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一株乳酸片球菌的篩選、鑒定及其固態(tài)發(fā)酵飼料原料的產(chǎn)酸分析

2019-09-26 02:31李慧芬王文博
中國飼料 2019年17期
關(guān)鍵詞:產(chǎn)酸玉米粉飼料原料

李慧芬, 王文博, 馬 成

(1.青島根源生物技術(shù)集團有限公司技術(shù)支持中心,山東青島266111;2.青島根源生物技術(shù)集團有限公司固體發(fā)酵實驗室,山東青島 266736)

乳酸菌被廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵、制造及醫(yī)療保健領(lǐng)域,其不僅具有良好的抑菌防腐功能,還具有改善食品風味、增強食品營養(yǎng)的作用(Reis,2012;Schnurer,2005)。 乳酸菌包括乳球菌(Lactococcus)、明串珠菌(Lactobacillus)、片球菌(Pediococcus)、 乳桿菌 (Leuconostoc) 和肉食桿菌(Carnobacterium)等屬(凌代文等,1999)。

乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)屬于硬壁菌門 (Firmicutes)桿菌綱 (Bacilli)乳桿菌目(Lactobacillales)氣球菌科(Aerococcaceae)片球菌屬(Pediococcus),其主要依賴碳水化合物作為碳源進行生長,可能以糖酵解途徑產(chǎn)生D-乳酸或L-乳酸 (Nieto等,2006)。 乳酸片球菌能發(fā)酵產(chǎn)生有機酸、細菌素、環(huán)二肽、短鏈脂肪酸等多種抑菌物質(zhì)(Wang,等,2014)。 目前,有關(guān)乳酸片球菌的研究多涉及細菌素的分離純化及抑菌效果,關(guān)于其固態(tài)發(fā)酵飼料原料產(chǎn)酸的研究較少。因此,本研究從豬的新鮮糞便中分離純化出一株具有較強產(chǎn)酸效果的乳酸菌,經(jīng)形態(tài)、生理生化與分子鑒定,確定為乳酸片球菌,并對其發(fā)酵不同飼料原料的產(chǎn)酸效果進行分析,以期為該菌在固態(tài)發(fā)酵飼料原料中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 固態(tài)發(fā)酵原料 豆粕采用渤海46蛋白豆粕;麩皮采用二級小麥麩;玉米粉采用一級玉米粉;稻殼粉采用40目精致稻殼粉。固態(tài)發(fā)酵原料均來自根源生物技術(shù)集團固體發(fā)酵實驗室。

1.1.2 MRS培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)基:葡萄糖2%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、乙酸鈉0.5%、檸檬酸三銨0.2%、K2HPO4·7H2O 0.2%、吐溫 80 0.1% 、MgSO4·7H2O 0.058%、MnSO4·H2O 0.025% 、pH 6.2;固體培養(yǎng)基:在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上另加0.5%CaCO3、2%瓊脂粉。

1.1.3 菌株的分離純化 選取山東中慧昌樂豬場杜洛克豬新鮮糞便6份,各取1 g溶于100 mL無菌生理鹽水中,取1 mL與9 mL無菌生理鹽水混合,稀釋10倍,依次在含9 mL無菌生理鹽水的試管中梯度稀釋到10-8稀釋度。選取 10-5~10-8稀釋度的菌液,從中吸取1 mL到無菌培養(yǎng)皿中,傾注至滅菌后冷卻到45℃的MRS固體培養(yǎng)基,37℃恒溫培養(yǎng)72 h,鏡檢排除產(chǎn)芽孢的菌,挑取透明圈較大的菌。乳酸菌的菌落很小,大約1~3 mm,圓形隆起,表面光滑,呈乳白色、灰白色或暗黃色,且菌落周圍有透明的碳酸鈣溶解圈。在含有MRS固體培養(yǎng)基的平板上,將篩選出的菌株進行劃線純化三次,確保菌落純度。

1.1.4 乳酸菌的液體培養(yǎng) 接種每株菌的單菌落到MRS液體培養(yǎng)基中,50 mL磨砂口錐形瓶內(nèi)裝液量為30 mL,37℃靜置培養(yǎng)24 h。

1.2 菌株固態(tài)發(fā)酵豆粕與產(chǎn)酸優(yōu)勢菌篩選 按1%接種比例,1:0.5的料水比,接種乳酸菌液到1000 g豆粕中,37℃恒溫培養(yǎng)48 h。

1.3 產(chǎn)酸優(yōu)勢菌形態(tài)、生理生化與分子鑒定

1.3.1 產(chǎn)酸優(yōu)勢菌的形態(tài)與生理生化鑒定 參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》,對產(chǎn)酸優(yōu)勢菌的菌落菌體特征、生理生化特性等進行測定。

1.3.2 產(chǎn)酸優(yōu)勢菌的16SrDNA序列分析 應(yīng)用普通細菌基因組DNA提取試劑盒,提取產(chǎn)酸優(yōu)勢菌的DNA,并以其為模板,采用細菌通用引物27 F和 1492 R,進行16SrDNA PCR擴增 (王延華等,2005)。擴增條件:94℃預變性5 min,隨后循環(huán)擴增35循環(huán) (94℃變性30 s,54℃退火30 s,72℃延伸60 s),最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送青島睿博興科公司測序。將獲得的16SrDNA的序列在NCBI官網(wǎng)上進行Blast比對,獲得代表性模式序列,應(yīng)用MEGA 4.0軟件按照UPGMA法進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建(Tamura等,2007)。

1.4 產(chǎn)酸優(yōu)勢菌固態(tài)發(fā)酵飼料原料的產(chǎn)酸分析

1.4.1 產(chǎn)酸優(yōu)勢菌固態(tài)發(fā)酵飼料原料的條件 按1%接種比例,1:0.5的料水比,接種乳酸菌液到1000 g豆粕、麩皮、玉米粉或稻殼粉中,37℃恒溫培養(yǎng)48 h。

1.4.2 產(chǎn)酸優(yōu)勢菌固態(tài)發(fā)酵料的指標測定 pH指標:取10 g發(fā)酵料,加50 mL純凈水,混合均勻后靜置10 min,用PHS-3C型pH計(上海精科)測定發(fā)酵料pH指標。

L-乳酸指標:采用HPLC方法測定,取1 g樣品加100 mL純凈水磁力攪拌1 h,取2 mL液體12000 r/min離心10 min,取上清液用0.22μm濾膜過濾。高效液相條件:流動相(50 mM磷酸二氫鉀:乙腈=90:10);流速:1.25 mL/min;C18 柱,紫外檢測器,波長 210 nm;柱溫箱:40℃;進樣量:20μL(Jannicke等,2006)。

揮發(fā)性脂肪酸(VFA)指標:采用 SP-2100A氣相色譜儀 (北分瑞利 ),毛細管柱型號 KBFFAP 30 m×0.32 mm×0.25μm,柱溫 130℃,汽化溫度 180℃,應(yīng)用氫離子火焰檢測器,檢測溫度180℃,載氣為高純氮氣,通過內(nèi)標法(巴豆酸)定量各組分(秦為琳等,1982)。

發(fā)酵0 h與48 h,分別測定發(fā)酵料的pH、L-乳酸與VFA指標,每組3個重復。

1.5 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel初步處理后,利用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行方差分析,如果方差分析結(jié)果差異顯著,則采用LSD法進行多重比較,以P<0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 固態(tài)發(fā)酵豆粕的產(chǎn)酸優(yōu)勢菌篩選 從6個糞便樣品中共獲得20株乳酸菌,固體發(fā)酵豆粕48 h時的pH如圖1,其中14號菌株的pH最低,為4.86,與其他組的固態(tài)發(fā)酵豆粕產(chǎn)酸效果差異顯著(P<0.05),命名該菌株為HF 14。

圖1 不同菌株發(fā)酵豆粕48 h的p H

2.2 HF 14的形態(tài)、生理生化與分子鑒定

2.2.1 HF 14的形態(tài)與生理生化鑒定結(jié)果 產(chǎn)酸優(yōu)勢菌HF 14為革蘭氏陽性菌,菌體呈乳白色,與碳酸鈣形成的透明圈約6~9 mm,有較強的產(chǎn)酸能力。生理生化特性顯示該菌不運動,不形成芽孢,菌體為球型,不成鏈狀。該菌兼性厭氧,主要發(fā)酵單糖與雙糖,葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,主要產(chǎn)物是乳酸鹽。接觸酶為陰性,氧化酶也為陰性。不還原硝酸鹽,主要生長溫度為35~40℃,50℃也能生長,在6.5%NaCl、pH 4.5條件下也能生長。具體的生理生化特性見表1。

表1 產(chǎn)酸優(yōu)勢菌HF 14的生理生化特征

2.2.2 HF 14的16SrRNA序列分析 產(chǎn)酸優(yōu)勢菌在通用引物27 F和1492 R的擴增下,得到1456 bp序列,并與GenBank數(shù)據(jù)庫中的模式菌比對 ,該菌株的16S序列與Pediococcus acidilactici strain GL16的16S序列99%相似,MEGA系統(tǒng)進化樹上也與該類菌親緣關(guān)系最近,如圖2。綜合菌株HF 14的形態(tài)、生理生化、16SrDNA序列分析,初步鑒定該菌株 HF 14為乳酸片球菌。

2.3 HF 14發(fā)酵不同原料的產(chǎn)酸類別分析 由表2可知,四種飼料原料經(jīng)乳酸片球菌HF 14發(fā)酵后,pH均顯著下降(P<0.05),尤其是麩皮,發(fā)酵后pH降幅達2.18。稻殼粉的起始pH較低,降幅也最低,僅1.27,但與發(fā)酵前相比,發(fā)酵后pH也顯著下降(P<0.05)。

圖2 產(chǎn)酸優(yōu)勢菌HF 14的16S rDNA系統(tǒng)進化樹

四種飼料原料經(jīng)乳酸片球菌HF 14發(fā)酵后,L-乳酸含量均顯著增加(P<0.05),尤其是玉米粉,發(fā)酵后L-乳酸增幅達21.5。稻殼粉發(fā)酵前L-乳酸含量最低,發(fā)酵后比發(fā)酵前顯著增加 (P<0.05),但與其他原料相比,增幅最低,為5.31。

VFA是厭氧發(fā)酵過程中經(jīng)水解階段產(chǎn)生的乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸等揮發(fā)性脂肪酸的總和,但是在厭氧發(fā)酵中最主要的是乙酸,其次是丙酸與丁酸,其他的含量非常少,可忽略不計(Yuan等,2011)。本試驗中,稻殼粉組發(fā)酵后乙酸含量顯著增加(P<0.05),增幅達5.73,顯著高于其他飼料原料組,丙酸與丁酸含量無顯著變化(P>0.05),說明稻殼粉經(jīng)乳酸片球菌HF 14發(fā)酵后產(chǎn)生的VFA以乙酸為主。豆粕、麩皮、玉米粉三種飼料原料經(jīng)HF 14發(fā)酵后產(chǎn)生的VFA也是以乙酸為主,其次是丙酸,最后是丁酸,與發(fā)酵前相比,都有顯著增加(P<0.05)。三種飼料原料中,豆粕的初始乙酸含量較高,發(fā)酵后麩皮與玉米粉的乙酸含量增加較大;丙酸的初始含量無顯著差異(P>0.05),發(fā)酵后玉米粉的增幅最大;麩皮的初始丁酸含量較高,發(fā)酵后增幅也最大,其次是玉米粉。

表2 產(chǎn)酸優(yōu)勢菌HF 14發(fā)酵不同飼料原料的產(chǎn)酸類別分析

3 討論

pH作為一個重要的環(huán)境因素,不僅能夠影響微生物酶的活性,也能影響發(fā)酵產(chǎn)物的組成(Zhang,2009;Chen,2007;Horiuchi,2002)。稻殼粉發(fā)酵前pH為5.72,顯著低于其他飼料原料(P<0.05),發(fā)酵后產(chǎn)酸的VFA中乙酸占97.6%,在數(shù)值上甚至超過了L-乳酸(張玉靜等,2013)。而乳酸可以被氧化為丙酮酸,進而脫羧轉(zhuǎn)變?yōu)橐胰?,再被氧化成為乙酸,推測稻殼粉經(jīng)乳酸片球菌HF 14固態(tài)發(fā)酵過程中,最初產(chǎn)生的乳酸,部分發(fā)生了一系列生化反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜?。豆粕、麩皮、玉米粉這三種飼料原料經(jīng)乳酸片球菌HF 14發(fā)酵后產(chǎn)生的有機酸中,L-乳酸含量在數(shù)值上占較大優(yōu)勢。乳酸能維持動物腸道菌群平衡,減少腹瀉,促進鈣質(zhì)的吸收。動物體內(nèi)含有L-乳酸脫氫酶,只能分解自身產(chǎn)生或攝入的L-型乳酸 (Abdel等,2011)。 因此,高光學純度的L-型乳酸更受市場青睞。乙酸是厭氧發(fā)酵過程中重要的中間代謝產(chǎn)物,是很好的抗微生物劑、酸度調(diào)節(jié)劑和酸味劑,但是有較為刺激的氣味。不同原料發(fā)酵時乙酸也是重要的有機酸,如在畜禽糞便厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中乙酸占 VFA 的 40%以上(NI,2011;Wu,2010),而秸稈厭氧發(fā)酵時,乙酸可以占到46%以上(Zhao等,2014)。丙酸是飼料、醫(yī)藥、食品工業(yè)等領(lǐng)域的重要原料,具有很好的防真菌和霉菌的作用,效果優(yōu)于苯甲酸,是極佳的食品防腐劑 (徐親民等,1997)。本試驗中,乳酸片球菌HF 14發(fā)酵玉米粉的丙酸含量最高。丁酸是腸膜細胞的主要能量來源,還可促進腸黏膜修復及其功能恢復,并且能抑制炎癥細胞因子的形成,從而起到抗炎癥作用(胡仁偉,2003;Augeulieht,2002)。 然而,本試驗中各組的丁酸含量都不高,最高的發(fā)酵麩皮僅0.72 mg/g。丁酸的生產(chǎn)需丁酸梭菌等特定菌的引入,且對代謝條件進行誘導干預。

同一株乳酸片球菌,采用同樣的固態(tài)發(fā)酵工藝發(fā)酵不同的飼料原料,產(chǎn)生的有機酸以L-乳酸與乙酸為主,且不同的飼料原料發(fā)酵后有機酸的類別有一些差異。其中發(fā)酵玉米粉的pH最低,L-乳酸與丙酸含量最高;發(fā)酵麩皮的pH降幅最大,丁酸含量最高;發(fā)酵稻殼粉的乙酸含量最高,L-乳酸含量最低;發(fā)酵豆粕的各個指標居中。

4 結(jié)論

研究篩選到1株固態(tài)發(fā)酵豆粕產(chǎn)酸效果較強的菌,經(jīng)鑒定為乳酸片球菌。對乳酸片球菌HF 14固態(tài)發(fā)酵豆粕、麩皮、玉米粉與稻殼粉的產(chǎn)酸類別進行分析發(fā)現(xiàn),產(chǎn)生的有機酸以L-乳酸與乙酸為主,其中,發(fā)酵玉米粉的pH最低,為3.77,L-乳酸與丙酸含量最高,分別為21.91、1.03 mg/g;發(fā)酵麩皮的pH降幅最大,丁酸含量最高,為0.72 mg/g;發(fā)酵稻殼粉的乙酸含量最高,為6.15 mg/g,L-乳酸含量最低;發(fā)酵豆粕的各個指標居中。

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