趙 楊， 要 燦， 郭曉軍*， 趙蕊蕊,2， 張舒月， 毛思宇

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071000；2.河北眾邦生物技術(shù)有限公司，河北保定 071000）

在我國，玉米是重要的糧食和飼料作物之一，玉米粒的65%被用于飼料工業(yè)。隨著畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，玉米籽粒＋秸稈黃貯飼料的飼喂方式無法再提高肉、奶等畜產(chǎn)品質(zhì)量（田吉鵬等，2017）。近幾年，國家提出了“糧改飼”政策，提倡青貯全株玉米發(fā)展畜牧業(yè)。然而霉菌毒素的污染成為影響全株青貯發(fā)展的重要因素之一。青貯飼料中主要的霉菌毒素包括黃曲霉毒素 （AFB1）（Alonso等，2009）、伏馬菌素（FBS）（Kim 等，2004）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 （DON）（Van，2011） 和膠霉毒素（Keller，2012）等。其中黃曲霉毒素具有高毒性和致癌性，經(jīng)過食物的直接攝入或進(jìn)食黃曲霉毒素污染飼料的動(dòng)物導(dǎo)致的間接攝入都會造成對人體的毒害作用。動(dòng)物試驗(yàn)證明，黃曲霉毒素會嚴(yán)重影響動(dòng)物生長發(fā)育（Dersjant等，2003）。急、慢性黃曲霉毒素中毒導(dǎo)致肉/蛋產(chǎn)量下降、免疫抑制和肝臟中毒（Khan等，2010）。人類黃曲霉毒素中毒根據(jù)接觸水平產(chǎn)生不同的危害，高劑量會導(dǎo)致快速死亡，慢性中毒則引發(fā)肝細(xì)胞癌等（羅自生等，2013）。

本研究前期工作篩選到1株枯草芽孢桿菌N-1a（張舒月等，2018），該菌株既可以拮抗黃曲霉的生長，又可以降解黃曲霉毒素。本試驗(yàn)旨在研究黃曲霉毒素降解菌N-1a的降解特性及在全株玉米青貯中的應(yīng)用效果，以期為菌株N-1a降解黃曲霉毒素的機(jī)制提供理論依據(jù)，并為新型青貯劑的研制提供新的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）N-1a，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基：酵母膏 0.1%，葡萄糖 0.6%， 蛋白胨 0.1%，CaCO30.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 7.2～7.4，經(jīng)121°C高溫濕熱滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米面 3.5%，蛋白胨 1.5%，Ca-Cl2·H2O 0.01%，MnSO40.1%，pH 6.0， 經(jīng) 121 °C高溫濕熱滅菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株N-1a降解黃曲霉毒素活性物質(zhì)的研究 參照雷元培等（2011）的方法，制備N-1a菌株發(fā)酵液、發(fā)酵上清液、胞內(nèi)提取液、發(fā)酵上清液+蛋白酶K（37℃處理1 h）、發(fā)酵上清液+蛋白酶K+1.0%SDS（37℃處理6 h）、上清液沸水浴10 min。測定不同處理組對黃曲霉毒素的降解率，用于確定活性物質(zhì)的性質(zhì)。黃曲霉毒素的測定參照張舒月等（2018）的方法。

1.2.2 菌株N-1a在不同pH下對黃曲霉毒素的降解率 取等量N-1a菌株發(fā)酵上清液于6支試管中，添加黃曲霉毒素使其終濃度為1000μg/kg，然后分別調(diào) pH 為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。 在180 r/min、37℃搖床處理72 h后測定黃曲霉毒素殘留量，以確定菌株N-1a在不同pH下對黃曲霉毒素的降解率。

1.2.3 菌株N-1a在不同溫度下對黃曲霉毒素的降解率 取等量N-1a菌株發(fā)酵上清液于4支試管中，添加黃曲霉毒素使其終濃度為1000μg/mL，然后分別調(diào)溫度為17、27、37、47℃。 在180 r/min搖床處理72 h后測定黃曲霉毒素殘留量，以確定N-1a菌株在不同溫度下對黃曲霉毒素的降解率。

1.2.4 功能菌株菌劑的制備 采用鄭婧萱等（2018）優(yōu)化的培養(yǎng)基在河北眾邦生物技術(shù)有限公司進(jìn)行中試生產(chǎn)，制備功能菌株的發(fā)酵液。

1.2.5 全株玉米青貯試驗(yàn) 將實(shí)驗(yàn)室搖瓶培養(yǎng)的黃曲霉均勻的混到揉絲的全株玉米中，然后等分為3份進(jìn)行不同的處理，每個(gè)處理設(shè)三個(gè)平行。

處理1：直接裝到5 kg的小白桶中，壓實(shí)密封發(fā)酵。

處理2：按照109cfu/kg的接種量接種N-1a的發(fā)酵液，然后裝到5 kg的小白桶中，壓實(shí)密封發(fā)酵。

處理3：按照109cfu/kg的接種量接種市售的青貯菌劑（河南某公司，有效活性菌為植物乳桿菌和布氏乳桿菌），然后裝到5 kg的小白桶中，壓實(shí)密封發(fā)酵。

室溫發(fā)酵45 d，發(fā)酵結(jié)束后近紅外技術(shù)測定全株玉米青貯的指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株N-1a對黃曲霉毒素的降解特性研究

2.1.1 菌株N-1a降解黃曲霉毒素活性物質(zhì)分析由圖1可知，菌株N-1a的發(fā)酵液與發(fā)酵上清液對黃曲霉毒素的降解率分別為94.50%和85.71%，分別比胞內(nèi)提取液的降解率高73.83%和65.04%，可以得出菌株N-1a對黃曲霉毒素的降解主要是通過分泌的胞外活性物質(zhì)進(jìn)行降解的，而非菌體吸附。而發(fā)酵上清液經(jīng)蛋白酶K、蛋白酶K+1%SDS、加熱等不同處理后，降解率分別比等體積的發(fā)酵上清液低55.51%、60.41%和75.51%，可以初步推測得出菌株N-1a降解黃曲霉毒素的活性物質(zhì)為蛋白質(zhì)類物質(zhì)。

圖1 菌株N-1a在不同處理下對黃曲霉毒素的降解率

2.1.2 不同pH下的降解率 由圖2可知，菌株N-1a的發(fā)酵上清液隨著pH的變化降解率也隨之改變，在pH為7.0時(shí)其降解率為82.5%，降解率最高，而pH為9.0時(shí)降解率為33.63%，發(fā)酵上清液在pH為4.0時(shí)降解率為41.88%，由于該菌株可以在pH 4.0時(shí)很好的生長，所以該菌株可以在青貯pH較低的條件下發(fā)揮降解黃曲霉毒素的作用。

圖2 菌株N-1a的發(fā)酵上清液在不同pH下對黃曲霉毒素的降解率

2.1.3 不同溫度下的降解率 菌株N-1a的發(fā)酵上清液在不同溫度下對黃曲霉毒素的降解率見圖3。不同溫度對菌株N-1a黃曲霉毒素的降解率影響不大。在37℃時(shí)最高，17℃和47℃的降解率都有所下降，但降解率與37℃時(shí)相差不大，可見該菌株滿足北方低溫條件和南方高溫條件下的青貯去毒。

圖3 菌株N-1a的發(fā)酵上清液在不同溫度下對黃曲霉毒素的降解率

2.2 菌株N-1a在全株玉米青貯中的應(yīng)用效果由表1可知，三個(gè)處理組之間的黃曲霉毒素含量均有顯著差異，添加N-1a組的黃曲霉毒素殘留量顯著低于另外兩個(gè)試驗(yàn)組。除此之外，添加N-1a組的NDF和ADF含量顯著低于另外兩個(gè)組，其中NDF比處理組1和處理組3分別低10.11%和7.98%；ADF比處理組1和處理組3分別低3.35%和2.72%。乳酸、乙酸的含量均顯著高于另外兩個(gè)組，其中乳酸比處理組1和處理組3分別高4.40%和1.66%；乙酸比處理組1和處理組3分別高1.32%和1.04%。說明菌株N-1a在降解霉菌毒素的同時(shí)也具有提高青貯飼料營養(yǎng)價(jià)值和適口性的作用。

表1 青貯玉米秸稈各項(xiàng)指標(biāo)

3 討論

青貯玉米中的黃曲霉毒素大多是在田間及貯藏過程中附著在玉米上的黃曲霉或寄生曲霉代謝產(chǎn)生的，正是由于黃曲霉毒素的毒性強(qiáng)、污染范圍廣，使得黃曲霉毒素成為了食物中危害最大的污染物（張盼等，2015）。由于具有不可避免和不可預(yù)測的特性，使其成為全株玉米青貯中一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。在黃曲霉毒素降解方面，目前應(yīng)用的主要有乳酸菌、釀酒酵母、米曲霉等（朱新貴等，2001）。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌N-1a對黃曲霉毒素降解的活性組分是發(fā)酵上清液中的蛋白質(zhì)類組分，可以斷定黃曲霉毒素是被N-1a產(chǎn)生的代謝酶降解掉的，而不是簡單的菌體吸附，這一點(diǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于目前的市售產(chǎn)品。市售吸附毒素的菌劑在吸附毒素的同時(shí)會吸附一些營養(yǎng)成分，也不能徹底去除黃曲霉毒素的毒性，這使得青貯玉米的應(yīng)用仍然受到很大的影響 （計(jì)成等，2010）。發(fā)酵上清液的降解活性受溫度的影響不大，在不同溫度下的降解率差異不顯著。Smiley等（2000）研究的橙色黃桿菌蛋白質(zhì)的粗提取物對黃曲霉毒素的降解率可達(dá)74.5%，但使用加熱失活后的蛋白質(zhì)對毒素的降解率僅為5.5%。而菌株N-1a在pH 4.0的時(shí)候仍具有40%以上的降解率，這些特性可以滿足菌株N-1a在不同地域的青貯過程中發(fā)揮降解黃曲霉毒素的作用。本試驗(yàn)還進(jìn)行了全株玉米的青貯試驗(yàn)，并對其發(fā)酵45 d后的秸稈進(jìn)行毒素和營養(yǎng)物質(zhì)的檢測。結(jié)果表明，添加N-1a組的黃曲霉毒素顯著低于未加菌劑的處理組1和添加市售菌劑的處理組3；從營養(yǎng)物質(zhì)的檢測結(jié)果中可以看出，在降解毒素的過程中并沒有使秸稈中的營養(yǎng)成分流失，乳酸、乙酸的含量顯著高于另外兩個(gè)組，其中乳酸比處理組1和處理組3分別高4.40%和1.66%；乙酸比處理組1和處理組3分別高1.32%和1.04%。Van（1963)提出了用中性洗滌纖維（NDF)和酸性洗滌纖維（ADF)作為評定飼草中纖維類物質(zhì)的指標(biāo)。用ADF可以預(yù)測粗飼料的能量含量，NDF等常規(guī)營養(yǎng)可推測出干物質(zhì)采食量。在開桶過程中添加N-1a組NDF和ADF的含量低于另外兩個(gè)組，其中NDF比處理組1和處理組3分別低10.11%和7.98%；ADF比處理組1和處理組3分別低3.35%和2.72%。說明菌株N-1a在降解黃曲霉毒素的同時(shí)也具有提高青貯飼料營養(yǎng)價(jià)值和適口性的作用，能夠使動(dòng)物更有效的利用秸稈的營養(yǎng)物質(zhì)。比較常見的降解黃曲霉毒素的乳酸菌制劑可以提高飼料中乳酸、乙酸的水平，促進(jìn)粗纖維的轉(zhuǎn)化，從而改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)（興麗等，2004；李軍訓(xùn)等，2004)。但是乳酸菌是一類不形成芽孢的細(xì)菌，因此工業(yè)化生產(chǎn)不便保存和運(yùn)輸（吳逸飛等，2013)。而枯草芽孢桿菌是農(nóng)業(yè)農(nóng)村部允許直接添加到動(dòng)物飼料中的有益微生物，生產(chǎn)簡單、價(jià)格低廉，具有極強(qiáng)的抗逆性，能耐熱、紫外線、多種溶劑、酸、堿等（楊立華等，2010）。因此菌株N-1a具有非常大的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

4.1 枯草芽孢桿菌菌株N-1a降解黃曲霉毒素的活性物質(zhì)是該菌分泌的一種胞外蛋白，該蛋白質(zhì)在不同pH和溫度下均有活性，在pH 7.0和溫度37℃時(shí)降解率最高。

4.2 枯草芽孢桿菌菌株N-1a可顯著降低全株玉米青貯的黃曲霉毒素含量，還可顯著降低NDF的含量、提高乳酸的含量。