楊明鎮(zhèn)　趙逵

【摘要】 目的 研究哇巴因?qū)Ω伟┘?xì)胞株P(guān)-糖蛋白（P-gp）表達(dá)的影響。方法 選用人肝癌Bel-7402細(xì)胞株， 阿霉素（ADM）大劑量間斷沖擊法建立Bel-7402/ADM模型并設(shè)為耐藥組， 正常Bel-7402設(shè)為對(duì)照組。采用免疫印跡（WB）檢測(cè)兩組哇巴因干預(yù)前后P-gp表達(dá)水平。結(jié)果 哇巴因干預(yù)前， 耐藥組P-gp表達(dá)水平為（72.68±0.07）， 對(duì)照組為（22.21±0.04）;哇巴因干預(yù)后， 耐藥組P-gp表達(dá)水平為（20.61±0.04）， 對(duì)照組為（14.32±0.05）;哇巴因干預(yù)后， 兩組P-gp水平均顯著低于哇巴因干預(yù)前， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;哇巴因干預(yù)前后耐藥組P-gp水平均顯著高于對(duì)照組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 哇巴因可有效下調(diào)肝癌細(xì)胞株P(guān)-gp的表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】 哇巴因;肝癌細(xì)胞株;P-糖蛋白

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.24.107

Effect of ouabain on the expression of P-gp in hepatocellular carcinoma cell line? ?YANG Ming-zhen， ZHAO Kui. Department of Invasive Technology， Affiliated Hospital of Zunyi Medical College， Zunyi 563003， China

【Abstract】 Objective? ?To study the effect of ouabain on the expression of P-glycoprotein （P-gp） in hepatocellular carcinoma cell line. Methods? ?The Bel-7402/ADM model of human hepatocellular carcinoma cell line Bel-7402 was established by high-dose intermittent impulse method with adriamycin （ADM） as drug-resistant group and normal Bel-7402 as control group. The expression of P-gp was detected by Western blotting （WB） before and after ouabain intervention in the two groups. Results? ?Before intervention of ouabain， drug-resistant group had P-gp expression level as （72.68±0.07）， which was （22.21±0.04） in the control group. After intervention of ouabain， drug-resistant group had P-gp expression level as （20.61±0.04）， which was （14.32±0.05） in the control group. After intervention of ouabain， both groups had significantly lower P-gp expression level than those before intervetion of ouabain， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Before and after intervention of ouabain， drug-resistant group had significantly higher P-gp expression level than the control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion? ?Ouabain can effectively down-regulate the expression of P-gp in hepatocellular carcinoma cell line.

【Key words】 Ouabain; Hepatocellular carcinoma cell line; P-glycoprotein

肝癌（liver? cancer）是指發(fā)生于肝臟或從肝臟開(kāi)始的惡性腫瘤， 使機(jī)體基因轉(zhuǎn)錄異常， 細(xì)胞失去正常增殖、分化、凋亡能力[1]。肝癌發(fā)病隱蔽， 初期無(wú)明顯癥狀， 病情進(jìn)展迅速， 臨床癥狀多表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、納差、消瘦、消化道癥狀及最常見(jiàn)的肝區(qū)疼痛， 多因癌細(xì)胞迅速生長(zhǎng)致肝包膜緊繃導(dǎo)致， 疼痛可輻射至右肩[2]。體征常見(jiàn)肝脾腫大、腹水黃疸等。肝癌確診時(shí)患者往往已到晚期或已發(fā)生轉(zhuǎn)移， 大多數(shù)患者無(wú)法通過(guò)手術(shù)根治， 預(yù)后差， 復(fù)發(fā)率高?；熓悄壳白钪饕委熓侄蝃3]， 長(zhǎng)時(shí)間使用化療藥物易導(dǎo)致腫瘤多藥耐藥性（multidrug resistance， MDR）[4]， 影響藥物吸收， 制約療效， 危害患者身心健康。研究表明， P-糖蛋白（P-glycoprotein， P-gp）是MDR基因編碼的一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白， 參與機(jī)體解毒及代謝， 可將細(xì)胞內(nèi)毒性代謝產(chǎn)物外排出細(xì)胞， 保護(hù)細(xì)胞受損。臨床上對(duì)哇巴因干預(yù)下P-gp表達(dá)影響研究較少， 因此本文旨在探討哇巴因?qū)Ω伟┘?xì)胞株P(guān)-gp表達(dá)的影響， 期望為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)， 現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1. 1 主要藥物及試劑 人肝癌Bel-7402細(xì)胞株（上海冠導(dǎo)生物工程有限公司）;ADM（湘潭嘉葉源生物科技有限公司）;胎牛血清（FBS）（北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司）;細(xì)胞裂解液（北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司）;聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）（上海邦景實(shí)業(yè)有限公司）;預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白 （上海谷研實(shí)業(yè)有限公司）。

1. 2 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽浼胺纸M 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人肝癌Bel-7402細(xì)胞， 0.25%胰酶消化， 1000 r/min離心3 min后收集細(xì)胞。在37℃、5% CO2、0.1 μmol/L濃度ADM條件下染毒1 h后，?0.25%胰酶消化， 1000 r/min離心3 min收集細(xì)胞， 在不加ADM培養(yǎng)瓶中繼續(xù)接種培養(yǎng)。重復(fù)以上步驟， 逐漸提高ADM藥物濃度至1 μmol/L濃度， 細(xì)胞仍能穩(wěn)定良好生長(zhǎng)即肝癌耐藥Bel-7402/ADM造模成功。將正常Bel-7402設(shè)為對(duì)照組， Bel-7402/ADM設(shè)為耐藥組。

1. 3 觀察指標(biāo) 采用免疫印跡（Western Blot， WB）檢測(cè)P-gp表達(dá)水平， 取正常人肝癌Bel-7402及Bel-7402/ADM細(xì)胞， FBS清洗3次， 加入細(xì)胞裂解液， 離心15 min， 取上清液加入蛋白樣緩沖液混勻， 置入100℃沸水變性5 min后-20℃保存?zhèn)溆?。將凝膠置于電泳槽， 加甘氨酸電泳緩沖液， 取總蛋白上樣， 80 V電泳， 內(nèi)參照為β-actin， 藍(lán)色蛋白樣緩沖液與上下分離線>3 cm時(shí)停止電泳， 取出凝膠去除膜與凝膠氣泡， 兩側(cè)放上濾紙， 置入轉(zhuǎn)膜液槽， 80 V電壓4℃過(guò)夜。BTBS洗膜3次， 加入二抗溫育1 h， TBS洗膜3次， 加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）在Bio-RAD上成像并分析密度。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

哇巴因干預(yù)前， 耐藥組P-gp表達(dá)水平為（72.68±0.07）， 對(duì)照組為（22.21±0.04）;哇巴因干預(yù)后， 耐藥組P-gp表達(dá)水平為（20.61±0.04）， 對(duì)照組為（14.32±0.05）;哇巴因干預(yù)后， 兩組P-gp水平均顯著低于哇巴因干預(yù)前， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;哇巴因干預(yù)前后耐藥組P-gp水平均顯著高于對(duì)照組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。耐藥組P-gp表達(dá)凝膠蛋白電泳圖見(jiàn)圖1。

3 討論

我國(guó)作為肝癌大國(guó)[5]， 每年新發(fā)肝癌病例約占全球的50%， 且發(fā)病率逐年增長(zhǎng)。肝癌起病隱匿， 初期多在肝病隨訪或體檢中偶然發(fā)現(xiàn)， 患者無(wú)癥狀， 體格檢查也缺乏腫瘤指征， 出現(xiàn)癥狀就醫(yī)時(shí)多進(jìn)入中晚期， 大部分失去根治性手術(shù)機(jī)會(huì)， 而化療是此階段患者最有效治療方式， 但肝癌在腫瘤死亡率中僅次于肺癌居于第二位， 最主要是因部分患者化療無(wú)效或有效逐漸轉(zhuǎn)為無(wú)效現(xiàn)象產(chǎn)生， 出現(xiàn)對(duì)未接觸過(guò)、多種化學(xué)結(jié)果和作用機(jī)理不同的化療藥物交叉耐藥， 即MDR。MDR[6]嚴(yán)重影響腫瘤治療效果， 是肝癌化療失敗的主要原因， 嚴(yán)重威脅患者生命安全， 最先發(fā)現(xiàn)其和細(xì)胞膜糖蛋白增加有關(guān)， MDR由多種因素介導(dǎo)， 包括化療藥物造成損傷， 其中一些酶發(fā)揮作用， 使細(xì)胞自我修復(fù)能力增強(qiáng)， 導(dǎo)致細(xì)胞耐藥（如蛋白激酶C）;腫瘤細(xì)胞凋亡基因難以正常介導(dǎo)細(xì)胞凋亡導(dǎo)致耐藥機(jī)制（如CD95/CD95L）;微環(huán)境改變導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性降低;某些信號(hào)傳導(dǎo)因子改變[如細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族（NF-κB）]及其中最主要的P-gp介導(dǎo)化療藥物外排。mdr-1基因位于染色體7q21-21， 經(jīng)糖基化后形成170KD的P-gp， 屬于一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白， 由跨膜疏水區(qū)和ATP結(jié)合親水區(qū)構(gòu)成， 主要定位在細(xì)胞膜上。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)肝癌MDR已有較多文獻(xiàn)報(bào)道， 但對(duì)哇巴因藥物下肝癌細(xì)胞株的P-gp表達(dá)的影響研究較少。P-gp[7]廣泛分布全身多個(gè)器官及組織中， 參與藥物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)， 腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)期接觸化療藥物， mdr-1基因被誘導(dǎo)大量表達(dá)P-gp， 此時(shí)P-gp結(jié)合藥物分子并利用ATP水解能量將疏水親脂性化療藥物在尚未發(fā)揮細(xì)胞毒性時(shí)排除細(xì)胞外， 降低藥物濃度， 細(xì)胞由此獲得耐藥性， P-gp發(fā)揮外排作用依賴ATP水解釋放能量， P-gp包含2個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)， P-gp識(shí)別并結(jié)合藥物， 其中1個(gè)ATP激活水解釋放能量， P-gp結(jié)構(gòu)改變釋放底物至細(xì)胞外， 隨后第2個(gè)ATP水解P-gp恢復(fù)原狀態(tài)， 其影響P-gp與藥物結(jié)合、外排、強(qiáng)度及P-gp結(jié)構(gòu)恢復(fù)。針對(duì)P-gp介導(dǎo)的腫瘤MDR， 可通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度在mdr-1基因轉(zhuǎn)錄翻譯上抑制P-gp合成及活性， 影響膜功能降低P-gp外排作用， 提高藥物濃度， 解決腫瘤細(xì)胞耐藥性。P-gp外排作為ATP能量依賴泵， 也可以從降低外排所需能量入手。有研究發(fā)現(xiàn)低濃度哇巴因能抑制腫瘤生長(zhǎng)[8， 9]， 作為細(xì)胞膜上鈉鉀泵（Na+-K+-ATP ase）抑制劑， 可通過(guò)Na+-K+-ATP酶α亞基特異性可逆結(jié)合抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)， 降低細(xì)胞黏附性， 促進(jìn)鈉鉀泵內(nèi)吞加快酶的溶解， 減少細(xì)胞內(nèi)鈉鉀泵含量， 抑制鈉鉀泵功能， 導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP分解減少， 降低P-gp將藥物排除體外能力， K+濃度下降或哇巴因可抑制鈉鉀ATP酶50%以上導(dǎo)致Na+濃度上升， 引起細(xì)胞膜超極化， 激活Na+/Ca2+

對(duì)向轉(zhuǎn)運(yùn)體， Ca2+濃度上升， 影響mdr-1基因轉(zhuǎn)錄翻譯P-gp。本研究以非耐藥人肝癌Bel-7402細(xì)胞系為親代細(xì)胞， 采用ADM誘變產(chǎn)生Bel-7402/ADM模型， 以WB測(cè)定哇巴因干預(yù)前后P-gp表達(dá)， 利用抗原抗體特異反應(yīng)， 有效排除其他蛋白質(zhì)干擾。本文研究結(jié)果顯示， 哇巴因干預(yù)前， 耐藥組P-gp表達(dá)水平為（72.68±0.07）， 對(duì)照組為（22.21±0.04）;哇巴因干預(yù)后， 耐藥組P-gp表達(dá)水平為（20.61±0.04）， 對(duì)照組為（14.32±0.05）;哇巴因干預(yù)后， 兩組P-gp水平均顯著低于哇巴因干預(yù)前， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;哇巴因干預(yù)前后耐藥組P-gp水平均顯著高于對(duì)照組， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。由此說(shuō)明腫瘤細(xì)胞耐藥時(shí)P-gp呈高表達(dá)狀態(tài)， 哇巴因可有效降低P-gp表達(dá)， 耐藥組干預(yù)后可恢復(fù)至對(duì)照組未受干預(yù)狀態(tài)， 增加腫瘤細(xì)胞對(duì)ADM敏感性， 實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)耐藥作用。

綜上所述， 哇巴因可有效下調(diào)肝癌細(xì)胞株的P-gp表達(dá)。

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