孔嬌，龍亞秋

（蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123）

蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTP）催化磷酸酪氨酸的去磷酸化，是哺乳動(dòng)物信號(hào)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵控制元件，其生物學(xué)功能的偏差會(huì)引起機(jī)體調(diào)控紊亂而導(dǎo)致癌癥、糖尿病、自身免疫性疾病等多種疾病的發(fā)生[1]。其中，含Src同源2結(jié)構(gòu)域蛋白酪氨酸磷酸酶（Src homology 2 domaincontaining protein tyrosine phosphatase，SHP2）是目前PTP家族中唯一被證實(shí)的原癌蛋白[2]，是一個(gè)理想的癌癥干預(yù)靶標(biāo)，主要表現(xiàn)在3個(gè)方面：首先，SHP2是多條激活RAS信號(hào)通路的共有節(jié)點(diǎn)，激活RAS對(duì)癌細(xì)胞的生長和存活都非常重要，幾乎所有的受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）通過激活SHP2來啟動(dòng)RAS信號(hào)通路，因此一個(gè)合適的SHP2抑制劑可以對(duì)不同的RTK基因突變“一網(wǎng)打盡”，有潛力成為廣譜抗癌藥物；其次，由于蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）與SHP2信號(hào)通路的重疊，SHP2抑制劑可以與激酶抑制劑聯(lián)用對(duì)相互連接的信號(hào)通路進(jìn)行雙重抑制，這種組合療法比單一療法更有效，既不易產(chǎn)生耐藥性，又能逆轉(zhuǎn)PTK抑制劑的獲得性耐藥性[3]；最后，SHP2還參與程序細(xì)胞死亡檢查點(diǎn)PD-1/PD-L1的信號(hào)通路，調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活性[4]。鑒于當(dāng)前抗PD-1/PD-L1腫瘤免疫療法在臨床上的成功應(yīng)用，SHP2小分子抑制劑作為PD-1/PD-L1抗體藥的重要補(bǔ)充，作為小分子腫瘤免疫治療藥物備受臨床期待[5]。SHP2的激活突變?cè)贜oonan綜合征[6]以及多種癌癥類型中被發(fā)現(xiàn)，包括白血病、肺癌、乳腺癌以及神經(jīng)母細(xì)胞瘤[7-10]。因此，SHP2是癌癥治療的潛在靶點(diǎn)，其抑制劑的開發(fā)已成為當(dāng)前抗癌新藥研究的熱點(diǎn)。

SHP2的小分子抑制劑按照作用位點(diǎn)不同可分為兩大類——催化位點(diǎn)抑制劑和變構(gòu)位點(diǎn)抑制劑。催化位點(diǎn)抑制劑是靶向磷酸酶的活性位點(diǎn)，與酪氨酸磷酸酯底物競爭，這在高度同源性的PTP家族（如SHP1、PTP1B）中缺乏選擇性，而且抑制劑必需的高電荷性官能團(tuán)也導(dǎo)致細(xì)胞透膜性差和口服生物利用度低等問題。這也使得PTP在很長一段時(shí)間成為不可成藥性靶蛋白。

最近2年，通過設(shè)計(jì)的定向高通量篩選獲得的小分子變構(gòu)抑制劑，通過與SHP2的非保守變構(gòu)位點(diǎn)結(jié)合而穩(wěn)定酶的非活性構(gòu)象從而抑制SHP2的催化功能，因而相對(duì)其他PTP家族成員具有很好的選擇性，并且具有較高活性和口服生物利用度。變構(gòu)位點(diǎn)抑制劑的發(fā)現(xiàn)將SHP2抑制劑推向了臨床應(yīng)用。

然而，變構(gòu)位點(diǎn)抑制劑的篩選和發(fā)現(xiàn)相對(duì)復(fù)雜，需要投入更多的時(shí)間和資金。本文主要綜述近年來報(bào)道的SHP2抑制劑，以期為現(xiàn)有抑制劑的臨床研發(fā)和新型SHP2抑制劑的發(fā)現(xiàn)提供參考。

1 SHP2的結(jié)構(gòu)及其參與的信號(hào)通路

SHP2是由Ptpn11基因編碼的非受體蛋白酪氨酸磷酸酶，含有2個(gè)串聯(lián)的Src同源結(jié)構(gòu)域（N-SH2/C-SH2）、催化位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域（PTP）和帶有2個(gè)磷酸化酪氨酸位點(diǎn)的C-末端尾部。1998年，Barford及其同事報(bào)道了完整的SHP2蛋白晶體結(jié)構(gòu)[11]。晶體結(jié)構(gòu)顯示，在非活性狀態(tài)下，SHP2蛋白的N-SH2結(jié)構(gòu)域與PTP結(jié)構(gòu)域結(jié)合并阻斷其底物進(jìn)入催化位點(diǎn)，從而導(dǎo)致SHP2活性受到抑制。當(dāng)SH2結(jié)構(gòu)域與特定的磷酸酪氨酸基序（motif）結(jié)合時(shí)，SHP2的自抑制狀態(tài)被破壞，處于活化開放構(gòu)象，發(fā)揮將底物去磷酸化的功能（見圖1）。

圖 1 SHP2蛋白的激活[2]Figure 1 Activation of SHP2

SHP2參與調(diào)節(jié)生物體內(nèi)多種信號(hào)通路。SHP2結(jié)合位點(diǎn)存在于RTK和骨架銜接子（如GAB、IRS、FRS等蛋白）中，因此這種“分子開關(guān)”確保SHP2僅在適當(dāng)?shù)募?xì)胞區(qū)域被激活[12]。在生長因子和細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)中，SHP2作用于RAS的上游，并使細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑完全活化[13-14]。此外，SHP2的C末端酪氨酸能夠響應(yīng)大多數(shù)激動(dòng)劑而發(fā)生磷酸化，酪氨酸磷酸化的SHP2募集接頭蛋白GRB2和鳥嘌呤核苷酸交換因子SOS，有助于RAS活化。此外，SHP2通過其N-SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合免疫檢查點(diǎn)蛋白PD-1的磷酸酪氨酸基序（pTyr motif），參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活性（見圖2）。能夠阻斷PD-1與SHP2之間蛋白-蛋白相互作用的抑制劑有望成為小分子腫瘤免疫療法，因此SHP2也成為腫瘤免疫治療中一個(gè)有潛力的藥物靶點(diǎn)[15-17]。

2 SHP2小分子抑制劑

2.1 催化位點(diǎn)抑制劑

SHP2的作用底物為酪氨酸磷酸酯，因此其催化位點(diǎn)抑制劑大多含有模擬磷酸酪氨酸的離子官能團(tuán)。這些離子官能團(tuán)作為磷酸酪氨酸模擬物可結(jié)合到SHP2的底物催化口袋，從而起到對(duì)SHP2活性的抑制作用。SHP2催化位點(diǎn)抑制劑根據(jù)其含有的離子官能團(tuán)不同，可分為含磺酸基團(tuán)和含水楊酸基團(tuán)的抑制劑；另外，天然產(chǎn)物中也發(fā)現(xiàn)了活性位點(diǎn)導(dǎo)向的SHP2抑制劑。

2.1.1 含磺酸基團(tuán)的抑制劑 化合物NSC-87877（1）是第1個(gè)被成功鑒定出能夠抑制SHP2 PTP結(jié)構(gòu)域的抑制劑 (IC50= 0.32 μmol·L-1)，由 Chen 等[18]通過對(duì)美國國家癌癥研究所建立的多元化的化合物庫篩選得到。分子模擬和定點(diǎn)突變研究表明NSC-87877與SHP2 PTP的催化裂縫結(jié)合。其對(duì)SHP2的選擇性高于其他PTP家族成員（PTP1B、HePTP、DEP1、CD45和LAR），但對(duì)同源性酶SHP1顯示出幾乎同等的抑制活性。細(xì)胞測試表明：NSC-87877抑制表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）誘導(dǎo)的RAS和ERK1/2的活化，但不阻斷EGF誘導(dǎo)的GRB2結(jié)合蛋白1 （GRB2 associated binding protein 1，GAB1）酪氨酸磷酸化或GAB1-SHP2結(jié)合。他們的研究首次提供SHP2介導(dǎo)的EGF誘導(dǎo)ERK 1/2、MAPK活化的藥理證據(jù)。

圖2 SHP2 介導(dǎo)的信號(hào)通路[12]Figure 2 SHP2-mediated signaling pathways

Hellmuth等[19]通過高通量虛擬篩選得到化合物PHPS1（2），系第1個(gè)SHP2特異性抑制劑（Ki= 0.7 μmol·L-1），其對(duì)PTP1B和SHP1分別顯示8倍和15倍的選擇性。他們使用重組SHP2的底物滴定研究表明PHPS1是SHP2的競爭性抑制劑。值得注意的是，PHPS1抑制細(xì)胞中由SHP2依賴性激活的RAS/MAPK途徑，并且PHPS1不影響PMA（Phorbol-12-myristate-13-acetate）或致癌RAS誘導(dǎo)的非依賴性SHP2的ERK1/2活化。PHPS1還有效阻斷人腫瘤細(xì)胞的增殖和不依賴錨定的生長（anchorage-independent growth），并且對(duì)正常上皮細(xì)胞無細(xì)胞毒性。

張仲寅課題組[20]從現(xiàn)有且具有良好藥動(dòng)學(xué)特征和可耐受副作用的化合物庫中篩選出第3代β-內(nèi)酰胺類抗生素頭孢磺啶（3），作為可逆的競爭性SHP2 抑制劑 [IC50=（16.8 ± 2.0）μmol·L-1]，其對(duì)SHP1和PTP1B顯示2倍和11倍的選擇性。X射線晶體學(xué)研究和結(jié)構(gòu)分析確定頭孢磺啶中的磺苯基乙酰胺為磷酸酪氨酸模擬物，在此基礎(chǔ)上，該課題組采用結(jié)構(gòu)導(dǎo)向和基于片段的方法發(fā)現(xiàn)了幾種含有磺苯基乙酰胺官能團(tuán)的SHP2抑制劑，IC50均在低微摩爾范圍內(nèi)，且對(duì)SHP1的選擇性提高了5倍。其中化合物4可以特異性地抑制SHP2介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，并且抑制MDA-MB-231和ErbB2陽性的乳腺癌SKBR3細(xì)胞以及肺癌H1975細(xì)胞的生長。

2.1.2 含水楊酸基團(tuán)的抑制劑 張仲寅課題組[21]利用計(jì)算機(jī)虛擬篩選發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物水楊酸可以作為磷酸酪氨酸模擬物。他們運(yùn)用點(diǎn)擊化學(xué)（click chemistry）的方法構(gòu)建了一類含吲哚水楊酸結(jié)構(gòu)單元的化合物庫，經(jīng)過一系列構(gòu)效關(guān)系研究，最終發(fā)現(xiàn)化合物5是有效的SHP2可逆非競爭性抑制劑。其具有較好的細(xì)胞活性[IC50=（5.5 ± 0.4）μmol·L-1]，能夠阻斷HEK293細(xì)胞中由生長因子刺激的ERK1/2激活，抑制由粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）刺激的SHP2功能獲得性突變誘導(dǎo)的造血細(xì)胞過度增殖?；衔?與催化結(jié)構(gòu)域SHP2的X射線晶體結(jié)構(gòu)分析顯示水楊酸基團(tuán)占據(jù)PTP活性位點(diǎn)，聯(lián)苯基團(tuán)與PTP之間非保守區(qū)域發(fā)生疏水相互作用（見圖3），但該化合物對(duì)SHP1和PTP1B僅有3倍的選擇性。

圖3 化合物5與SHP2蛋白晶體結(jié)構(gòu)[21]Figure 3 Crystal structure of compound 5 and SHP2 protein

為了發(fā)現(xiàn)具有選擇性的SHP2抑制劑，張仲寅課題組[22]采用結(jié)構(gòu)導(dǎo)向的方法，以羥基吲哚羧酸作為SHP2活性位點(diǎn)的靶點(diǎn)，并依據(jù)基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)策略，引入額外的官能團(tuán)，旨在與靠近催化口袋的周邊位點(diǎn)相互作用，以提高SHP2的結(jié)合親和力和選擇性。在化合物5的基礎(chǔ)上，經(jīng)過一系列結(jié)構(gòu)優(yōu)化，他們發(fā)現(xiàn)化合物6對(duì)SHP2的選擇性是其同源物SHP1和PTP1B的7倍和11倍，結(jié)構(gòu)分析和分子模擬揭示羥基吲哚羧酸結(jié)合在SHP2活性位點(diǎn)，而草酰胺連接子和苯基噻吩基團(tuán)與β5-β6環(huán)中的殘基發(fā)生相互作用，這使得化合物6對(duì)SHP2有較好的活性[IC50=（0.2 ± 0.02）μmol·L-1]和選擇性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，化合物6可特異性地阻斷細(xì)胞內(nèi)的SHP2依賴性信號(hào)傳導(dǎo)。此外，其還減弱生長因子介導(dǎo)的ERK1/2和蛋白激酶B（protein kinase B，PKB或AKT）活化，并在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H1975、ErbB2陽性的乳腺癌細(xì)胞系SKBR3和致癌基因KITD814V表達(dá)的32D骨髓細(xì)胞中表現(xiàn)出優(yōu)異的抗增殖活性。

2.1.3 源于天然產(chǎn)物的抑制劑 Liu等[23]通過計(jì)算機(jī)虛擬篩選與實(shí)驗(yàn)測定，從天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫中篩選出的隱丹參酮（7）可結(jié)合SHP2催化位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域（IC50=22.5 μmol·L-1），對(duì) SHP1 選擇性約為 1.76 倍。而且，化合物7對(duì)SHP2 E76K突變蛋白也有相同程度的抑制（IC50=23.90 μmol·L-1），而對(duì)野生型全長的 SHP2 蛋白活性較弱（IC50=45.18 μmol·L-1）。酶促動(dòng)力學(xué)分析表明，化合物7是一種混合型和不可逆的SHP2抑制劑。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，化合物7通過抑制SHP2催化活性而使RAS-EAK、PI3K-AKT和JAK2-STAT5信號(hào)通路下調(diào)。此外，SHP2中具有活化突變E76K的小鼠骨髓祖細(xì)胞和患者白血病細(xì)胞對(duì)該抑制劑敏感。不過目前尚未培養(yǎng)出該抑制劑與SHP2蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。

2.2 變構(gòu)位點(diǎn)抑制劑

SHP2催化位點(diǎn)抑制劑經(jīng)過十幾年的發(fā)展，仍然沒有達(dá)到理想的體內(nèi)療效。雖然活性最好的催化位點(diǎn)抑制劑化合物6在黑色素瘤模型中顯示出良好的前景[24]，但是最近的研究已經(jīng)質(zhì)疑這種催化位點(diǎn)抑制劑在細(xì)胞環(huán)境中的特異性[25]。于是，科學(xué)家們將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向SHP2的變構(gòu)模式，由此開啟了SHP2抑制劑研究的新階段。2016年，諾華研究團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道了作用于SHP2的3個(gè)結(jié)構(gòu)域界面的變構(gòu)位點(diǎn)抑制劑，截至2019年4月份，已有10余種結(jié)構(gòu)類型的有效SHP2變構(gòu)位點(diǎn)抑制劑被報(bào)道，其中多數(shù)為諾華公司的研究成果。以下將按研究團(tuán)隊(duì)分類對(duì)SHP2變構(gòu)位點(diǎn)抑制劑進(jìn)行介紹。

2.2.1 諾華團(tuán)隊(duì)報(bào)道的抑制劑 SHP099（8）是由諾華公司報(bào)道的首個(gè)作用于SHP2變構(gòu)位點(diǎn)的抑制劑[26-27]。該團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了新穎的藥物篩選方法：以 DIFMUP（6，8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate）為底物[28]，雙磷酸化酪氨酸IRS-1肽激活SHP2，從10萬個(gè)化合物中篩選出可以抑制全長SHP2蛋白（氨基酸殘基1-525）的抑制劑，從中去除作用在PTP區(qū)域（氨基酸殘基237-529）的抑制劑，得到化合物SHP836（9），其對(duì)于全長SHP2蛋白的IC50為12 μmol·L-1，并且針對(duì)PTP結(jié)構(gòu)域的IC50大于 100 μmol·L-1。通過 X 射線晶體學(xué)發(fā)現(xiàn)，SHP836不與PTP催化位點(diǎn)結(jié)合，而是與C-SH2、N-SH2和PTP結(jié)構(gòu)域之間形成的隧道樣口袋結(jié)合，穩(wěn)定了SHP2的自抑制構(gòu)象。采用基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)對(duì)SHP836進(jìn)行優(yōu)化和變形，最終發(fā)現(xiàn)了以氨基吡嗪為母核的化合物SHP099是一種高效、可口服的小分子 SHP2 抑制劑（IC50= 0.071 μmol·L-1），但對(duì)其他PTP家族（包括SHP1）和激酶沒有顯著活性。根據(jù) SHP099與SHP2蛋白的晶體復(fù)合物，SHP099同時(shí)結(jié)合N-SH2、C-SH2和PTP結(jié)構(gòu)域的界面，與3個(gè)結(jié)構(gòu)域中的關(guān)鍵氨基酸殘基（Arg111、Phe113和Glu250）產(chǎn)生氫鍵相互作用，從而通過變構(gòu)機(jī)制抑制SHP2活性（見圖4）。相應(yīng)地，變構(gòu)口袋的雙突變體（SHP2T253M/Q257L）會(huì)破壞SHP099與SHP2蛋白的結(jié)合。SHP099在體外抑制RAS/ERK信號(hào)傳導(dǎo)以抑制RTK驅(qū)動(dòng)的人癌細(xì)胞的增殖。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，通過經(jīng)口給藥方式，SHP099在小鼠異種移植模型中表現(xiàn)出劑量依賴性抗腫瘤活性，且無明顯毒副作用。

圖4 SHP099作用于SHP2蛋白的關(guān)鍵殘基[26]Figure 4 Key residues involved in the interaction of SHP099 with SHP2 protein

隨后，諾華研究團(tuán)隊(duì)使用Maestro中的SiteMap分析SHP2蛋白中可配位的口袋，并揭示了3個(gè)潛在的小分子變構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)（見圖5）[29]，分別為：1）先前報(bào)道的SHP099的變構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)，即“隧道”結(jié)合位點(diǎn)；2）離“隧道”約20 ?（1 ?=10-10m）的“門閂”結(jié)合位點(diǎn)；3）蛋白質(zhì)另一面的“凹槽”結(jié)合位點(diǎn)。考慮到多個(gè)變構(gòu)口袋存在的可能，他們使用突變型SHP2蛋白（SHP2T253M/Q257L）構(gòu)建了新的抑制劑篩選模式，同樣以DIFMUP為底物，雙磷酸化酪氨酸IRS-1肽激活SHP2，篩選了約150萬個(gè)化合物。用近全長的SHP2蛋白（SHP21-525）鑒定具有抑制模式的化合物，再利用SHP2PTP區(qū)域去除活性位點(diǎn)抑制劑。為了除去與SHP099作用在同一變構(gòu)位點(diǎn)的抑制劑，他們選擇了對(duì)SHP2T253M/Q257L仍具有抑制活性的化合物，并使用X射線晶體學(xué)來確定結(jié)合模式以及采用差示掃描熒光法（differential scanning fluorimetry，DSF）來研究熱穩(wěn)定性，最終發(fā)現(xiàn)了一系列具有未知抑制模式的化合物，其中包括以三唑并喹唑啉酮為母核的化合物SHP244（10）。SHP244對(duì)SHP2有微弱抑制活性（SHP21-525：IC50=60 μmol·L-1，SHP2PTP：IC50＞ 100 μmol·L-1），X 射線晶體學(xué)顯示 SHP244 與之前預(yù)測的位于N-SH2和PTP結(jié)構(gòu)域之間的“門閂”結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。他們基于結(jié)構(gòu)的衍生化設(shè)計(jì)合成了化合物 SHP844（11，SHP21-525：IC50=18.9 μmol·L-1，SHP2PTP：IC50＞ 100 μmol·L-1）和化合物 SHP504（12，SHP21-525：IC50= 21 μmol·L-1，SHP2PTP：IC50＞ 100 μmol·L-1）用于對(duì)SHP2的生物學(xué)評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)化合物在KYSE-520癌細(xì)胞中觀察到MAPK信號(hào)通路下游標(biāo)記物DUSP6 mRNA的下調(diào)。

圖5 SHP2自抑制構(gòu)象的變構(gòu)口袋預(yù)測[29]Figure 5 Allosteric pocket prediction of SHP2 self-suppressed conformation

最近，諾華研究團(tuán)隊(duì)連發(fā)2篇文章報(bào)道了新型結(jié)構(gòu)的SHP2變構(gòu)抑制劑[30-31]。他們將SHP099結(jié)構(gòu)中的藥效基團(tuán)與經(jīng)過高通量篩選得到的化合物相融合，成功發(fā)現(xiàn)了以吡唑并嘧啶酮為母核的化合物13，X射線晶體學(xué)顯示該化合物與SHP099一樣，均結(jié)合在SHP2的“隧道”位點(diǎn)。通過對(duì)化合物13進(jìn)行胺取代基的延伸和構(gòu)象限制得到化合物14，與化合物13相比，化合物14顯著增強(qiáng)了由SHP2介導(dǎo)的ERK激酶磷酸化的抑制作用及在KYSE520細(xì)胞系的抗增殖作用。為了改善化合物對(duì)hERG的選擇性，他們又對(duì)側(cè)鏈氯代芳烴進(jìn)行優(yōu)化，得到化合物SHP389（15），既保留了較好的生物活性，又改善了hERG的選擇性，但其口服生物利用度低（約2%），無法在小鼠腫瘤異種移植模型中作進(jìn)一步的藥理學(xué)評(píng)價(jià)。為了獲得更理想的SHP2變構(gòu)抑制劑，諾華研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合化合物13、16以及SHP099的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)一步進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系研究，他們將融合的雙環(huán)系統(tǒng)變成單環(huán)嘧啶酮母核，最終發(fā)現(xiàn)SHP394（17）是有效的SHP2抑制劑。當(dāng)對(duì)皮下植入Detroit-562腫瘤細(xì)胞的免疫受損小鼠經(jīng)口給予SHP394時(shí)，其顯示出劑量依賴性抗腫瘤能力。通過對(duì)芳基硫醚和螺環(huán)胺部分構(gòu)效關(guān)系研究合成了一系列具有與SHP394相似的抗增殖效力的化合物。其中，化合物18對(duì)SHP2的活性有所改善，化合物19則改善了口服吸收和hERG選擇性。

2.2.2 其他研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道的抑制劑 Revolution Medicines公司一直致力于開發(fā)靶向SHP2的變構(gòu)抑制劑，其中，RMC-4630就是該公司研發(fā)的口服有效的 SHP2小分子變構(gòu)抑制劑，目前已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。RMC-4630的結(jié)構(gòu)尚未公布，但其同系化合物RMC-4550（20，IC50= 0.583 nmol·L-1）的藥效和作用機(jī)制被充分研究并報(bào)道。SHP2抑制劑RMC-4550對(duì)具有RAS-GTP依賴的致癌性BRAF（如第3類BRAF突變體）、NF1缺失或核苷酸循環(huán)致癌RAS（如KRASG12C）的人類癌癥模型有效[14]。RMC-4550通過破壞SOS1介導(dǎo)的RAS-GTP來降低致癌RAS/RAF/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)和癌癥生長。研究結(jié)果闡明了SHP2在RAS-GTP依賴性致癌BRAF、NF1缺失和核苷酸循環(huán)致癌KRAS的癌癥中促進(jìn)RAS/MAPK途徑激活的關(guān)鍵功能。對(duì)于攜帶這些致癌驅(qū)動(dòng)因子的癌癥患者，抑制SHP2是一種有前景的分子治療策略。

目前，針對(duì)野生型SHP2蛋白的變構(gòu)抑制劑已經(jīng)取得很大進(jìn)展，但對(duì)于一些致癌性SHP2突變蛋白（如SHP2E76K、SHP2G60V、SHP2S502P等），變構(gòu)抑制劑效果并不理想[32]。Xie等[33]開發(fā)了靶向SHP2E76A蛋白的變構(gòu)抑制劑。他們從約2萬個(gè)化合物中篩選出針對(duì)SHP2E76A蛋白有抑制作用的化合物，再從中除去作用在SHP2PTP區(qū)域的化合物，發(fā)現(xiàn)化合物21對(duì)SHP2E76A的 IC50為 19.1 μmol·L-1，但對(duì) SHP2PTP沒有影響。他們推測脂肪胺基團(tuán)可能存在氫鍵相互作用，通過用疏水性增強(qiáng)的聯(lián)苯或萘基團(tuán)替代苯環(huán)，同時(shí)保持脂肪胺基團(tuán)，得到活性提高的抑制劑 22～24，IC50分別為 3.27、5.3 和 2.55 μmol·L-1。化合物 22 與SHP2E76A蛋白的晶體復(fù)合物揭示與化合物SHP099一樣，該化合物與SHP2E76A結(jié)合在相同的變構(gòu)口袋，但存在不同的作用方式。接著，他們對(duì)化合物22進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系研究以提高生物活性，發(fā)現(xiàn)將哌啶環(huán)上的氨基裸露出來，以及在萘環(huán)中引入吸電子取代基可提高化合物活性，最終得到化合物25，其對(duì)SHP2E76A的 IC50為 0.7 μmol·L-1，可有效抑制癌細(xì)胞中的ERK1/2和AKT活化。重要的是，化合物25抑制Yes相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）依賴的熒光素酶報(bào)告基因和YAP癌基因的表達(dá)，表明YAP活性受SHP2PTP催化功能調(diào)控。化合物25抑制多種癌細(xì)胞系的增殖并抑制肺癌細(xì)胞H1975的集落形成，其在MV4-11異種移植模型中表現(xiàn)出良好的藥動(dòng)學(xué)特性和抗腫瘤活性。

Wu等[34]利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)庫篩選與細(xì)胞檢測相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)了新型SHP2抑制劑（26），計(jì)算機(jī)模擬顯示化合物26的結(jié)構(gòu)很好地補(bǔ)充了對(duì)接模擬中SHP2 C-SH2與PTP結(jié)構(gòu)域之間的結(jié)合口袋（見圖6），分子動(dòng)力學(xué)模擬表明SHP2蛋白的運(yùn)動(dòng)在與化合物26結(jié)合時(shí)受到抑制，進(jìn)一步支持其穩(wěn)定了SHP2的自身抑制構(gòu)象。值得注意的是，化合物26對(duì)攜帶活化突變SHP2E76K的小鼠和人白血病細(xì)胞抑制效果顯著，但對(duì)SHP2E76K和SHP2WT蛋白的活性無顯著差異。遺憾的是，研究者沒有解析出該化合物與SHP2蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。

圖 6 化合物 26 與SHP2的模擬對(duì)接圖[34]Figure 6 Binding mode of compound 26 with SHP2 by autodocking

Brennan 等[35]認(rèn)為盡管穩(wěn)定SHP2自身抑制的小分子化合物（如SHP099）對(duì)于靶向涉及SHP2的癌癥具有巨大前景，但是這些化合物對(duì)于癌癥相關(guān)的SHP2活化突變體的抑制活性大為減弱，因?yàn)镾HP2蛋白突變本身會(huì)破壞其自身抑制構(gòu)象。但是，直接作用在SHP2的PTP結(jié)構(gòu)域上的變構(gòu)位點(diǎn)抑制PTP活性的化合物將提供變構(gòu)SHP2靶向的替代模式。該課題組先前已經(jīng)證明SHP2催化結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)隱藏的變構(gòu)抑制位點(diǎn)，并且該位點(diǎn)在大多數(shù)其他PTP家族成員中不存在。這一發(fā)現(xiàn)源于意外觀察到SHP2被雙砷化合物 FlAsH（27）所抑制，進(jìn)一步研究顯示SHP2中隱藏的變構(gòu)位點(diǎn)對(duì)FlAsH敏感性取決于位于活性位點(diǎn)之外的非保守半胱氨酸殘基（Cys333）的存在。但 FlAsH會(huì)非特異性地與大量富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)結(jié)合，不能作為開發(fā)SHP2催化結(jié)構(gòu)域變構(gòu)抑制劑的先導(dǎo)化合物。因此，該課題組轉(zhuǎn)而開發(fā)靶向Cys333的特異性共價(jià)抑制劑。他們合成了先前報(bào)道過的、可以與蛋白激酶共價(jià)結(jié)合的帶有氰基丙烯酰胺基團(tuán)的化合物庫，從中篩選可以抑制野生型SHP2 PTP結(jié)構(gòu)域，而對(duì)突變型（Cys333Pro）SHP2 PTP結(jié)構(gòu)域無抑制活性的化合物，以期能夠找到特異性作用在該變構(gòu)口袋的抑制劑。通過篩選，他們發(fā)現(xiàn)化合物28對(duì)野生型SHP2的抑制活性明顯高于SHP2C333P，簡單的構(gòu)效關(guān)系研究發(fā)現(xiàn)化合物28的喹啉環(huán)是必需的，將氰基丙烯酰胺替換成丙烯酰胺得到化合物29，其對(duì)野生型 SHP2 PTP 結(jié)構(gòu)域的 IC50為 35 μmol·L-1，并且化合物29保留了化合物28對(duì)SHP2C333P的特異性，即使在測定的最高化合物濃度下（150 μmol·L-1），對(duì)SHP2C333P都沒有顯著抑制作用。LC-MS/MS分析顯示，20%的化合物29會(huì)共價(jià)不可逆地作用于Cys333，不會(huì)與SHP2中保守的半胱氨酸殘基（Cys459、Cys367）結(jié)合。除Cys333之外，化合物29還作用在蛋白表面或環(huán)上的其他非保守半胱氨酸殘基（Cys259、Cys318和Cys486），但這些作用可能對(duì)SHP2活性沒有顯著影響。總之，化合物29與SHP2中非保守半胱氨酸殘基Cys333作用的能力證明了用共價(jià)抑制劑靶向SHP2變構(gòu)位點(diǎn)的原理，為開發(fā)高效、特異性的SHP2變構(gòu)位點(diǎn)共價(jià)抑制劑提供了基礎(chǔ)。

3 總結(jié)與展望

SHP2作為致癌酪氨酸磷酸酶受到研究者的廣泛關(guān)注。最初，研究者關(guān)注靶向SHP2 PTP催化區(qū)域的抑制劑，但由于PTP區(qū)域高度保守，以及極性和帶正電的環(huán)境，導(dǎo)致活性位點(diǎn)抑制劑缺乏選擇性，且細(xì)胞透膜性和口服生物利用度差，所以SHP2抑制劑一直沒能推進(jìn)到臨床。自2016年由諾華公司報(bào)道第1個(gè)變構(gòu)位點(diǎn)抑制劑以來，已有至少2個(gè)小分子抑制劑進(jìn)入臨床研究，包括由諾華公司開發(fā)的TNO155和由Revolution Medicines/Sanofi 開發(fā)的RMC-4630，目前都處于Ⅰ期臨床階段，用于治療實(shí)體瘤，但結(jié)構(gòu)尚未披露。

由于SHP2的激活突變?cè)诙喾N疾病中被發(fā)現(xiàn)，但尚未開發(fā)出更有效的抑制SHP2活化突變體的抑制劑。靶向不同變構(gòu)位點(diǎn)的抑制劑的組合可能是抑制SHP2致癌突變體的一種策略。另外，由于蛋白激酶與SHP2信號(hào)通路的重疊，SHP2抑制劑可以與激酶（MEK和ALK）抑制劑聯(lián)用對(duì)相互連接的信號(hào)通路進(jìn)行雙重抑制[4,36]，這種組合療法比單一療法更有效，并且不易產(chǎn)生耐藥性。因此，開發(fā)出高效、高選擇性的SHP2抑制劑以及SHP2抑制劑與激酶抑制劑聯(lián)用將成為SHP2抑制劑研究的主要方向。