周 巍，趙英強(qiáng)，莊建國(guó)2，李 甜，王 娟

流行病學(xué)研究顯示，預(yù)計(jì)到2025年全球高血壓病人將增加到15.6億人[1]。2010年我國(guó)高血壓防治指南指出，目前有約2億高血壓病人，且高血壓病人總體知曉率、治療率和控制率明顯較低，分別低于50%、40%和10%[2]，同時(shí)高血壓具有高患病率、高死亡率、高致殘率的特點(diǎn)，已成為公共衛(wèi)生事業(yè)面臨的一項(xiàng)巨大挑戰(zhàn)。

高血壓的發(fā)生發(fā)展與血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能紊亂密切相關(guān)，為目前臨床研究熱點(diǎn)之一。天麻鉤藤飲是治療肝陽(yáng)上亢型高血壓疾病的經(jīng)典方劑，具有平肝熄風(fēng)、清熱活血、補(bǔ)益肝腎的作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，天麻鉤藤飲能改善自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)的小血管舒縮功能，但對(duì)內(nèi)皮功能影響的機(jī)制研究較少。本研究探討不同劑量天麻鉤藤飲及依那普利對(duì)SHR血壓、內(nèi)皮損傷修復(fù)及內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)動(dòng)員的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)12周齡健康雄性SHR 50只，同源、同周齡、同性別且血壓正常的京都維斯特大鼠(Wistar-kyoto rats，WKY)6只，體重(250±30)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所清潔級(jí)動(dòng)物房，每籠5只(注：WKY為1籠)，分籠喂養(yǎng)。飼養(yǎng)于室內(nèi)通風(fēng)櫥內(nèi)，恒溫(24±2)℃，濕度50%～70%，自然晝夜，自由取食及飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 天麻鉤藤飲湯劑，組方：天麻10 g，鉤藤15 g(后下)，石決明20 g(先煎)，山梔6 g，黃芩6 g，川牛膝12 g，杜仲12 g，益母草12 g，桑寄生12 g，夜交藤12 g，茯苓12 g。所有藥物均經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房鑒定為正品，水提濃縮，相當(dāng)于每毫升含生藥1 g，4 ℃保存?zhèn)溆谩ｊ?yáng)性對(duì)照藥，馬來(lái)酸依那普利片(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)江蘇制藥股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：每片10 mg，批號(hào)：16080110)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

1.3.1 實(shí)驗(yàn)試劑 內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(武漢華美，貨號(hào)CSB-E04757 r)，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒(武漢華美，貨號(hào)CSB-E11987 r)，大鼠CD34免疫熒光抗體(abcam，貨號(hào)ab187284)，Alexa Fluor 488標(biāo)記抗兔IgG(中杉金橋，貨號(hào)ZF-0511)和Prom1 antibody(上海群已，貨號(hào)PAB12663)，磷酸鹽緩沖液(Solarbio)，多聚甲醛(Solarbio)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)儀器 智能無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)BP-98A(北京軟隆生物技術(shù)有限公司)，筒形大鼠固定器-wi108818(北京若水合科技有限公司)，小動(dòng)物保溫加熱毯45 cm×45 cm(安迪教學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器)，流式細(xì)胞儀(BD accuri C6，美國(guó))，酶標(biāo)儀(Tecan infinite 2000，澳大利亞)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法 本研究采用隨機(jī)、平行對(duì)照設(shè)計(jì)開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。將50只SHR隨機(jī)分為模型組、西藥組、中藥低劑量組、中藥中劑量組和中藥高劑量組，每組10只，同時(shí)將6只WKY作為對(duì)照組，共6組。連續(xù)給藥6周，每周測(cè)量1次血壓和體重。對(duì)照組：不進(jìn)行藥物干預(yù)，每日灌胃與實(shí)驗(yàn)組相同體積的生理鹽水；模型組：不進(jìn)行藥物干預(yù)，每日灌胃與實(shí)驗(yàn)組相同體積的生理鹽水；西藥組：依那普利按3 mg/(kg·d)灌胃給藥；中藥低劑量組、中劑量組、高劑量組：分別予以天麻鉤藤飲湯劑1.0mL/(100 g·d)、1.5mL/(100 g·d)、2.0 mL/(100 g·d)灌胃給藥。

1.4.2 血壓測(cè)量 正式實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性測(cè)量實(shí)驗(yàn)大鼠血壓1周，每次測(cè)量血壓時(shí)使用小動(dòng)物保溫加熱毯加熱至38 ℃，SHR大鼠及WKY大鼠鼠尾預(yù)熱15～20 min，筒形固定器固定大鼠，鼠尾露出，將加壓感應(yīng)器置于鼠尾根部，大鼠在清醒與安靜狀態(tài)下，無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)在脈搏波型穩(wěn)定5 s后自動(dòng)測(cè)量。每只大鼠測(cè)量5次血壓，取平均值作為最終結(jié)果。

1.4.3 頸動(dòng)脈結(jié)構(gòu)病理學(xué)觀察 各組大鼠給藥6周后，均禁食12 h，末次測(cè)量血壓及稱重后，麻醉開(kāi)胸取血備用，分離頸動(dòng)脈，取2 cm頸動(dòng)脈，生理鹽水洗凈后以10%甲醛溶液固定，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色、光鏡觀察。

1.4.4 血管內(nèi)皮相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) VEGF和TNF-α均采用ELISA檢測(cè)，每項(xiàng)指標(biāo)取血清50 μL，按相關(guān)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

1.4.5 循環(huán)EPCs計(jì)數(shù)測(cè)定方法 采用免疫熒光標(biāo)記方法，本研究選擇CD34+、CD133+細(xì)胞為EPC。EPCs檢測(cè)步驟：取肝素鈉抗凝100 μL外周血加1 mL紅細(xì)胞裂解液，混勻，室溫下靜置10 min，中途混勻1次，以1 500 r/min離心5 min；小心吸凈上清；加入1 mL PBS混勻洗一遍，以1 500 r/min離心5 min；棄去上清，制成200 μL細(xì)胞懸液；加入CD34抗體染色，室溫避光15 min；加入固定液，混勻隔夜；加入破膜劑，洗滌后加入Alexa Fluor 488標(biāo)記抗兔IgG和CD133(PROM1)抗體；加1 mL PBS混勻洗一遍，棄去上清，制成200 μL細(xì)胞懸液；采用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心率、收縮壓(SBP)、平均動(dòng)脈壓(MBP)和舒張壓(DBP)比較 治療前，與對(duì)照組(血壓及心率在正常范圍內(nèi))比較，其余5組SBP及心率均明顯升高(P<0.01)，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具備實(shí)驗(yàn)條件。與模型組比較，中藥高劑量組給藥1周后SHR大鼠DBP、MBP首先降低；給藥3周后，中藥高劑量組SHR大鼠SBP和DBP明顯降低(P<0.05)；給藥3周后，西藥組SHR大鼠SBP、DBP、MBP降低(P<0.05)。給藥6周后，與模型組比較，西藥組和中藥組高劑量組SHR大鼠降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表1、圖1。

2.2 各組頸動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu) HE染色切片顯示，對(duì)照組頸總動(dòng)脈血管內(nèi)膜無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞脫落，無(wú)血細(xì)胞黏附，管腔規(guī)則，動(dòng)脈壁厚度均勻，彈力纖維排列整齊。模型組頸動(dòng)脈血管管腔規(guī)則，動(dòng)脈壁厚度欠均勻，彈力纖維部分較雜亂。西藥組大鼠頸動(dòng)脈血管動(dòng)脈壁厚度均勻，彈性纖維較SHR組排列有序。中藥低劑量組、中劑量組、高劑量組血管病理形態(tài)觀察與西藥組相似。詳見(jiàn)圖2。

2.3 各組大鼠血清VEGF和TNF-α比較 治療6周后，與對(duì)照組比較，模型組和西藥組及中藥各劑量組血清VEGF、TNF-α濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，中藥低劑量組、中劑量組、高劑量組及西藥組血清VEGF、TNF-α濃度均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見(jiàn)表2、圖3。

組別只數(shù) HR(次/min) 治療前治療3周后治療6周后對(duì)照組6362±31411±50 357±5 模型組7418±26478±321)467±221)西藥組7426±30456±241)417±561)中藥低劑量組8442±30460±311)484±281)中藥中劑量組9425±25468±461)485±151)中藥高劑量組9449±27454±231)449±41) 組別 SBP(mmHg) 治療前治療3周后治療6周后對(duì)照組140±10146±6144±9 模型組185±13199±91)211±31)西藥組192±9 184±51)2)195±121)2)中藥低劑量組190±9 195±81)198±71)中藥中劑量組182±11196±31)201±61)中藥高劑量組184±11196±71)2)196±81)2) 組別 DBP(mmHg) 治療前治療3周后 治療6周后對(duì)照組100±6104±12105±2模型組141±7158±91)157±61)西藥組142±6140±101)2)149±51)2)中藥低劑量組146±4151±71)151±51)中藥中劑量組140±3155±41)159±111)中藥高劑量組142±6147±91)2)153±41)2)

注：1 mmHg=0.133 kPa。與對(duì)照組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05

A為SBP；B為DBP；C為MBP；D為心率

圖2 各組大鼠頸動(dòng)脈結(jié)構(gòu)(HE染色，×400)

組別只數(shù)TNF-αVEGF對(duì)照組 679.10±3.03 33.93±1.09 模型組 7131.62±3.861) 52.44±1.521) 西藥組 789.93±3.131)2)44.92±3.611)2)中藥低劑量組8118.86±6.231)2)46.65±4.211)2)中藥中劑量組9102.81±2.631)2)44.04±1.581)2)中藥高劑量組997.55±2.481)2)41.05±1.211)2)

與對(duì)照組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.01

a為VEGF；b為TNF-α。與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01圖3 用藥6周各組血清VEGF、TNF-α表達(dá)

2.4 各組SHR大鼠循環(huán)EPCs影響 治療6周后，流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組循環(huán)EPCs所占比例明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，西藥組及中藥各劑量組循環(huán)EPCs所占比例均升高，且西藥組及中藥高劑量組升高更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3、圖4。

組別只數(shù)ECPs比例對(duì)照組60.57±0.06模型組70.30±0.091)西藥組70.55±0.122)中藥低劑量組80.35±0.11中藥中劑量組90.41±0.21中藥高劑量組90.55±0.172)

與對(duì)照組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05

A為CD34PE/CD133(Prom-1) Alexa Fluor 488二維圖；B為CD133(Prom-1)Alexa Fluor 488直方圖；C為CD34PE直方圖

圖4流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)圖

3 討 論

高血壓病是全身細(xì)小動(dòng)脈持續(xù)痙攣硬化，周圍循環(huán)阻力增加引起血壓上升，基本病理變化是細(xì)小動(dòng)脈病變。高血壓持續(xù)作用下，全身細(xì)小動(dòng)脈發(fā)生玻璃樣變，中層平滑肌細(xì)胞增殖，內(nèi)膜纖維組織和彈力纖維組織增生，血管管腔狹窄。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙與高血壓發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的多種血管活性物質(zhì)，可調(diào)節(jié)血管收縮、舒張及維持血管張力。

高血壓進(jìn)程中，由于血管內(nèi)皮損傷，VEGF可特異性地刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。有研究認(rèn)為，高血壓病人血清VEGF水平增加是機(jī)體的一種代償反應(yīng)，其作用是維持動(dòng)脈粥樣硬化狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能，可促進(jìn)受損內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)[3]。TNF-α是一種炎性細(xì)胞因子，與炎癥反應(yīng)、組織損傷密切相關(guān)，可增加血管內(nèi)皮通透性，內(nèi)皮舒縮功能障礙，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，引起血管內(nèi)膜增生管腔變窄，促進(jìn)高血壓發(fā)生。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，高血壓病發(fā)生發(fā)展過(guò)程的血管內(nèi)皮損傷可能引起血TNF-α水平增高[4-5]，TNF-α導(dǎo)致的內(nèi)皮功能障礙可能是高血壓靶器官損害與合并癥的重要因素[6]。

EPCs是一類具有特異性歸巢于損傷區(qū)域并分化增殖為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞。EPCs主要源自骨髓，可對(duì)刺激、組織缺血和血管損傷產(chǎn)生應(yīng)答，動(dòng)員到外周血并遷移、歸巢到缺血或損傷部位，并在靶區(qū)域增殖、分化為內(nèi)皮細(xì)胞。EPCs對(duì)受損血管內(nèi)皮具有修復(fù)作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，SHR動(dòng)物模型[7]和醋酸去氧皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓大鼠模型[8]EPCs數(shù)量與增殖、黏附、遷移能力均較正常對(duì)照組明顯降低。頑固性高血壓病人循環(huán)血液EPCs數(shù)量及增殖能力均明顯下降；血液EPCs數(shù)量越低，收縮壓越高[7，9]。

天麻鉤藤飲由天麻、鉤藤、石決明、杜仲等11味中藥配伍組成，是治療肝陽(yáng)上亢型高血壓病的經(jīng)典方劑，也是平肝潛陽(yáng)治療的代表藥物。本研究結(jié)果顯示，依那普利及中藥天麻鉤藤飲均能降低SHR大鼠血壓，隨著大鼠鼠齡增加血壓持續(xù)上升，藥物治療能抑制高血壓升高。與模型組比較，中藥高劑量組及西藥組用藥3周后能明顯降低SHR大鼠SBP和DBP(P<0.05)。與對(duì)照組比較，模型組VEGF及TNF-α均升高，EPCs數(shù)量降低，西藥組及中藥高劑量組可一定程度降低VEGF和TNF-α水平，升高EPCs水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

天麻鉤藤飲具有促進(jìn)血管內(nèi)皮損傷修復(fù)、抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、減輕血管炎性反應(yīng)的作用，對(duì)血管內(nèi)皮的保護(hù)作用表現(xiàn)為動(dòng)員EPCs，升高SHR外周血EPCs數(shù)量，以促進(jìn)損傷內(nèi)皮的修復(fù)。