李丹丹，馬芮，黃敏瑩，趙弘軼，黃勇華

1.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)內(nèi)科，北京市100700；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，山西太原市030001；3.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽合肥市230032；4.南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州市510515

血腦屏障是分子和細(xì)胞進(jìn)出中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)因子[1]，負(fù)責(zé)選擇性透過(guò)血漿各種溶質(zhì)，維持腦穩(wěn)態(tài)等[2-3]，但易受激素、神經(jīng)遞質(zhì)等影響[4]。蛛網(wǎng)膜下腔出血、阿爾茨海默病、創(chuàng)傷性腦病等多種疾病都存在不同程度血腦屏障障礙，并伴有神經(jīng)元細(xì)胞損傷和凋亡增加[5-7]。通常觀察Evens Blue(EB)腦區(qū)滲漏情況評(píng)估血腦屏障變化[8-9]。

睡眠有助于能量與精力恢復(fù)[10-11]。睡眠時(shí)間不足是常見(jiàn)的社會(huì)現(xiàn)象。睡眠時(shí)間減少與心血管病、糖尿病和抑郁等有關(guān)[12-13]，還會(huì)引起代謝紊亂，損害神經(jīng)行為功能[14]。血腦屏障與睡眠之間的關(guān)系開(kāi)始成為神經(jīng)科研究熱點(diǎn)[15]。Pan等[16]認(rèn)為，睡眠可能是調(diào)節(jié)血腦屏障功能的重要因素，列出兩者之間可能存在相互作用的5個(gè)方面。Sharma等[17]也觀察到，睡眠剝奪(sleep deprivation,SD)后，EB染液會(huì)滲漏于多個(gè)腦區(qū)。

本研究針對(duì)SD對(duì)成年雄性大鼠血腦屏障的影響及睡眠剝奪恢復(fù)(sleep deprivation and recovery,SDR)的作用進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠90只，體質(zhì)量260～280 g，清潔級(jí)：斯貝福生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2016-0002。

鼠抗β-tubulin抗體(GB13017-2)、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(GB23301)：谷歌生物科技有限公司?？筃euN抗體(ab177487)、抗Bax抗體(ab32503)、抗Caspase-3 p12抗體(ab179517)：ABCAM公司。CD31(PECAM-1,sc-71873)、 Occludin(H-279,SC-5562)：SANTA CRUZ公司。緊密連接蛋白zonula occludens-1(ZO-1)多克隆抗體(21773-1-AP)：PROTEINTECH公司。兔抗Claudin-5抗體(CLDN5,PB0123)：BOSTER公司。BCL-2多克隆抗體(A11025)、TP53多克隆抗體(A5761)：ABCLONAL公司。HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(M21002)：ABMART公司。Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L,A0423)、Alexa Fluor 555標(biāo)記驢抗小鼠IgG(H+L,A0460)、一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(C1089)：碧云天生物技術(shù)有限公司。

大鼠的飼養(yǎng)、造模、取材等操作均嚴(yán)格遵守動(dòng)物福利與倫理準(zhǔn)則。

1.2 模型建立

大鼠稱重，按體質(zhì)量從輕到重標(biāo)號(hào)；采用SPSS軟件將編號(hào)隨機(jī)分入SD組、SDR組和K組，每組30只。SD組和SDR組大鼠放入水平臺(tái)內(nèi)連續(xù)5 d，期間注意觀察大鼠狀態(tài)，每天更換清潔水，并予充足食物。SDR組之后正常飼養(yǎng)2 d。K組不采取措施。

1.3 取材

造模結(jié)束后，大鼠用10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉。

1.3.1 Western blotting

每組取10只斷頭取腦，迅速分離出大腦皮質(zhì)，-70℃保存。將凍存的大腦皮質(zhì)充分研磨，加入RIPA裂解液，加入PMSF(1∶500)，冰上充分裂解30 min；12 000 r/min 4℃離心15 min，留取上清液，按比例加入變性蛋白上樣緩沖液，混勻，沸水煮8～10 min。加ZO-1(1∶ 500)、 Occludin(1∶ 200)、 Claudin-5(1∶1000)、Bax(1∶1000)、BCL-2(1∶1000)、Caspase-3(1∶1000)、TP53(1∶3000)一抗，內(nèi)參為β-tubulin(1∶2000)；二抗為HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶4000)和山羊抗小鼠 IgG(1∶4000)。BIO-RAD XRS+Software顯影，Image J圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3.2 EB染色

每組取10只，2%EB染液1 ml心臟灌注，10 min后以生理鹽水300 ml和4%多聚甲醛300 ml灌注，留取完整大腦4%多聚甲醛浸泡備用。大腦從前額葉到小腦均勻切成10份，觀察相同切面各腦區(qū)EB染液的滲出情況。

1.3.3 免疫熒光染色

每組取10只，生理鹽水300 ml和4%多聚甲醛300 ml心臟灌注，取出完整大腦，置4%多聚甲醛、20%和30%蔗糖溶液梯度固定，大腦皮質(zhì)冰凍切片，厚10 μm，兩張切片間隔100 μm。免疫熒光染色，一抗為NeuN(1∶300)、CD31(1∶50)，二抗為Alexa Fluor 488 標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶500)和Alexa Fluor 555標(biāo)記驢抗小鼠IgG(1∶200)。DAPI細(xì)胞核染色。計(jì)數(shù)0.01 cm2內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料滿足方差齊性(P＞0.05)，用()表示，組間比較采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Western blotting

三組間各蛋白表達(dá)有非常高度顯著性差異(P＜0.001)。P53、Caspase-3、Bax/BCL-2表達(dá)SD組最多，K組最少；ZO-1、Occludin、Claudin-5表達(dá)SD組最少，K組最多；SDR組均介于兩者之間。見(jiàn)表1、圖1。

圖1 各組Western blotting條帶圖

2.2 EB染色

相較K組，SD組小腦、海馬、尾狀核、頂葉、顳葉、枕葉、扣帶回等多個(gè)皮質(zhì)有EB染液滲出；SDR組相應(yīng)部位也有EB染液滲出，較SD組輕微；K組各層面未見(jiàn)EB染液滲出(圖2)。

2.3 免疫熒光染色

三組間各蛋白表達(dá)有非常高度顯著性差異(P＜0.001)。皮質(zhì)中CD31、NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)SD組最少，K組最多；TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞SD組最多，K組最少；SDR組介于兩者之間。見(jiàn)表2、圖3～圖5。

表1 各組大鼠各蛋白表達(dá)(/β-tubulin)

表2 各組免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(n)

圖2 各組大腦EB染液滲漏情況

圖3 各組CD31表達(dá)(免疫熒光染色,×200)

圖4 各組NeuN表達(dá)(免疫熒光染色,×200)

圖5 各組TUNEL表達(dá)(免疫熒光染色,×200)

3 討論

睡眠是一個(gè)節(jié)省能量、恢復(fù)精力的過(guò)程，是機(jī)體自我平衡與復(fù)原的重要機(jī)制，是動(dòng)物維持生命所必需的穩(wěn)態(tài)過(guò)程[11]。SD能影響腦內(nèi)物質(zhì)和能量代謝，對(duì)健康產(chǎn)生廣泛影響，增加多種疾病發(fā)病率[18-20]。經(jīng)常經(jīng)歷SD(如執(zhí)勤的軍事人員[21])影響大腦功能，表現(xiàn)為執(zhí)行、認(rèn)知能力下降(如簡(jiǎn)單運(yùn)算降低[22]等)。Esposito等[23]發(fā)現(xiàn)，健康青年人在經(jīng)歷SD 24 h后，在記憶依從性、客觀警惕和主觀警惕等方面出現(xiàn)功能障礙。長(zhǎng)時(shí)間SD能導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)焦慮樣行為[24]、認(rèn)知功能障礙[25]、健康惡化甚至死亡[26]。SD提高大腦的去甲腎上腺素水平，破壞線粒體，釋放細(xì)胞色素C，從而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和變性[27]。也有研究在經(jīng)歷SD的大腦中未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡和壞死[28]。SD可能導(dǎo)致大腦功能缺陷，不一定伴有腦組織結(jié)構(gòu)變化。

本研究顯示，大鼠經(jīng)歷SD后，大腦多部位出現(xiàn)不同程度EB染液滲漏，提示血腦屏障被破壞；大鼠皮質(zhì)中緊密連接蛋白表達(dá)降低，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，數(shù)目減少；經(jīng)歷SD后，大鼠皮質(zhì)中凋亡相關(guān)抗體表達(dá)增高，神經(jīng)元數(shù)量減少，凋亡增高。總體而言，SD導(dǎo)致大鼠血腦屏障功能障礙，通透性增加，破壞腦穩(wěn)態(tài)，使腦內(nèi)細(xì)胞凋亡增加，神經(jīng)元數(shù)目減少。這可能是SD影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的機(jī)制之一。

Sung[29]發(fā)現(xiàn)，SD 24 h后休息72 h，SD引起的高攻擊性和抑郁情緒可以恢復(fù)正常。本研究在SD后予恢復(fù)睡眠48 h，發(fā)現(xiàn)血腦屏障破壞和細(xì)胞凋亡等情況有所改善。睡眠恢復(fù)僅能部分緩解SD的不利影響。

睡眠是必不可少的自我恢復(fù)過(guò)程?，F(xiàn)代社會(huì)存在睡眠時(shí)間不足、睡眠質(zhì)量差等問(wèn)題，影響人體健康。其具體作用機(jī)制和過(guò)程仍未完全解開(kāi)，還需更多研究進(jìn)一步闡釋。