楊 雷， 劉 萍， 劉 暖， 陶玲玲， 李 星， 毛秉豫

(南陽理工學院河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點實驗室， 張仲景國醫(yī)國藥學院， 河南 南陽 473004)

心肌梗死是心臟冠狀動脈的血流中斷造成心肌的缺血缺氧壞死，壞死的心肌組織被致密的纖維疤痕所取代，不僅造成心臟收縮功能的嚴重下降，還嚴重影響心肌的電生理活動，可能引發(fā)致死性的心律失常。心肌梗死后缺血心肌組織血運的重建十分困難，外源性內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)的移植和內(nèi)源性EPCs的募集被認為是解決這一難題的理想手段之一[1-2]。而EPCs表面可以表達CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)，CXCR4和基質(zhì)細胞衍生因子1α(stromal cell-derived factor 1α，SDF-1α)一起構(gòu)成特異性的SDF-1α/CXCR4軸，通過募集EPCs在心肌梗死后血管新生和心肌修復的進程中發(fā)揮著重要的作用[3-4]。AMD3100是CXCR4的特異性阻斷劑，通過競爭SDF-1α與CXCR4的結(jié)合位點阻斷SDF-1α結(jié)合CXCR4，從而阻斷SDF-1α/CXCR4軸的生理功能[4]。

黃芪甲苷(astragaloside IV，AS-IV)是中藥黃芪的有效成分之一，黃芪通常用于預防和治療心腦血管疾病、免疫紊亂、肺纖維化、肝癌、糖尿病和腎臟疾病，并具有減少衰老的作用[1-2]。AS-IV可抑制血小板聚集，并促進前列環(huán)素和一氧化氮的釋放，從而發(fā)揮其抗血栓形成的作用[5-6]。AS-IV還具有增加大鼠缺血心臟的微血管密度的作用[5-7]。然而AS-IV對SDF-1α/CXCR4的作用目前研究不多。本研究擬探討AS-IV對EPCs中SDF-1α/CXCR4的調(diào)控作用，為心肌梗死等缺血性心肌疾病的治療提供新的策略。

材 料 和 方 法

1 實驗動物、儀器、藥物與試劑

SPF級Wistar大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，8周齡，重約200～220 g，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2016-0011。所有動物在標準飼養(yǎng)的環(huán)境下飼喂食物和飲水，并在南陽理工實驗動物倫理委員會監(jiān)控下進行。

FACSCanto II型流式細胞儀(BD)；Bullet Blen-der Storm組織細胞破碎儀(Next Advance)；TiS型倒置熒光顯微鏡及NIS-Elements Software BR分析系統(tǒng)(Nikon)。

AS-IV和抗BrdU抗體(上海寶曼公司)；EBM-2培養(yǎng)基(北京達科為公司)；Ficoll細胞分離液，抗SDF-1α、CXCR4和p-CXCR4抗體，AMD3100(Santa Cruz)；抗CD133、CD34和VEGFR-2抗體(Affinity)。

2 方法

2.1EPCs的體外分離、培養(yǎng)和鑒定 應用EBM-2培養(yǎng)基分別沖洗大鼠肱骨、股骨和脛骨的骨髓腔3～5次，應用Ficoll細胞分離液，采用密度梯度離心法獲得EPCs單核細胞。用添加了5%胎牛血清的EBM-2培養(yǎng)基將分離后的細胞重懸，按照5×104/cm2的密度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中。選取培養(yǎng)7 d的細胞，棄去非貼壁細胞，制備密度為1×1010/L的細胞懸液，分別加入兔抗大鼠CD133、CD34和VEGFR-2抗體，避光條件下應用流式細胞儀檢測各組陽性細胞所占比例。

2.2EPCs增殖的檢測 將EPCs用EBM-2基礎培養(yǎng)基重懸，調(diào)至每孔1×104個的密度加入96孔培養(yǎng)板中。實驗分4個組：空白對照(control)組(不加藥物)、AS-IV(20 g/L)組、AMD3100-AS-IV組(5 mg/L AMD3100+20 g/L AS-IV，先加入AMD3100作用1 h后，再加入AS-IV，下同)和AMD3100(5 mg/L)組。每組設置3個復孔，實驗重復3次。培養(yǎng)24 h后，加入1 ∶100稀釋的BrdU鼠單克隆抗體(每孔100 μL)，室溫孵育1 h，PBS沖洗2次，加入1 ∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG孵育1 h，PBS再次沖洗2次，加入100 μL的TMB過氧化物酶底物避光孵育30 min，加入100 μL終止液，450 nm波長處讀取各孔吸光度(A)值。

2.3EPCs黏附的檢測 將EBM-2的基礎培養(yǎng)基重懸的EPCs細胞以每孔1×104個接種于鋪有人工基底膜的96孔培養(yǎng)板中，實驗分組同2.2。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，棄去未黏附于基底膜上的細胞，每孔加入5 g/L的MTT溶液10 μL，避光孵育4 h，加入150 μL DMSO終止培養(yǎng)，568 nm波長處讀取各孔吸光度(A568) 值。

2.4EPCs遷移能力的檢測 應用24孔的Transwell小室(濾膜直徑為6.5 mm，孔徑8.0 μm)進行檢測。EBM-2培養(yǎng)基將EPCs調(diào)至密度為5×107/L，實驗分組同2.2。每孔上室接種200 μL細胞懸液，下室加入500 μL含藥或者空白對照的EGM-2培養(yǎng)基，37 ℃下孵育12 h，用棉簽擦去上室的非遷移細胞，將遷移過膜的細胞用2%多聚甲醛固定30 min，0.1%的結(jié)晶紫染色，400倍倒置顯微鏡下隨機取5個視野，計數(shù)遷移過膜的細胞數(shù)量，取其平均值。

2.5EPCs管狀結(jié)構(gòu)形成能力的檢測 將EPCs用EBM-2培養(yǎng)基重懸，每孔5×104個加入Matrigel預處理的24孔板中，實驗分組同2.2。培養(yǎng)72 h后，400×倒置顯微鏡下觀察形成的管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量，隨機選擇5個視野計數(shù)，取其平均值。

2.6氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation，OGD)-復氧下EPCs凋亡的檢測 EPCs細胞以每孔5×104個接種在24孔板中，用20 g/L 的AS-IV預處理2 h后，暴露于缺氧缺糖條件下培養(yǎng)1 h，然后在含有95%空氣和 5% CO2的復氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)1 h。實驗分control組、OGD組、AS-IV組、AMD3100-AS-IV組和AMD3100組。前2個組不加藥物，僅加入等量的培養(yǎng)基；AS-IV和AMD3100的劑量和用法同前。72 h后，棄去培養(yǎng)液，0.1%胰蛋白酶消化后加入4%的多聚甲醛固定25 min，滴加100 μL蛋白酶K(20 mg/L)溶液，孵育20 min。根據(jù)TUNEL試劑盒說明書染色標記，DAPI復染，用含熒光淬滅劑的封片液封片，400×倒置熒光顯微鏡下分析凋亡細胞的數(shù)量，隨機選擇5個視野計數(shù)，取其平均值。

2.7EPCs中SDF-1α/CXCR4的mRNA表達檢測 TRIzol法提取總RNA，設計SDF-1α的上游引物為5′-TCTTTGGCCTCCTGTAGAATGG-3′，下游引物序列為5′-TCACGGCAAGATTCTGGCTTA-3′，產(chǎn)物長度為240 bp；CXCR4的上游引物為5′-CGTGAATGAGTGTCTAGGCAGG-3′，下游引物序列為5′-GGCTTTGGTTTTAAGTGCCATC-3′，產(chǎn)物長度為177 bp；β-actin的上、下游引物為5′-AGACCTTCAACACCCCAG-3′和5′-CACGATTTCCCTCTCAGC-3′，產(chǎn)物長度為94 bp。實驗分組同2.2。每組細胞取2 μg總RNA，根據(jù)試劑盒的說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板普通PCR擴增，取10 μg擴增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，AlphaView SA軟件攝圖并分析SDF-1α/CXCR4與β-actin的灰度比值。

2.8EPCs中SDF-1α/CXCR4和p-CXCR4蛋白水平的檢測 實驗分組同2.2。應用Next Advance Bullet Blender Storm細胞破碎儀將EPCs打碎，勻漿，4 ℃下12 000×g離心2 min，提取組織總蛋白后Bradford法測濃度，取20 μg進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h后洗膜，標記1 ∶ 200稀釋的抗SDF-1α、CXCR4、p-CXCR4和β-actin抗體，4 ℃過夜，洗膜，與辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1 ∶ 2 000)孵育1 h后TBST洗膜，暗室曝光顯影。分析并記錄各樣本與β-actin灰度比值。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0軟件，計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 EPCs的鑒定

培養(yǎng)7 d的EPCs用流式細胞術分別鑒定細胞表型，EPCs表面抗原CD34、CD133和VEGFR-2表達率分別為39.51%、23.75%和17.75%，符合EPCs特征，見圖1。

Figure 1.Detection of CD34, CD133 and VEGFR-2 expression on EPCs by flow cytometry.

圖1 流式細胞術檢測分析EPCs的表面抗原CD34、CD133和VEGFR-2表達率

2 AS-IV對EPCs的增殖、黏附和遷移能力的影響

和control組相比，AS-IV組EPCs細胞的增殖、黏附和遷移能力顯著升高(P<0.01)；和AS-IV組相比，AMD3100-AS-IV組和AMD3100組EPCs的增殖、黏附和遷移能力顯著下降(P<0.01)，見圖2、3。這表明，AS-IV可以提升EPCs的增殖、黏附和遷移能力，但這一作用能夠被AMD3100阻斷。

Figure 2.The effect of AS-IV on the abilities of adhension and proliferation of the EPCs in each group. A: the adhension assay; B: the proliferation assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsAS-IV group.

圖2 AS-IV對EPCs黏附和增殖能力的影響

Figure 3.The effect of AS-IV on the migration ability of EPCs in each group. The scale bar = 40 μm. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsAS-IV group.

圖3 AS-IV對EPCs遷移能力的影響

3 AS-IV對EPCs管狀結(jié)構(gòu)形成能力的影響

和control組相比，AS-IV組形成管腔樣結(jié)構(gòu)的結(jié)點數(shù)量更多，管腔長度更長(P<0.01)；和AS-IV組相比，AMD3100-AS-IV組和AMD3100組EPCs的管腔結(jié)點數(shù)量、管腔長度明顯下降(P<0.01)，見圖4。這表明AS-IV可以提升EPCs的成管能力，而AMD3100可以阻斷這一作用。

Figure 4.The effect of AS-IV on the number of tube-like structures and value of tuber length of the EPCs in each group. The scale bar=40 μm. Means±SD.n=3.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsAS-IV group.

圖4 AS-IV對EPCs管狀結(jié)構(gòu)形成能力的影響

4 AS-IV對OGD-復氧下EPCs凋亡的影響

和control組相比，OGD-復氧下EPCs的凋亡細胞數(shù)量顯著升高(P<0.01)；和OGD組相比，AS-IV組EPCs細胞的凋亡數(shù)量顯著下降(P<0.01)；和AS-IV組相比，AMD3100和AMD3100-AS-IV組EPCs的凋亡細胞數(shù)量再次顯著升高(P<0.01)，見圖5。這表明AS-IV可以抑制EPCs的凋亡，而AMD3100可以阻斷這一效應。

Figure 5.The effect of AS-IV on the number of TUNEL-positive EPCs in each group. The scale bar = 40 μm. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsOGD group;△△P<0.01vsAS-IV group.

圖5 AS-IV對EPCs凋亡細胞數(shù)量的影響

5 AS-IV對EPCs中SDF-1α、CXCR4表達和p-CXCR4蛋白水平的影響

和control組相比，AS-IV組EPCs中SDF-1α和CXCR4的mRNA和蛋白水平及p-CXCR4蛋白水平均顯著升高(P<0.01)；和AS-IV組相比，AMD3100-AS-IV組EPCs中CXCR4的mRNA和蛋白及p-CXCR4蛋白水平均顯著下降(P<0.01)，但SDF-1α的mRNA和蛋白表達并不下降；而AMD3100組EPCs中SDF-1α和CXCR4的mRNA和蛋白及p-CXCR4蛋白水平均較AS-IV組顯著下降(P<0.01)，接近于control組，見圖6、7。這表明AS-IV具有上調(diào)EPCs中SDF-1α和CXCR4表達的作用，并上調(diào)p-CXCR4蛋白的水平，AMD3100可以顯著抑制AS-IV對CXCR4表達的上調(diào)作用，但不能抑制AS-IV對SDF-1α表達的上調(diào)作用。

討 論

心肌梗死等缺血性心肌疾病會導致內(nèi)源性EPCs的募集困難，數(shù)量減少和功能下降，影響受損心肌組織的修復[8]，因此，恢復和增強EPCs的數(shù)量及功能十分重要，這也為缺血性心肌疾病的治療提供了新的思路和方法?；诖?，我們探討了AS-IV對EPCs的調(diào)控作用及其作用機制。

Figure 6.The effect of AS-IV on the mRNA expression of SDF-1α and CXCR4 in the EPCs of each group. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsAS-IV group.

圖6 AS-IV對EPCs中SDF-1α和CXCR4 mRNA表達的影響

Figure 7.The effect of AS-IV on the protein levels of SDF-1α, CXCR4 and p-CXCR4 in the EPCs of each group. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsAS-IV group.

圖7 AS-IV對EPCs中SDF-1α、CXCR4和p-CXCR4蛋白水平的影響

本研究中，為確保研究的可信程度，我們首先應用特異的兔抗大鼠CD133、CD34和VEGFR-2抗體對分離的EPCs進行了鑒定，結(jié)果表明提取分離的細胞具備經(jīng)典的EPCs細胞標志物特征，符合實驗要求。

課題組之前的研究表明，黃芪提取物可以顯著上調(diào)EPCs的數(shù)量、黏附和遷移能力，增強EPCs的成管能力[1]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)AS-IV也有相似的作用，這和前期的實驗結(jié)果相一致。并發(fā)現(xiàn)AS-IV還具有抑制OGD-復氧環(huán)境下所引發(fā)的EPCs凋亡的作用。我們應用Western blot法進一步分析了AS-IV對EPCs中SDF-1α和CXCR4蛋白表達的作用，發(fā)現(xiàn)AS-IV可以上調(diào)EPCs中SDF-1α和CXCR4蛋白的表達，并同時上調(diào)p-CXCR4的蛋白水平，而p-CXCR4是CXCR4的活化狀態(tài)，這表明AS-IV可以上調(diào)SDF-1α和CXCR4的水平，進而可能影響SDF-1α/CXCR4信號通路調(diào)控EPCs的募集。研究還發(fā)現(xiàn)，應用AMD3100后并不能阻斷AS-IV對于SDF-1α誘導的過表達狀態(tài)，但是能夠阻斷AS-IV對CXCR4表達的上調(diào)作用，這可能是AMD3100的作用位點主要是CXCR4，而不是SDF-1α，因此并不影響SDF-1α的表達。同時，AMD3100對于CXCR4的可能作用，一方面是由于封閉了CXCR4活化的作用位點[3]，影響SDF-1α/CXCR4信號通路的激活；另一方面，AMD3100的阻斷使CXCR4處在低能量失活的構(gòu)象狀態(tài)[3]，AS-IV無法誘導活化CXCR4，促使其表達上調(diào)。這表明，AS-IV增強EPCs的生物學功能可能和其對SDF-1α/CXCR4的調(diào)控密切相關。

EPCs是一類特異性歸巢損傷區(qū)域并能分化為成熟內(nèi)皮細胞的一類干/祖細胞，不僅在體外可以被誘導分化成內(nèi)皮細胞，而且在心肌梗死動物模型中被發(fā)現(xiàn)其參與血管生成，修復缺血受損的心肌組織，但產(chǎn)生這一作用的前提是EPCs被募集至受損部位。EPCs被募集的進程需要血管管腔的輸送，并且能夠透過管腔遷移至損傷組織[9-10]。在穩(wěn)態(tài)生理條件下，EPCs基本處在靜止的狀態(tài)，而且，EPCs也不易穿過正常生理狀態(tài)下的血管壁進入血管腔內(nèi)[9-10]。心肌梗死后引發(fā)心肌組織缺血缺氧并產(chǎn)生炎癥等病理反應，激活SDF-1α/CXCR4等趨化因子，并激活選擇素和整合素等細胞黏附分子[4， 9-10]。同時，上述病理反應還可激活TGF-β、IL-1等炎癥因子，破壞血管基膜的完整性，導致血管內(nèi)皮細胞間隙增大、通透性增強[9]。細胞黏附分子和炎癥因子對接之后，介導EPCs與內(nèi)皮細胞緊密黏附、循環(huán)滾動，經(jīng)損傷和通透性增強的毛細血管輸送至損傷的心肌組織中[4, 9-10]。同時，SDF-1α/CXCR4可以上調(diào)局部損傷心肌組織中內(nèi)皮細胞E-選擇素的表達，并誘導EPCs表達E-選擇素配體，通過旁分泌或者內(nèi)分泌途徑募集更多的EPCs到損傷部位，從而增強EPCs對缺血創(chuàng)傷組織的選擇性歸巢，誘導EPCs分化為血管內(nèi)皮細胞，進而形成新生的毛細血管，促進受損心肌組織的修復[11-12]。

也有研究證實，在局部傷口組織中生成或聚集的SDF-1α/CXCR4在參與局部損傷部位和損傷組織周圍的動態(tài)促血管生成進程的協(xié)調(diào)中起著關鍵作用[13]。同時，有研究表明，骨髓源性EPCs在SDF-1α/CXCR4的作用下可被誘導分化成新生毛細血管，豐富了兔缺血后肢的微循環(huán)血運，增強了缺血損傷后肢的功能[14]。這表明，基于SDF-1α/CXCR4作用靶點可能是EPCs等干細胞歸巢缺血損傷組織治療心肌梗死等心血管系統(tǒng)疾病的重要治療方式之一。SDF-1α結(jié)合CXCR4后可激活下游的PKC信號通路[15]，而PKD1又是PKC信號通路激活后的關鍵效應蛋白之一，PKD1可以促進EPCs的增殖、黏附、遷移和血管形成能力[2]，并且有明確的促血管新生修復缺血心肌組織的能力[2, 7]。我們前期實驗也證實，黃芪提取物具有促EPCs遷移、運動和成管作用[1]，結(jié)合本研究結(jié)果，我們推斷AS-IV很可能是通過調(diào)控SDF-1α/CXCR4這一信號通路而抑制EPCs的凋亡，促進EPCs的增殖、黏附、遷移，上調(diào)EPCs的血管形成能力。這豐富了中藥黃芪治療心肌梗死等循環(huán)系統(tǒng)疾病的作用機理，為推動中藥黃芪的現(xiàn)代化提供了部分實驗支撐依據(jù)。