沈丹萍 張正光 詹常森

摘 要 目的：建立胃可寧片高效液相色譜指紋圖譜，為其質(zhì)量控制提供比較全面的方法。方法：采用異硫氰酸苯酯（PITC）為衍生試劑，與胃可寧片中氨基酸等化合物柱前衍生，高效液相色譜法測定，Venusil AA（4.6 mm×250 mm， 5 mm） 作為色譜柱，柱溫 40 ℃，流速為 1.0 ml/min，檢測波長 254 nm，用流動相A[乙腈-水（80∶20）]和B [0.1 mol/L醋酸鈉水溶液（pH 6.5）]的混合液進行梯度洗脫。 結(jié)果：建立了胃可寧片指紋圖譜方法，確定了 12 個共有峰，10 批樣品的相似度均大于 0.95，同時分析了共有峰的來源。結(jié)論：該方法準確可控，可用于胃可寧片的質(zhì)量控制和評價。

關(guān)鍵詞 胃可寧片 氨基酸 柱前衍生化 指紋圖譜

中圖分類號：O657.72； R286 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）15-0108-05

Study on HPLC fingerprint of Weikening tablets based on amino acids

SHEN Danping1， 2*， ZHANG Zhengguang1， 2， ZHAN Changsen1， 2**（1. Shanghai Hutchison Pharmaceuticals Co.， Ltd.， Shanghai 201401， China； 2. Shanghai Engineering Research Center for Innovation of Solid Preparation of TCM， Shanghai 201401， China）

ABSTRACT Objective： To establish HPLC fingerprint of Weikening tablets to provide a comprehensive evaluation for their quality control. Methods： HPLC determination was performed on a Venusil AA column （4.6 mm×250 mm， 5 mm）at column temperature 40 ℃， flow rate 1.0 ml/min and detection wavelength 254 nm by gradient elution with mobile phase A（acetonitrile-water （80：20）） and B （0.1 mol/L sodium acetate buffer solution （pH 6.5）） after pre-column derivatization of amino acids in Weikening tablets with phenyl isothiocyanate （PITC） was completed. Results： The HPLC fingerprint of Weikening tablets was established and twelve peaks of amino acids were selected as the common peaks of fingerprint for Weikening tablets. The similarity of ten batches of Weikening tablets was all more than 0.95. At the same time， the source of these common peaks was elucidated. Conclusion： This method is accurate and controllable， and can be used for the quality control and evaluation of Weikening tablets.

KEy WORDS Weikening tablets； amino acids； pre-column derivatization； fingerprint

胃可寧片是上海和黃藥業(yè)有限公司獨家品種之一，是在傳統(tǒng)古方“烏貝散”的基礎(chǔ)上，由上海中藥制藥一廠與上海市一、香山、仁濟、中山、華山等家醫(yī)院協(xié)作，經(jīng)臨床驗證、對照、研制成功的一種治療胃部疾病的藥物。經(jīng)臨床證實，胃可寧片具有收斂、制酸、止痛作用，可用于胃病泛酸、胃及十二指腸潰瘍。

胃可寧片主要有兩味藥材，珍珠層粉和浙貝母。其中，珍珠層粉為蚌科動物三角帆蚌[Hyriopsis cumingii（Lea）]、褶紋冠蚌[Cristaria plicata （Leach）]或珍珠貝科動物馬氏珍珠貝[Pteria martensii （Dunker）]的貝殼內(nèi)壁磨成粉，性味咸寒，其主要成分為鈣，多種氨基酸和少量微量元素[1-4]。浙貝母為百合科植物浙貝母（Fritillaria thunbergii Miq.）的干燥鱗莖，性味苦寒，其主要成分為生物堿，皂苷類和多種氨基酸等[5-7]。目前缺乏對胃可寧片質(zhì)量控制方法，氨基酸為珍珠層粉和浙貝母共有成分且含量較高的化合物，同時氨基酸是人體主要的營養(yǎng)物質(zhì)及生命物質(zhì)。因此，有必要主要針對氨基酸類成分建立胃可寧的指紋圖譜方法，以便可用于對胃可寧片中氨基酸類成分進行有效的質(zhì)量控制，防止生產(chǎn)過程中摻假、摻雜現(xiàn)象，為進一步控制胃可寧片的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀，配備四元泵，自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器（美國Agilent 公司）； SB-5200超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Milli-Q 超純水發(fā)生器（美國Millipore 公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）。

天門冬氨酸（Asp，批號140691-200401）、谷氨酸（Glu，批號140690-201203）、絲氨酸（Ser，批號140688-201102）、甘氨酸（Gly，批號140689-201404）、精氨酸（Arg，140685-201506）、丙氨酸（Ala，140680-201303）、亮氨酸（Leu，批號140687-201503）、苯丙氨酸（Phe，批號111615-200301）和色氨酸（Trp，批號140686-201303）對照品均來自中國食品藥品檢定研究院，純度均>99%（除苯丙氨酸外）；乙腈（美國Tedia公司，色譜純）；醋酸（色譜純）和三乙胺（TEA，色譜純）均購自德國CNW公司；異硫氰酸苯酯（PITC，純度98%）購自中國上海阿拉丁試劑公司；鹽酸（HCl，純度36%～38%）和無水醋酸鈉均購自上海豪申化學(xué)試劑有限公司。

1.2 樣品

本實驗收集了 由上海和黃藥業(yè)有限公司提供的10批胃可寧片（0.53 g/片），批號分別為S1-151109、S2-160112、S3-160118、S4-160220、S5-160303、S6-160314、S7-160325、S8-160407、S9-160425、S10-160509。珍珠層粉和浙貝母各1批。

1.3 方法

1.3.1 液相條件

Venusil AA色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 mm），柱溫40 ℃，流速為1.0 ml/min，進樣量10 ml，檢測波長254 nm，流動相為 A相（乙腈-水 80∶20），B 相（0.1 mol/L醋酸鈉水溶液，用醋酸調(diào)pH=6.5），梯度洗脫程序：0～15 min，0%～8%（A）；15～25 min，8%～22%（A）；25～36 min，22%～36%（A）；36～38 min，36%～100%（A）；38～43 min，100%（A）；43～43.1 min，100%～0%（A）；43.1～50 min，0%（A）。

1.3.2 溶液的制備

1）對照品溶液 分別精密稱定天門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和色氨酸對照品20 mg，用 0.1 mol/L 鹽酸溶液溶于 10 ml容量瓶中，定容，作為儲備液于 4 ℃ 冰箱避光保存。分別取對照品儲備液用 0.1 mol/L 鹽酸溶液適量稀釋，制成分別含100 mg/ml上述氨基酸的混合對照品溶液。

2）供試品溶液 精密稱取胃可寧片 2 g，置于 100 ml錐形瓶中，加入 6 mol/L 鹽酸溶液25 ml溶解、定容，然后置于 100 ℃ 水浴中水解 8 h，取出冷卻，取水溶液 10 ml，置于蒸發(fā)皿中，100 ℃水浴濃縮至干，加入 5 ml 0.1 mol/L鹽酸溶液溶解，用 0.45 mm 濾膜過濾后，濾液貯存于冰箱中，供衍生使用。準確量取樣品溶液 400 ml，按照 1.3.3 項下方式衍生，用0.22 mm 濾膜的針式過濾器過濾即可。

3）陰性樣品溶液 按胃可寧處方比例分別制備缺各味藥材的陰性樣品。精密稱取缺珍珠層粉陰性樣品及缺浙貝母陰性樣品各2 g，按照供試品溶液制備方式得陰性溶液樣品。

4）空白溶液 精密量取 0.1 mol/L 鹽酸溶液 400 ml，衍生、針式過濾器過濾即可。

1.3.3 衍生方法

準確量取氨基酸標準品溶液 400 ml，分別置于 2 ml離心管中，分別加入TEA-乙腈溶液（1 mol/L）200 ml和PITC-乙腈溶液（0.1 mol/L）200 ml，搖勻、室溫靜置衍生 1 h；然后分別加入 800 ml 正己烷，搖勻、靜置 10 min，取下層溶液 400 ml 并用水稀釋到 1 ml，混勻后用針式過濾器過濾即可。

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 精密度

取批號151109樣品制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次進行HPLC測定，以12號峰（苯丙氨酸）為參照峰，分別計算12個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值。

1.4.2 重復(fù)性

取批號151109樣品制備供試品溶液6份，分別進行HPLC測定，以12號峰（苯丙氨酸）為參照峰，分別計算12個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值。

1.4.3 穩(wěn)定性

取批號151109樣品制備供試品溶液，分別于室溫放置0，1，2，4，6，8 h時進行HPLC測定，以12號峰（苯丙氨酸）為參照峰，分別計算12個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

在精密度和重復(fù)性考察實驗中，12個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%，表明實驗的精密度和重復(fù)性均良好；在穩(wěn)定性考察實驗中，12個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD也均小于3%，表明樣品在 8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 胃可寧片指紋圖譜相似度評價

采用上述已建立的指紋圖譜方法，對10 批胃可寧片進行指紋圖譜分析，得10批樣品的指紋圖譜（圖 1），將圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2009版），生成了對照指紋圖譜，確定了分離度較好和穩(wěn)定性較高的12個共有峰（圖2-A），計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積，計算結(jié)果見表 1。不同樣品相對保留時間的 RSD 均小于 0.3%；相對峰面積的 RSD在2.65%～50.03%之間。可知，各批次樣品共有物質(zhì)出峰時間大致相同，成分較穩(wěn)定，但其量相差較大。

通過與空白對照圖譜（圖 2-D）與陰性樣品圖譜（圖2-B、圖2-C）對比，確定了12個共有峰的來源，其中1號峰和4號峰來源于浙貝母，5號峰來源于珍珠層粉，而其余9個峰共同來源了浙貝母和珍珠層粉。并通過與對照品圖譜（圖2-E）對比，確定2號峰為甘氨酸（Glu）、3號峰為精氨酸（Arg），6號峰為丙氨酸（Ala），11號峰為亮氨酸（Leu），12號峰為苯丙氨酸（Phe）。

2.3 胃可寧片指紋圖譜相似度評價

通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件》（2009版）的計算，得到 10 批次胃可寧片樣品的整體相似度（體現(xiàn)不同批次樣品間各成分在種類及其相對含量上的相似程度）評價結(jié)果（表2），他們的相似度均大于0.95 以上，表明此指紋圖譜可用于胃可寧片質(zhì)量控制。

3 討論

大多數(shù)氨基酸無芳香環(huán)等生色團，無法直接采用紫外或熒光檢測器檢測，目前應(yīng)用較廣的采用柱前衍生高效液相法。常用的衍生試劑有鄰苯二甲醛（OPA）[8-9]、異硫氰酸苯酯（PITC）[10-11]、芴甲氧羰酰氯（FMOC-Cl）[12]、丹磺酰氯（Dansyl-Cl）[13]和6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基甲酸酯（AQC）等，但均有其各自的優(yōu)缺點。參考文獻后[14-15]，本實驗選擇 PITC 作為柱前衍生試劑，在衍生反應(yīng)后用多次溶劑萃取法去除過量的衍生試劑，以防衍生試劑對色譜柱的損傷。采用此衍生試劑，成本低、靈敏、高效，且操作簡單。本實驗考察了衍生試劑與樣品濃度用量比，分別配制了與樣品濃度不同比例，范圍為1∶4～3∶4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)衍生試劑與樣品濃度比為1∶2為最佳配比。此外考察了衍生化反應(yīng)時間對產(chǎn)物濃度的影響，采集室溫下反應(yīng)40、60、90和120 min的樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)60 min效果最佳。

本實驗考察了流動相pH和不同醋酸鈉水溶液濃度對氨基酸的影響，對胃可寧片整體來說，因氨基酸種類不是太多，影響不是太大，綜合考慮后，本研究選擇了文獻報道的方法[2]，即0.1 mol/L醋酸鈉水溶液，醋酸調(diào)pH=6.5。

本實驗采用HPLC-UV技術(shù)，PITC 作為柱前衍生試劑，基于氨基酸類成分建立胃可寧片指紋圖譜，確定了12個共有峰，通過對照品確定了5個色譜峰成分，組方中各味藥材的成分亦得到了體現(xiàn)，研究結(jié)果可為胃可寧片的質(zhì)量控制提供有益的借鑒。

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