鄭曉強， 芮紅兵， 張光輝

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液風(fēng)濕科， 福建 福州 350000)

霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)是一種常見的淋巴系惡性疾病，也稱為霍奇金病或淋巴肉芽腫病?；羝娼鹆馨土龅陌l(fā)病率呈現(xiàn)雙峰曲線，多見于年輕人(15～35歲)和年齡超過55歲的老年人，且男性比例多于女性[1]。雖然中國的霍奇金淋巴瘤的發(fā)病率顯著低于歐美國家，但隨著生活飲食習(xí)慣的改變，近年來發(fā)病率有增加的趨勢[2-3]。

微小RNA(microRNA，miRNAs，miR)是一類由18～25個核苷酸組成的短鏈非編碼RNA，通過與目標mRNA分子的3’端非翻譯區(qū)域(3’-untranslated region，3’-UTR)完全或非完全互補匹配、參與基因轉(zhuǎn)錄后蛋白表達水平的調(diào)控，在生物體內(nèi)發(fā)揮十分重要的作用[4]。miR-204在胃癌、結(jié)腸癌和急性白血病等多種腫瘤組織中的低表達，且與腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、化療抵抗以及不良預(yù)后等方面密切相關(guān)[5-7]。但是miR-204在霍奇金淋巴瘤中的研究尚少，因此，本研究觀察miR-204對霍奇金淋巴瘤L428細胞增殖的影響，并探討其可能的機制。

材 料 和 方 法

1 患者資料

收集2015年1月1日～2017年12月30日福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理切除的30例霍奇金淋巴瘤患者病灶淋巴瘤組織和配對癌旁淋巴組織(距離腫瘤侵潤邊緣2.5 cm)，同時收集同期穿刺活檢的30例頸部淋巴結(jié)腫大患者的淋巴組織。這些霍奇金淋巴瘤患者的年齡為25～61歲，平均年齡(42.3±8.9)歲；患者未進行過化療，均是首次確診；表現(xiàn)為頸部淋巴結(jié)腫大和縱隔淋巴結(jié)腫大；淋巴瘤分型：13例混合細胞型，15例結(jié)節(jié)硬化型，1例富于淋巴細胞型，1例淋巴細胞消減型；臨床分期(Ann Arbor 分期)：16例Ⅰ～Ⅱ期，14例Ⅲ～Ⅳ期。配對癌旁淋巴組織經(jīng)病理科檢驗為正常淋巴組織。穿刺活檢的30例頸部淋巴結(jié)腫大患者：年齡為28～57歲，平均年齡(40.6±9.3)歲，其中淋巴組織經(jīng)病理科檢驗為炎性病變的淋巴組織。本研究通過本院倫理委員會以及患者本人同意。

2 實驗試劑

胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基和Opti-MEM培養(yǎng)基購自Gibco；CCK-8細胞計數(shù)試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；BrdU細胞增殖檢測試劑盒購自北京中昊生物科技公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen；miR-204 mimic與和配對陰性對照(NC mimic)購自Ambion；Sirt1siRNA和配對陰性對照siRNA(NC siRNA)購自CST；Sirt1過表達質(zhì)粒(pcDNA3.1-Sirt1)由上海吉瑪公司構(gòu)建；野生型Sirt1螢光素酶報告載體和突變型Sirt1螢光素酶報告載體由賽業(yè)生物科技有限公司構(gòu)建；TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和TaqMan MicroRNA分析試劑盒購自Qiagen；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega；抗 Sirt1、p53、乙?；痯53(acetylated p53,ac-p53)和β-actin抗體購自Sigma。

3 實驗方法

3.1細胞培養(yǎng) L428細胞株由美國布拉斯加州醫(yī)學(xué)中心Chan教授饋贈。細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，至于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d更換含有10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基1次，1周傳代1次。待細胞再次處于對數(shù)期時，收集細胞，用于后續(xù)實驗。

3.2細胞分組 L428細胞分為對照組(control組，不進行轉(zhuǎn)染)、NC mimic轉(zhuǎn)染組、miR-204 mimic轉(zhuǎn)染組、NC siRNA轉(zhuǎn)染組、Sirt1siRNA轉(zhuǎn)染組和共轉(zhuǎn)染組(miR-204 mimic和pcDNA3.1-Sirt1共轉(zhuǎn)染)。

3.3瞬時轉(zhuǎn)染 根據(jù)廠商說明書采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑輔助細胞轉(zhuǎn)染miR-204 mimic、Sirt1siRNA和pcDNA3.1-Sirt1。轉(zhuǎn)染前 1 d用胰酶消化L428細胞，計數(shù)，按照5×107/L的密度接種于6孔板中。次日，用無血清Opti-MEM培養(yǎng)液稀釋LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑，混勻，并分別加入NC mimic、miR-204 mimic、NC siRNA和Sirt1siRNA中，再次混勻并室溫孵育20 min。將混合物分別加入細胞中，并于37 ℃，5% CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)孵育6 h后，更換含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。對于共轉(zhuǎn)染，取已轉(zhuǎn)染miR-204 mimic的細胞，再次轉(zhuǎn)入pcDNA3.1-Sirt1后，更換含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。經(jīng)過RT-qPCR和Western blot鑒定轉(zhuǎn)染效率后，已轉(zhuǎn)染的細胞用于后續(xù)實驗。

3.4CCK-8法檢測細胞活力 在96孔板中接種轉(zhuǎn)染后的L428細胞，細胞密度為每孔1×104個，將培養(yǎng)板至于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0、12、24和48 h。每個時點加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，棄去培養(yǎng)液，用酶標儀測定在450 nm波長處的吸光度(A)值。

3.5BrdU檢測細胞增殖 在96孔板中接種轉(zhuǎn)染后的L428細胞，細胞密度為每孔1×104個，將培養(yǎng)板至于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0、12、24和48 h。每個時點首先加入10 μL BrdU標記結(jié)合試劑，37 ℃孵育2 h，棄去培養(yǎng)液；其次加入100 μL FixDenat 試劑37 ℃孵育30 min，棄去 FixDenat 試劑；再次加入抗BrdU-POD試劑37 ℃孵育1 h，加入底物反應(yīng)液37 ℃孵育15 min；PBS洗滌2次，最后加入終止反應(yīng)液停止反應(yīng)。用酶標儀測定在450 nm波長處的(A)值。

3.6RT-qPCR實驗 對于組織采用 RNAiso Plus試劑按照說明書步驟提取組織的總RNA。對于細胞采用Trizol試劑按照說明書步驟提取細胞的總RNA。對于miR-204逆轉(zhuǎn)錄，取2 μg組織或細胞的總RNA按照TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；取2 μL cDNA和各4 μL正反引物序列，按照TaqMan MicroRNA分析試劑盒說明書步驟利用ABI PRISM 7500 PCR儀進行RT-qPCR反應(yīng)。對于組織Sirt1逆轉(zhuǎn)錄，取2 μg組織的總RNA按照ReverseAid 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；取2 μL cDNA和各4 μL正反引物序列，按照SuperReal PreMix分析試劑盒說明書步驟利用7500 Fast Real-time PCR儀進行RT-qPCR反應(yīng)。miR-204 的正向引物序列為5’-TTCCCTTTGTCATCCTATGTGCCT-3’， 反向引物序列為 5’-GTGCAGGGTCCGA GGT-3’； U6的正向引物序列為5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，反向引物序列為5’-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3’； Sirt1的正向引物序列為5’-TCG CAACTATACCCAGAACATAGACA-3’， 反向引物序列為5’-CTGTTGCAAAGGA ACCATGACA-3’；GAPDH的正向引物序列為5’-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3’，反向引物序列為5’-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性30 min；然后進行40個循環(huán)(95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s、74 ℃ 30 s)。以U6作為miR-204的內(nèi)參照，以GAPDH作為Sirt1的內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計算miR-204和Sirt1 mRNA的相對表達量。

3.7螢光素酶活性檢測 依據(jù)雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測螢光素酶活性。將miR-204 mimic與野生型Sirt1螢光素酶報告載體和突變型Sirt1螢光素酶報告載體采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑輔助共轉(zhuǎn)染到HEK-293T 細胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，PBS洗滌1次，每孔細胞加入100 μL裂解液，室溫振搖15 min，收集細胞裂解液。取20 μL細胞裂解液與10 μL螢光素酶檢測試劑快速混勻后，用生物發(fā)光檢測儀檢測螢光信號；讀值完畢后，每樣品再加入100 μL Stop & Glo? Reagent，快速混勻后，檢測螢光信號，保存數(shù)據(jù)。

3.8Western blot法檢測蛋白表達水平 組織經(jīng)過勻漿后和已處理的細胞分別加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，4 ℃，12 000×g離心20 min，棄沉淀，用BCA法檢測上清液中蛋白濃度。用PBS調(diào)整蛋白濃度為5 g/L，每孔加入5 μL樣品，同時加入5 μL 5×上樣緩沖液，100 ℃變性5 min后，進行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后用300 mA電流將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在5%脫脂奶粉中封閉1 h，加入I 抗Sirt1(1 ∶2 000稀釋)、p53(1 ∶5 000稀釋)、ac-p53(1 ∶1 000稀釋)和β-actin(1 ∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min；再加入對應(yīng)的II 抗(1 ∶4 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min；在暗室中浸入ECL液顯色，進行膠片曝光。以β-actin作為目的條帶的內(nèi)參照，采用Quantity One軟件分析蛋白條帶的相對表達量。目的蛋白的相對表達量=目的條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進行分析， 霍奇金淋巴瘤患者的臨床數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布，實驗數(shù)據(jù)采用中位數(shù)表示，多組間數(shù)據(jù)兩兩比較用Kruskal-WallisH檢驗。其余數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，多組間定量資料數(shù)據(jù)方差齊，兩兩比較用Bonferroni法；以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 霍奇金淋巴瘤組織中miR-204低表達，Sirt1 mRNA高表達

采用RT-qPCR法檢測了霍奇金淋巴瘤組織、配對癌旁淋巴組織和其它疾病淋巴結(jié)腫大的炎性病變的淋巴組織中miR-204表達，發(fā)現(xiàn)miR-204在霍奇金淋巴瘤組織中低表達(P<0.01)，見圖1A；同時，對上述組織中Sirt1表達進行了檢測，發(fā)現(xiàn)Sirt1 mRNA在霍奇金淋巴瘤組織中高表達(P<0.01)，見圖1B。這提示miR-204和Sirt1可能在霍奇金淋巴瘤病變中發(fā)揮作用。

2 上調(diào)miR-204表達抑制L428細胞增殖

通過轉(zhuǎn)染miR-204 mimic，上調(diào)L428細胞的miR-204表達，見圖2A。進一步分別通過CCK-8法和BrdU法檢測上調(diào)miR-204表達對L428細胞活力和BrdU摻入量的影響，結(jié)果如圖顯示，與control組或NC mimic轉(zhuǎn)染組相比，miR-204 mimic轉(zhuǎn)染組L428細胞在各時點的細胞活力降低，BrdU摻入量下降(P<0.05)；與control組相比，NC mimic轉(zhuǎn)染組L428細胞細胞活力和BrdU摻入量無顯著變化(P>0.05)，見圖2B、C。這提示上調(diào)miR-204表達抑制L428細胞增殖。

3 Sirt1是miR-204的靶基因

在線生物學(xué)軟件預(yù)測miR-204與Sirt1 3’ UTR存在相互結(jié)合位點，見圖3A。通過野生型Sirt1螢光素酶報告載體或突變型Sirt1螢光素酶報告載體與miR-204 mimic共轉(zhuǎn)染，運用雙螢光素酶報告基因活性檢測技術(shù)檢測miR-204與Sirt1的相互作用，結(jié)果顯示，與NC mimic轉(zhuǎn)染組相比，共轉(zhuǎn)染miR-204 mimic+野生型Sirt1螢光素酶報告載體組螢光素酶活性明顯下降(P<0.05)，而共轉(zhuǎn)染miR-204 mimic+突變型Sirt1螢光素酶報告載體組螢光素酶活性無顯著變化(P>0.05)，見圖3B。進一步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-204 mimic能抑制Sirt1的蛋白表達(P<0.05)，見圖3C。上述結(jié)果提示miR-204抑制靶基因Sirt1的表達。

Figure 1.The expression levels of miR-204 (A) and Sirt1 mRNA (B) in the Hodgkin lymphoma tissues, paracancerous lymphoid tissues and inflammatory lesion lymphoid tissues detected by RT-qPCR. Mean±SEM.n=30.**P<0.01vsparacancerous lymphoid tissues or inflammatory lesion lymphoid tissues.

圖1 霍奇金淋巴瘤組織、癌旁淋巴組織和炎性病變的淋巴組織中miR-204和Sirt1 mRNA的表達水平

Figure 2.Up-regulation of miR-204 inhibited the proliferation of L428 cells. After transfection with miR-204 mimic, the transfection efficiency of miR-204 mimic was detected by RT-qPCR (A), cell viability was measured by CCK-8 assay (B) and BrdU incorporation was measured by BrdU assay (C). Mean±SEM.n=4.*P<0.05vscontrol group or NC mimic group.

圖2 上調(diào)miR-204表達抑制L428細胞增殖

Figure 3.Sirt1was a target gene of miR-204. A: the putative mRNA target site in Sirt1 3′UTR; B: the relative luciferase activity of Sirt1-WT and Sirt1-MUT; C: after transfection with miR-204 mimic, the expression level of Sirt1 was detected by Western blot in the L428 cells. Mean±SEM.n=4.*P<0.05vsNC mimic group.

圖3Sirt1是miR-204的靶基因

Figure 4. Knockdown ofSirt1expression inhibited the proliferation of L428 cells. A: after transfection withSirt1siRNA, the transfection efficiency ofSirt1siRNA was detected by Western blot; B: the cell viability was measured by CCK-8 assay; C: BrdU incorporation was measured by BrdU assay. Mean±SEM.n=4.*P<0.05vscontrol group or NC siRNA group.

圖4 敲減Sirt1表達抑制L428細胞增殖

4 下調(diào)Sirt1表達抑制L428細胞增殖

通過轉(zhuǎn)染Sirt1siRNA，下調(diào)L428細胞的Sirt1表達，見圖4A。進一步分別通過CCK-8法和BrdU法檢測下調(diào)Sirt1表達對L428細胞活力和BrdU摻入量的影響，結(jié)果顯示，與control組或NC mimic轉(zhuǎn)染組相比，Sirt1siRNA轉(zhuǎn)染組L428細胞在各時點的細胞活力降低和BrdU摻入量下降(P<0.05)，見圖4B、C；與control組相比，NC siRNA轉(zhuǎn)染組L428細胞細胞活力和BrdU摻入量無顯著變化(P>0.05)。這些結(jié)果提示下調(diào)Sirt1表達抑制L428細胞增殖。

5 Sirt1過表達取消miR-204對L428細胞增殖的抑制作用

取已轉(zhuǎn)染miR-204 mimic的L428細胞，再次轉(zhuǎn)入pcDNA3.1-Sirt1，進一步分別通過CCK-8法和BrdU法檢測共轉(zhuǎn)染miR-204 mimic和pcDNA3.1-Sirt1對L428細胞活力和BrdU摻入量的影響，結(jié)果顯示，與單純miR-204 mimic轉(zhuǎn)染組相比，miR-204 mimic+pcDNA3.1-Sirt1共轉(zhuǎn)染組L428細胞的Sirt1表達顯著升高(P<0.05)，見圖5A；且在各時點的細胞活力升高，BrdU摻入量增加(P<0.05)，見圖5B、C。這提示miR-204對L428細胞增殖的抑制作用是通過抑制靶基因Sirt1表達實現(xiàn)的。

Figure 5.Sirt1 was involved in regulating the inhibitory effect of miR-204 on the proliferation of L428 cells. After the L428 cells were transfected with miR-204 mimic with/without pcDNA3.1-Sirt1, the expression level of Sirt1 was detected by Western blot (A), the cell viability was measured by CCK-8 assay (B) and BrdU incorporation was measured by BrdU assay (C). Mean±SEM.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmiR-204 mimic group.

圖5 Sirt1參與調(diào)控miR-204對L428細胞增殖的抑制作用

6 miR-204與Sirt1對乙?；痯53蛋白水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，與control組相比，轉(zhuǎn)染Sirt1siRNA或miR-204 mimic均能上調(diào)L428細胞中ac-p53的蛋白水平(P<0.05)，見圖6A；與單純miR-204 mimic轉(zhuǎn)染組相比，miR-204 mimic+pcDNA3.1-Sirt1共轉(zhuǎn)染組L428細胞中ac-p53的蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖6B。

Figure 6.The effects of miR-204 and Sirt1 on the protein levels of ac-p53 in the L428 cells. A: after transfection withSirt1siRNA, the protein level of ac-p53 in the L428 cells was determined by Western blot; B: after the L428 cells were transfected with miR-204 mimic with/without pcDNA3.1-Sirt1, the protein level of ac-p53 was determined by Western blot. Mean±SEM.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmiR-204 mimic group.

圖6 miR-204與Sirt1對L428細胞乙酰化p53表達的影響

討 論

miR-204在總多腫瘤細胞的增殖，凋亡，轉(zhuǎn)移與侵襲等生物過程中具有重要的作用，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5-7]。本研究結(jié)果顯示，霍奇金淋巴瘤組織中的miR-204的表達顯著低于癌旁淋巴組織和炎性病變淋巴組織，提示了miR-204在霍奇金淋巴瘤組織中特異性低表達。過表達miR-204導(dǎo)致L428細胞活性和BrdU摻入隨時間增加而顯著下降，提示過表達miR-204具有抑制L428細胞生長的作用。

miRNAs通過調(diào)控靶基因，參與下游的基因轉(zhuǎn)錄來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，Sirt1是miR-204的靶基因。Sirt1是一種高度保守的NAD+依賴的蛋白脫乙酰酶，與轉(zhuǎn)錄共調(diào)控因子、染色質(zhì)以及多種重要的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，通過去乙酰化作用調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)多種生物學(xué)行為[8]。且已有研究證明，Sirt1可以參與調(diào)控腫瘤細胞發(fā)生和腫瘤細胞免疫反應(yīng)[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-204可以下調(diào)Sirt1表達，而Sirt1敲低能發(fā)揮抑制L428細胞增殖的作用。p53作為Sirt1的底物之一，在與Sirt1結(jié)合以后，使其C端的賴氨酸殘基脫乙酰基，導(dǎo)致p53失活，進而阻止p53從細胞質(zhì)移位至線粒體，使得不再釋放促凋亡蛋白，達到促進細胞增殖的效果[11]。p53是重要的抑癌因子，具有調(diào)控線粒體凋亡和細胞周期的作用，并參與調(diào)控線粒體外模的滲透性[12]。乙酰化p53作為p53蛋白的一種活化形式，通過誘導(dǎo)不同位點的基因表達，導(dǎo)致細胞周期停滯或凋亡[13]。且Shu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-204可以抑制靶基因Sirt1表達，促進p53乙?；?，增強阿霉素對前列腺癌的敏感性，提示Sirt1可作用于p53，影響乙酰化p53激活，進而控制細胞的生物學(xué)效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-204表達后，L428細胞中Sirt1的蛋白表達水平顯著下降，p53的乙?；矫黠@上升；同樣，Sirt1敲低后，p53的乙酰化水平明顯上升。推測，miR-204發(fā)揮抑制L428細胞增殖的作用，是通過靶向結(jié)合Sirt1/p53信號通路。此外，共轉(zhuǎn)染miR-204 mimic 和pcDNA3.1-Sirt1能逆轉(zhuǎn)過表達miR-204的作用，重新恢復(fù)L428細胞增殖；且與單獨miR-204 mimic轉(zhuǎn)染組相比，ac-p53蛋白表達明顯降低。此結(jié)果確認了miR-204抑制L428細胞增殖是Sirt1/p53信號通路介導(dǎo)的。

綜上所述，miR-204在霍奇金淋巴瘤組織中呈特異性低表達。過表達miR-204可抑制L428細胞增殖，其機制可能與下調(diào)Sirt1表達進而激活乙?；痯53有關(guān)。