷消毒后使用伊思柯夫改良培養(yǎng)液（IMDM）浸泡過夜。將一定數(shù)量間MSC貼壁培養(yǎng)至生物材料中， 待其長滿。設(shè)置分組：對照組（24孔板內(nèi)單獨(dú)培養(yǎng)HSC）、MSC組（24孔板內(nèi)單獨(dú)接種MSC）、實(shí)驗(yàn)組（即HSC+3D-MSC+細(xì)胞因子）， 體外共培養(yǎng)7 d， 分別于1～7 d時觀察HSC的形態(tài)變化;比較三組不同時間點(diǎn)HSC活性細(xì)胞數(shù)量;采用細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）法測定HSC擴(kuò)增情況。結(jié)果 熒光顯微鏡觀察顯示：對照組可見HSC細(xì)胞呈均一的圓形;MSC組可見MSC呈長梭形;實(shí)驗(yàn)組可見圓形細(xì)胞和長梭形細(xì)胞， 在同一視野進(jìn)行白光和熒光拍照， 并經(jīng)PS軟件合成處理后， 可見清晰細(xì)胞排列。實(shí)驗(yàn)組第1、3、5、7天時HSC活性細(xì)胞數(shù)量分別為（3.00±0.15）、（15.45±2.78）、（133.33±24.68）、（218.88±16.04）×104， 明顯高于對照組的（1.30±0.23）、（3.75±0.66）、（5.60±0.68）、（8.58±0.29）×104和MSC組的（1.35±0.60）、（10.18±0.99）、（36.51±2.77）、（56.67±1.88）×104， 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。對各組培養(yǎng)第1、3、5、7天HSC樣本進(jìn)行CCK-8法檢測， 從生長曲線可以看出各組HSC數(shù)量均隨培養(yǎng)時間的延長而增加， 第3天開始進(jìn)入對數(shù)生長期， 與骨髓MSC共培養(yǎng)對HSC增殖有促進(jìn)作用， 3D支架搭載較對照組和MSC組對HSC增殖的促進(jìn)作用更明顯。結(jié)論 3D支架搭載MSC在體外能夠有效促進(jìn)HSC增殖， 顯著提高血小板產(chǎn)量。

【關(guān)鍵詞】 3D支架;間充質(zhì)干細(xì)胞;造血干細(xì)胞;血小板

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.24.109

Study on in vitro platelet production by hematopoietic stem cells promoted by mesenchymal stem cells loaded on 3D scaffolds? ?ZHANG Li-na， LIU Xiang-fu， LI Yuan， et al. Department of Blood Transfusion， Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University Yuedong Hospital， Meizhou 514700， China

【Abstract】 Objective? ?To study the effect of in vitro platelet production by hematopoietic stem cells （HSC） promoted by mesenchymal stem cells （MSC） on 3D scaffolds. Methods? Seed cells HSC and MSC were purchased from our clinical stem cell research center. After disinfection with ethylene oxide， appropriate biomaterials were soaked overnight in Iscoves modified Dubeccos medium （IMDM）. A certain number of MSCs are adherently cultured into biological materials until they are overgrown. The grouping was set up： control group （HSC cultured in 24-well plate alone）， MSC group （MSC inoculated separately in 24-well plate）， experimental group （HSC+3D-MSC+cytokine）， co-cultured for 7 d in vitro. The morphological changes of HSC were observed at 1-7 d， and the number of HSC active cells at different time points was compared among the three groups. HSC amplification was detected by cell counting kit-8 （CCK-8）. Results? Fluorescence microscopy showed that HSC cells were uniform round in the control group， long spindle in the MSC group， and round and long spindle cells in the experimental group. White light and fluorescence photographs were taken in the same field of vision， and clear cell arrangement was observed after PS software synthesis. At 1st， 3rd， 5th and 7th day， the experimental group had obviously higher number of HSC active cells respectively as （1.30±0.23）， （3.75±0.66）， （5.60±0.68）， （8.58±0.29）×104 in the controll group， and （1.35±0.60）， （10.18±0.99）， （36.51±2.77） and （56.67±1.88）×104 in MSC group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. CCK-8 method was used to detect HSC samples from the 1st， 3rd， 5th and 7th day of culture in each group. The growth curve showed that the number of HSC in each group increased with the prolongation of culture time. On the 3rd day， HSC began to enter the logarithmic growth phase. Co-culture with bone marrow MSC promoted the proliferation of HSC. Compared with control group and MSC group， the effect of 3D scaffolds loading on HSC proliferation was more obvious. Conclusion? MSC loaded on 3D scaffolds can effectively promote HSC proliferation and significantly increase platelet production in vitro.

【Key words】 3D scaffolds; Mesenchymal stem cells; Hematopoietic stem cells; Platelet

臨床工作中， 血小板輸注是一項(xiàng)最常用， 也是最有效的治療手段， 目前血小板的主要來源是靠機(jī)采和手工制備兩種方式， 機(jī)器獲得的血小板對供體有更高的要求， 而用全血制備的手動血小板需要不止一個人混合， 導(dǎo)致抗原-抗體反應(yīng)發(fā)生率較高[1]。因此， 在體外尋找安全可靠的血小板來源已成為當(dāng)前研究的一個關(guān)鍵難題。近年來關(guān)于間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell， MSC）促進(jìn)內(nèi)造血干細(xì)胞（hemopoietic stem cell， HSC）增殖的研究已有不少， 但建立穩(wěn)定高效的干細(xì)胞向血小板生產(chǎn)平臺一直是臨床探討的熱門話題[2]。本研究旨在獲得3D支架搭載MSC促進(jìn)HSC體外生產(chǎn)血小板的可靠證據(jù)和實(shí)驗(yàn)方法， 以期為研制新型生物反應(yīng)器， 利用體外培養(yǎng)方法大量生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化的血小板， 從而解決輸血醫(yī)學(xué)所面臨的難題， 并為其提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)， 現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料來源 從本院本部干細(xì)胞臨床研究中心購買種子細(xì)胞HSC及MSC。取適量生物材料， 環(huán)氧乙烷消毒后使用IMDM浸泡過夜。將一定數(shù)量間MSC貼壁培養(yǎng)至生物材料中， 待其長滿。

1. 2 實(shí)驗(yàn)方法 設(shè)置分組：①對照組：24孔板內(nèi)單獨(dú)接種HSC;② MSC組：24孔板內(nèi)單獨(dú)接種MSC;③實(shí)驗(yàn)組：即HSC+3D-MSC+細(xì)胞因子[干細(xì)胞因子（SCF）、rh促血小板生成素（rhTPO）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-11（IL-11）]置37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 每3天全量更換培養(yǎng)液及細(xì)胞因子。每組3個復(fù)孔， 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次， 以此為觀察樣本。

1. 2. 1 細(xì)胞形態(tài)觀察 ①在不同時間點(diǎn)收集單個核細(xì)胞（MNC）， 取適量細(xì)胞至1.5 mlEP管中， 用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次， 以1800 rpm離心5 min， 加入適量PBS重懸細(xì)胞。②標(biāo)記載玻片， 按照細(xì)胞涂片機(jī)的說明進(jìn)行安裝， 加入65 μl細(xì)胞懸液， 以2000 rpm離心5 min， 小心取出載玻片。③瑞氏-吉姆薩（Wright-Gimsa）染色步驟如下：a.將載玻片置于水平方向， 等待稍微風(fēng)干， 然后將Wright-Gimsa染色液A加入載玻片中。讓其完全覆蓋細(xì)胞涂片范圍， 并保持染色1 min;b.加入Wright-Gimsa染色溶液B溶液以覆蓋載玻片的染色溶液A（加入量約為A液總量的2～3倍）。輕輕搖動載玻片， 徹底混合A和B染料， 靜置10 min;c.用水輕輕沖洗剩余的染料溶液， 在室溫下靜置使其完全干燥， 并加入2滴中性樹脂。輕輕放置蓋玻片， 讓液滴布滿整個載玻片， 等待其干燥， 在顯微鏡下觀察并拍照。

1. 2. 2 細(xì)胞增殖能力分析 將具有良好生長狀態(tài)的P5MSC消化并稀釋成1×10E4細(xì)胞/ml細(xì)胞懸浮液。根據(jù)100 μl/孔

接種于96孔板中， 并在每組中設(shè)置8個重復(fù)孔， 總共4個板。24 h后吸出原始培養(yǎng)基并用PBS洗滌2次。根據(jù)第一組， 接種100 μl含有2×10個E5 MNC細(xì)胞的巨核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基-X細(xì)胞懸浮液。與MSC直接共培養(yǎng)。每天在固定時間向一個孔板中的樣品孔中加入10 μl CCK-8液體， 并使其在培養(yǎng)箱中靜置2 h。將其置于酶聯(lián)儀器中， 測量450 nm處的吸光度， 并繪制細(xì)胞生長曲線。

1. 3 觀察指標(biāo) 體外共培養(yǎng)7 d， 分別于1～7 d時觀察HSC的形態(tài)變化;比較三組不同時間點(diǎn)HSC活性細(xì)胞數(shù)量;采用CCK-8法測定HSC擴(kuò)增情況。

1. 4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn);計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 三組鏡下HSC形態(tài)觀察 熒光顯微鏡觀察顯示：對照組可見HSC細(xì)胞呈均一的圓形;MSC組可見MSC呈長梭形;實(shí)驗(yàn)組可見圓形細(xì)胞和長梭形細(xì)胞， 在同一視野進(jìn)行白光和熒光拍照， 并經(jīng)PS軟件合成處理后， 可見清晰細(xì)胞排列。HSC是綠色熒光蛋白（GFP）細(xì)胞， 在熒光顯微鏡下顯示綠色熒光， 用于與MSC接觸共培養(yǎng)時區(qū)分兩種細(xì)胞。見圖1， 圖2， 圖3。

2. 2 三組不同時間點(diǎn)HSC活性細(xì)胞數(shù)量比較 實(shí)驗(yàn)組第1、3、5、7天時HSC活性細(xì)胞數(shù)量明顯高于對照組與MSC組， 差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2. 3 CCK-8法檢測HSC增殖情況 對各組培養(yǎng)第1、3、5、7天HSC樣本進(jìn)行CCK-8法檢測， 從生長曲線可以看出各組HSC數(shù)量均隨培養(yǎng)時間的延長而增加， 第3天開始進(jìn)入對數(shù)生長期， 與骨髓MSC共培養(yǎng)對HSC增殖有促進(jìn)作用， 3D支架搭載較對照組和MSC組對HSC增殖的促進(jìn)作用更明顯。見圖4。

3 討論

干細(xì)胞作為具有自我更新和多向分化潛能的種子細(xì)胞， 在體外誘導(dǎo)產(chǎn)生干細(xì)胞的血小板已成為解決該問題的重要切入點(diǎn)。如何建立穩(wěn)定高效的干細(xì)胞向血小板生產(chǎn)平臺， 可以同時保證血小板的產(chǎn)量和質(zhì)量， 為血小板相關(guān)疾病患者提供有效的治療保障， 具有很大的社會和經(jīng)濟(jì)效益[3]。目前， 許多研究表明[4]， 胚胎干細(xì)胞、臍帶、骨髓、外周血衍生的造血干/祖細(xì)胞， 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞等可用作種子細(xì)胞。在適當(dāng)條件下誘導(dǎo)分化以促進(jìn)細(xì)胞增殖和巨核細(xì)胞分化， 并最終產(chǎn)生巨核細(xì)胞祖細(xì)胞、巨核細(xì)胞和血小板， 雖然運(yùn)用上述方法均能在體外培養(yǎng)出血小板。但是， 在這些培養(yǎng)體系中， 所得血小板量非常低， 不足以用于臨床輸注[5]。因此， 在血小板體外生成過程中建立完善的培養(yǎng)體系， 提高干細(xì)胞的擴(kuò)增能力以獲得數(shù)量和質(zhì)量均可以媲美體內(nèi)生成的血小板以滿足臨床需求， 亟待進(jìn)一步探索和研究。

有學(xué)者研究表明[6]， 骨髓MSC和細(xì)胞外基質(zhì)組成的造血微環(huán)境對HSC自我更新和造血分化具有明顯的支持作用， 細(xì)胞因子組合TPO+SCF+白細(xì)胞介素-3（IL-3）+IL-6可在培養(yǎng)的第7天擴(kuò)增至巨核細(xì)胞數(shù)的39倍。因子組合TPO+SCF+IL-3在培養(yǎng)的第7天擴(kuò)增至36倍。在TPO+SCF培養(yǎng)的第7天， 細(xì)胞數(shù)量僅增加了29倍?？梢钥闯?， 細(xì)胞因子的組合在巨核細(xì)胞擴(kuò)增中起重要作用。但是， 短期細(xì)胞因子刺激可顯著擴(kuò)增HSC的數(shù)量， 可是長期刺激下將會導(dǎo)致細(xì)胞分化擴(kuò)增， 導(dǎo)致造血細(xì)胞衰竭。在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)， MSC與HSC共同移植， 可顯著促進(jìn)造血重建等， 在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中， MSC可顯著維持HSC的干性， 另一方面， 細(xì)胞只有在三維空間中處于相對的位置才有助于細(xì)胞間物質(zhì)及信號的傳遞和表達(dá)[7]。因此， 3D培養(yǎng)對提高干細(xì)胞體外擴(kuò)增因子、延長體外培養(yǎng)時間和維持自我更新能力具有顯著作用。

由于MSC能維持HSC干性， 并能促進(jìn)其定向分化， 3D培養(yǎng)能模擬體內(nèi)細(xì)胞生長環(huán)境， 顯著提高干細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)， 因此本文提出3D支架搭載MSC促進(jìn)HSC體外生產(chǎn)血小板的研究， 以建立最新血小板體外生產(chǎn)體系， 形成極其類似人體骨髓環(huán)境的具有MSC支持的利基（niche）結(jié)構(gòu)， 分析本研究結(jié)果得出：共培養(yǎng)7 d， 各組HSC數(shù)量均隨著培養(yǎng)時間的延長而增加。實(shí)驗(yàn)組在第1、3、5、7天時HSC活性數(shù)量明顯高于對照組與MSC組， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）?？梢?D支架培養(yǎng)能顯著提高干細(xì)胞的體外擴(kuò)增倍數(shù)。分析原因：細(xì)胞在支架上的生長、移植和內(nèi)生長率直接依賴于支架的多孔結(jié)構(gòu)、孔隙率、孔的直徑和孔的形狀， 3D支架培養(yǎng)能很好地模擬HSC微環(huán)境的三維組織結(jié)構(gòu)， 為細(xì)胞增殖提供良好的生長環(huán)境[8]。

綜上所述， 在3D支架培養(yǎng)環(huán)境下， 加上MSC共培養(yǎng)以維持HSC干性， 能夠顯著提高HSC向巨核系定向分化效率， 并得到大量穩(wěn)定的產(chǎn)板巨核細(xì)胞及血小板， 有助于為研制新型生物反應(yīng)器， 利用體外培養(yǎng)方法大量生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化的血小板， 從而解決輸血醫(yī)學(xué)所面臨的難題， 并為其提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)， 3D培養(yǎng)是一個產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)血小板的重要研究方向。

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