郝躍鵬， 趙梓彤， 楊成園， 宋詠梅△， 王曉霞△

(1山西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,山西 太原 030001； 2國家癌癥中心，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室， 北京 100021)

食管癌是全球范圍內(nèi)常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均居世界前列[1]。食管癌常見的組織病理分型為食管鱗癌和食管腺癌，我國以食管鱗癌為主[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA， lncRNA)是指一類長度超過200個核苷酸且不編碼蛋白的RNA[3]。lncRNA在腫瘤中發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)異?？梢杂绊懩[瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和血管生成[4-8]。因此，lncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要的作用，其作為腫瘤治療的靶點具有廣泛應(yīng)用前景[9]。雖然已經(jīng)報道了多種lncRNA能夠調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移，但是lncRNA在食管鱗癌中的功能作用在很大程度上仍是未知的。lnc671(SHANK2-AS3)是1個長1 683 bp，位于11q13.4上，有3個外顯子區(qū)的lncRNA。目前，尚無lnc671在癌癥中作用的研究報道。本文主要探討lnc671在食管鱗癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平以及使用siRNAs干擾lnc671的表達(dá)后觀察其對食管鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，為今后進(jìn)一步研究其在食管癌中發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞及培養(yǎng)

人食管鱗癌細(xì)胞系由分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室保存，用含10%胎牛血清、100 mg/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，在5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)。

2 方法

2.1生存分析 在基因表達(dá)譜交互分析(GEPIA)網(wǎng)站(www.gepia.cancer-pku.cn)上檢索關(guān)鍵詞“SHANK2-AS3，Survival Plots，ESCA”，得到lnc671的表達(dá)水平與食管癌患者生存長短的關(guān)系圖。

2.2小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)的設(shè)計及轉(zhuǎn)染 本研究中使用的3條siRNAs序列(si-1、 si-2和si-3)由Invitrogen生物有限公司設(shè)計合成。si-1上游序列為5′-CCACACACCUUGCUUUCUUTT-3′，下游序列為5′-AAGAAAGCAAGGUGUGUGGTT-3′；si-2上游序列為5′-CCUUGUGACUUGGAGGAUUTT-3′下游序列為5′-AAUCCUCCAAGUCACAAGGTT-3′；si-3上游序列為5′-GGAGGUAAGCAAGUCAUAATT-3′，下游序列為5′-UUAUGACUUGCUUACCUCCTT-3′。取對數(shù)期生長細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前一天接種于6孔板中，按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒要求配置siRNAs及脂質(zhì)體稀釋液，轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染4～6 h后棄去無血清培養(yǎng)液，更換為含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。

2.3RT-qPCR 用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA(Invitrogen)，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(Promega)。使用TaKaRa的TB GreenTMPremix Ex TaqTM，以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR，選擇管家基因18sRNA作為內(nèi)參照，計算lnc671相對表達(dá)量。lnc671上游引物序列為5′-GGAGCTGATCTAAGCACCAGA-3′，下游引物序列為5′-CAGGTGGGCGAGTCCTAGAG-3′；18sRNA上游引物序列為5′-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3′，下游引物序列為5′-TAGTAGCGACGGGCGGGTGT-3′。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s；95℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40個循環(huán)。

2.4細(xì)胞增殖實驗 將轉(zhuǎn)染siRNAs 36 h后的細(xì)胞用胰酶消化并計數(shù)，按每孔1 500～2 000個細(xì)胞接種于特制的E-Plate 96孔板內(nèi)，使用xCELLigence Real-time Cell Analyzer(RTCA)-MP system(Acea Biosciences/Roche Applied Science)儀器實時檢測細(xì)胞增殖情況，儀器可根據(jù)貼壁細(xì)胞對電阻的影響來檢測細(xì)胞的增殖情況，每隔15 min記錄1次，自動生成細(xì)胞的增殖曲線。

2.5細(xì)胞克隆形成實驗 取轉(zhuǎn)染36 h后的細(xì)胞用胰酶消化并計數(shù)，每孔800～1 000個細(xì)胞接種于6孔板中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～15天后，棄掉舊培養(yǎng)液，用PBS洗2次，甲醇固定10 min，1%結(jié)晶紫染色10 min后洗凈烘干并計算克隆形成的數(shù)目，每種細(xì)胞3個復(fù)孔。

2.6Transwell法細(xì)胞遷移和侵襲實驗

2.6.1遷移實驗 將轉(zhuǎn)染36 h后的細(xì)胞使用胰酶消化離心，用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞計數(shù)，將(2～5)×104個細(xì)胞(200μL細(xì)胞懸液)加入Transwell上室，下室加入600 μL含30%血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，棄去上室培養(yǎng)液后在甲醛中固定10 min，1%結(jié)晶紫染色10 min，清水洗凈后使用棉棒輕輕擦拭小室內(nèi)部，然后用正置顯微鏡拍照，計數(shù)每個小室的細(xì)胞數(shù)。

2.6.2侵襲實驗 用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液配成2%基質(zhì)膠，每個上室加入100 μL，孵育4 h以上，后續(xù)實驗與細(xì)胞遷移實驗基本相同。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間采用t檢驗進(jìn)行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 lnc671的表達(dá)水平和食管癌患者生存期的相關(guān)性

網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫GEPIA(www.gepia.cancer-pku.cn)分析顯示，89例高表達(dá)lnc671的食管癌患者和67例低表達(dá)lnc671的食管癌患者比較，log-rank檢驗顯示lnc671的高表達(dá)的食管癌患者的生存期要明顯低于lnc671低表達(dá)組(P=0.01)，Cox回歸分析顯示，lnc671的風(fēng)險比(hazard ratio,HR)為2，見圖1。

Figure 1.The relationship between the level of lnc671 expression and the survival of esophageal cancer patients.

圖1 lnc671表達(dá)水平的高低與食管癌患者生存的關(guān)系

2 lnc671在食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)情況

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與正常的永生化食管上皮細(xì)胞NE3相比，lnc671在食管鱗癌細(xì)胞株KYSE140、KYSE70、KYSE450、KYSE150、YES2和KYSE180中表達(dá)水平顯著上調(diào)，見圖2。

3 siRNA抑制食管鱗癌細(xì)胞中l(wèi)nc671的表達(dá)

Figure 2.Relative expression level of lnc671 in different esophageal squamous-cell carcinoma cells.

圖2 lnc671在不同的食管鱗癌細(xì)胞中相對表達(dá)水平

為了研究lnc671在食管鱗癌中的功能，我們設(shè)計了3條siRNA序列干擾lnc671的表達(dá)，并選用lnc671相對表達(dá)比較高的2株食管鱗癌細(xì)胞KYSE70和KYSE450進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在食管鱗癌細(xì)胞株KYSE70中，3條siRNAs均顯著干擾了lnc671的表達(dá)(P<0.01)；在KYSE450中，也得到了相似的結(jié)果，表明設(shè)計的siRNAs成功干擾了lnc671在食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)，見圖3。

Figure 3.Detection of lnc671 knockdown efficiency by siRNA. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vssi-control group.

圖3 siRNA對lnc671干擾效率的檢測

4 干擾lnc671的表達(dá)抑制食管鱗癌細(xì)胞的生長

在KYSE70和KYSE450細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染si-control、si-2和si-3來干擾lnc671的表達(dá)，36 h后種入E-Plate 96孔板中，使用RTCA-MP實時檢測細(xì)胞的生長情況，結(jié)果顯示，與對照(si-control)組相比，干擾lnc671表達(dá)后的食管鱗癌細(xì)胞株KYSE70和KYSE450的生長能力受到了抑制，見圖4。

5 干擾lnc671的表達(dá)抑制食管鱗癌細(xì)胞的集落形成能力

與對照組相比，干擾lnc671表達(dá)后的食管鱗癌細(xì)胞株KYSE70和KYSE450的集落形成數(shù)目明顯減少(P<0.01)，見圖5。

Figure 4.Effect of interference with lnc671 expression on growth of esophageal squamous-cell carcinoma cells.

圖4 干擾lnc671表達(dá)后對食管鱗癌細(xì)胞生長的影響

Figure 5.Effect of lnc671 siRNAs on colony formation ability of esophageal squamous-cell carcinoma cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssi-control group.

圖5 干擾lnc671表達(dá)后對食管鱗癌細(xì)胞集落形成能力的影響

6 干擾lnc671的表達(dá)抑制食管鱗癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力

使用siRNAs轉(zhuǎn)染KYSE70和KYSE450 36 h后，接種于Transwell小室中，24 h后固定染色。結(jié)果觀察到KYSE70和KYSE450的遷移和侵襲能力均受到了明顯的抑制(P<0.05)，見圖6、7。

討 論

食管癌是一種我國常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病具有明顯的地域分布特征[10]。食管癌具有惡性程度高，發(fā)病隱匿、進(jìn)展快、預(yù)后差等特點，因此食管癌的早期診斷和治療是亟待解決的難題。近年來，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的長鏈非編碼RNA被人們發(fā)現(xiàn)。lncRNA的主要功能是在表觀遺傳修飾、核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多個層面調(diào)控基因的表達(dá)[11]，其表達(dá)異常與包括癌癥在內(nèi)的多種疾病相關(guān)。目前，在食管癌發(fā)生發(fā)展中能夠發(fā)揮重要作用的lncRNA鮮有報道，本實驗探討了在食管鱗癌中高表達(dá)的lnc671對食管鱗癌細(xì)胞惡性表型的影響。

Figure 6.Effect of lnc671 siRNAs on invasion and migration of KYSE70 cells. The scale bar =200 μm. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vssi-control group.

圖6 干擾lnc671表達(dá)后對KYSE70細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

Figure 7.Effect of lnc671 siRNAs on invasion and migration of KYSE450 cells. The scale bar =200 μm. Mean ±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vssi-control group.

圖7 干擾lnc671表達(dá)后對KYSE450細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

研究發(fā)現(xiàn)，某些lncRNA在腫瘤組織中的表達(dá)水平會發(fā)生改變，而這種變化有可能作為腫瘤診斷以及預(yù)后判斷的標(biāo)志物，例如，非小細(xì)胞肺癌患者外周血中MALAT-1的表達(dá)水平顯著高于健康人群[12]，其檢測靈敏度為56%，特異性為96%；前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，參與前列腺癌發(fā)生的 lncRNA主要代表為前列腺癌抗原3(PCA3)[13]，PCA3在前列腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，在正常前列腺以及良性前列腺增生細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，而在其他器官或腫瘤組織中不表達(dá)[14]；其診斷前列腺癌的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性顯著，可作為診斷前列腺癌新的標(biāo)志物[15]。本實驗的研究對象lnc671表達(dá)水平的高低與食管癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，而且在多種食管鱗癌細(xì)胞株中呈現(xiàn)出表達(dá)水平升高的情況，這些特征提示lnc671在指示患者預(yù)后以及作為癌癥診斷標(biāo)志物方面有著一定的潛力。

lncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，其中，同源盒基因轉(zhuǎn)錄反義RNA是首個被發(fā)現(xiàn)的反義轉(zhuǎn)錄的長鏈非編碼RNA[16]，可結(jié)合多梳蛋白抑制復(fù)合體2(Polycomb repressive complex 2，PRC2)，導(dǎo)致H3組蛋白第27位賴氨酸(H3K27)甲基化，使PRC2相關(guān)的基因重新定位，從而促進(jìn)了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[17-18]。結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(colon cancer associated transcript 1, CCAT1)是Nissan等[19]在結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，研究顯示，CCAT1的表達(dá)水平的高低與結(jié)直腸癌患者的生存長短，結(jié)直腸腫瘤大小和腫瘤浸潤深淺密切相關(guān)[20-21]，另外，CCAT1在包括胃癌[22]，肝癌[23]，肺癌[24]和乳腺癌[25]等多種惡性腫瘤中表達(dá)水平顯著升高，并且與腫瘤生長和分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。在本研究中，我們設(shè)計了siRNAs來干擾lnc671的表達(dá)。實驗證實，干擾lnc671的表達(dá)可以抑制食管鱗癌細(xì)胞KYSE70和KYSE450的增殖、侵襲和遷移能力。